王琳，陳九偉，呂秀萍

1.淄博市婦幼保健院婦科，山東淄博 255000；2.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦科，山東濰坊 261000

子宮頸癌位居全球女性常見癌癥的第4位，在發(fā)展中國家目前仍是女性癌癥死亡的主要原因[1]，子宮頸癌最常見的病理類型是鱗狀細胞癌，其癌前病變子宮頸鱗狀上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia,CIN)對應(yīng)的組織病理學(xué)分為1～3級，CIN1大多可自然消退CIN2/3發(fā)展為子宮頸癌的風(fēng)險較高，所以及時發(fā)現(xiàn)并積極治療CIN2/3是預(yù)防子宮頸癌的重要措施。受多種因素影響CIN的分級診斷一致性差，目前P16與Ki67作為重要標(biāo)記物被廣泛應(yīng)用于CIN的病理分級診斷。CLDN1是細胞緊密連接家族蛋白成員之一，有研究通過免疫組化實驗發(fā)現(xiàn)，CLDN1在正常宮頸組織、CIN、子宮頸浸潤癌中的表達逐漸增加，因此認為CLDN1對宮頸鱗狀上皮細胞的癌變具有促進作用[2]。本研究選取淄博市婦幼保健院在2016年1月—2017年12月62例CIN1～3級標(biāo)本，通過免疫組化染色技術(shù)監(jiān)測CLDN1、P16、Ki67在不同級別CIN中的表達狀態(tài)，探討3種生物標(biāo)記物與病變級別的關(guān)系，一方面進一步驗證P16、Ki67在CIN病理分級診斷中的價值和作用，另一方面觀察CLDN1是否可以作為一種新的標(biāo)記物，應(yīng)用在CIN分級診斷中，提高CIN診斷的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取經(jīng)病理診斷為CIN的宮頸組織石蠟包埋標(biāo)本62例，患者年齡22～64歲，平均（44.50±10.13）歲。所選患者的組織學(xué)切片全部由高年資的病理醫(yī)師復(fù)查確認，包括CIN1級22例，CIN2級18例，CIN3級22例，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2003版WHO子宮頸腫瘤組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)。本研究已獲本院倫理委員會同意，所有患者均知情并自愿參加。

1.2 方法

免疫組化采用SP法，操作按試劑說明書進行（主要試劑及試劑盒均購自北京西雅金橋生物技術(shù)有限公司）。該實驗用PBS替代一抗作為陰性對照，用已知的CIN陽性切片作為陽性對照。

1.3 結(jié)果評定標(biāo)準(zhǔn)

陽性染色定位：P16定位于細胞核或胞核加胞質(zhì)，Ki67定位于細胞核，CLDN1定位于細胞膜和細胞質(zhì)中。染色結(jié)果判讀是采用強度和分布的半定量報告，其中染色強度分為：淡黃色（弱陽+），黃色（陽性++），棕黃色（強陽+++）。分布則根據(jù)陽性細胞實際所占比例計算其百分數(shù)：在高倍鏡下隨機選取10個不重復(fù)的視野，每個視野內(nèi)計數(shù)10個細胞，計算平均值作為陽性細胞的百分數(shù)。P16陽性細胞數(shù)＜5%為陰性（-），5%～25%為（弱陽+），26%～75%為（陽性++），＞75%為（強陽+++），P16僅有胞質(zhì)著色及僅有小簇細胞著色均判為陰性。Ki67陽性表達局限于上皮的基底或基底旁層為陰性（-），超過基底層的10%～25%為（弱陽+），26%～75%為（陽性++），＞75%為（強陽+++）。CLDN1無明顯陽性細胞為陰性（-），陽性細胞數(shù)目＜25%為（弱陽+），陽性細胞數(shù)目25%～50%為（陽性++），陽性細胞數(shù)目＞50%為（強陽+++）。

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，CIN 1～CIN3級中的陽性表達率組間差異采用χ2檢驗分析；P16、Ki67及CLDN1的陽性表達率與CIN級別的相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)（秩相關(guān)）分析；P16、Ki67及CLDN1～3者之間兩兩比較采用四格表資料的χ2檢驗分析。計數(shù)資料以[n(%)]表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P16、Ki67和CLDN1在不同級別CIN中的表達比較

P16在CIN1～3級中的陽性率逐漸升高，分別為45.5%、61.1%、100.0%，且在HSIL（CIN2級、CIN3級）中陽性及強陽性所占的百分比明顯大于LSIL（CIN1級），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=16.209，P＜0.001）。見圖1和表1。

圖1 P16免疫組化表達

Ki67在CIN1～3級中的陽性率也逐漸升高，分別為50.0%、55.6%、100.0%，同樣在HSIL（CIN2～CIN3級）中陽性及強陽性所占的百分比明顯大于LSIL（CIN1級），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=15.211，P＜0.001）。見圖2和表1。

圖2 Ki67免疫組化表達

CLDN1在CIN1～3級中的陽性率分別為68.2%、11.1%、36.4%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=13.622，P＜0.001），但實驗結(jié)果顯示CLDN1的陽性表達并不隨病變級別的增加而增加，相反CIN1級中CLDN1的陽性率最高，CIN2級中的陽性率最低，CIN3級居中，無規(guī)律性可循。見圖3和表1。

圖3 CLDNI免疫組化表達

2.2 P16、Ki67和CLDN1的陽性表達率與CIN級別的相關(guān)性

經(jīng)Spearman等級相關(guān)（秩相關(guān)）分析，P16、Ki67二者的陽性表達與宮頸病變級別呈正相關(guān)（r1=0.658，r2=0.604，P＜0.001）；CLDN1的陽性表達與宮頸病變級別無明顯相關(guān)（r=-0.340）。見表1。

表1 P16、Ki67、CLDN1在宮頸CIN1～CIN3中的表達

2.3 P16、Ki67和CLDN1 3者之間的關(guān)聯(lián)性研究

經(jīng)χ2檢驗，P16與Ki67的陽性表達具有相關(guān)性（χ2=21.514，P＜0.001，r=0.589），見 表2；P16與CLDN1的陽性表達沒有相關(guān)性（χ2=0.565，P＞0.05，r=-0.095），見表2；Ki67與CLDN1的陽性表達也沒有相關(guān)性（χ2=0.870，P＞0.05，r=0.118），見表2。

表2 P16、Ki67、CLDN1的關(guān)聯(lián)性研究

3 討論

子宮頸癌前病變的管理取決于確認CIN分級，但病理醫(yī)師受切片質(zhì)量、自身觀念、資歷等多種因素影響，可能對CIN作出不同判斷。2012年起國際上采用LSIL（CIN1）和HSIL（CIN2、CIN3）對子宮頸癌前病變進行診斷，CIN2中可能包含部分CIN1及部分CIN3，若籠統(tǒng)地將CIN2都歸入高級別宮頸上皮內(nèi)病變，可能會導(dǎo)致其范圍的擴大。系統(tǒng)回顧CIN2給予保守治療后[3]，50%逆轉(zhuǎn)，32%持續(xù)，18%進展，30歲以下消退率較高（60%）。臨床處理時，宮頸錐切術(shù)也會帶來如宮頸粘連、宮頸管縮短、宮頸組織增生等潛在的危害和風(fēng)險。此外隨著腫瘤的年輕化，保留生育功能成為熱點，有文獻報道，因高級別病變行宮頸錐切術(shù)后再妊娠，發(fā)生早產(chǎn)、胎膜早破的危險會升高，早產(chǎn)導(dǎo)致的低出生體重兒的發(fā)生率也上升，對于未完成生育的年輕女性，在病理診斷中區(qū)分CIN2和CIN3，評估CIN病變進展風(fēng)險有一定的臨床意義[4]。鑒于此，ASCCP共識指南（2019版）建議，因為CIN2、CIN3的進展風(fēng)險及治療方式不全相同，所以宮頸病變病理學(xué)報告應(yīng)采用HSIL（CIN2）、HSIL（CIN3）這樣的方式報告，在病理診斷中加入CIN2或CIN3這種限定性詞語[5]，對于某些情況下的CIN2，可以接受保守治療。分子標(biāo)記物有助于可疑病例的協(xié)診以及復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的高風(fēng)險預(yù)測，因此需要使用一些標(biāo)記物作為CIN輔助診斷的量化指標(biāo)，以便于準(zhǔn)確評估病變，避免過度治療[6]。

P16是一種細胞周期蛋白依賴性激酶抑制物，Ki67是一種細胞增殖活性相關(guān)抗體，反映細胞增殖活性。Giorgi Rossi[7]的包括40 509例研究對象的橫斷面研究顯示，p16/Ki67具有很好的分流潛能及對CIN2患者HPV清除的預(yù)測能力。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，P16陽性表達率為：CIN1組為45.5%，CIN2組61.1%，CIN3組100.0%；Ki67陽 性 表 達 率 為：CIN1組 為50.0%，CIN2組55.6%，CIN3組100.0%；P16、Ki67的陽性表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），且與CIN的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)(r1=0.658，r2=0.604)。張濱惠等[8]研究指出P16在CIN1組的陽性表達率是3.6%，CIN2、CIN3均是100%；Ki67在CIN1組的陽性表達率是67.9%，CIN2、CIN3也均是100.0%，P16、Ki67的陽性表達與宮頸病變嚴(yán)重程度呈正相關(guān)（r=0.873、0.793，P＜0.05），與本研究結(jié)論相符。姜洪翠等[9]研究也指出，CIN2、CIN3的P16陽性表達率和Ki67陽性表達率均高于CIN1，P16及Ki-67的表達情況與宮頸病變嚴(yán)重程度存在密切關(guān)系。李琪雁等[10]研究則采用二分類法，在LSIL與HSIL中，P16的陽性表達率分別為63.89%、86.84%，Ki67的陽性表達率分別為55.56%、94.4%，隨病變加重陽性率逐漸升高。Lewitowicz P等[11]同樣認為在LSIL與HSIL兩組比 較中，P16、Ki67的陽性表達隨病變加重而逐漸升高，提示P16和Ki67可能促進宮頸癌的發(fā)生，在LSIL與HSIL的鑒別診斷上具有一定的應(yīng)用價值。張濱惠等[8]研究還發(fā)現(xiàn)CIN病變級別越高，P16、Ki67陽性強度越高，提示P16、Ki67陽性表達情況可以反映CIN病變程度。本研究結(jié)果顯示，P16、Ki67在CIN2、CIN3中陽性及強陽性所占的百分比明顯大于CIN1，與上述文獻報道相符。因此，P16、Ki67可以作為高級別CIN的鑒別指標(biāo)，為CIN的分級診斷、個體化治療提供準(zhǔn)確、客觀的依據(jù)。

在正常生理情況下，不會出現(xiàn)P16和Ki67的同時表達，二者同時表達則提示細胞周期存在增殖失調(diào)，并預(yù)測存在宮頸高級別病變[12]。有研究報道，P16聯(lián)合Ki67診斷CIN1、CIN2、CIN3時，均具有很高的一致性，可以通過P16聯(lián)合Ki67表達情況，輔助CIN級別嚴(yán)重程度判斷[8,13]。李琪雁等[10]研究認為，P16和Ki67陽性表達呈正相關(guān)（r=0.599，P＜0.001）。本研究中P16和Ki67的陽性表達具有明顯相關(guān)性（r=0.589，P＜0.001），與上述報道相符，說明二者具有較高的診斷一致性，因此在病理診斷中聯(lián)合檢測P16、Ki67的免疫組化染色，可以提高宮頸高級別病變診斷的特異度和靈敏度，對CIN診斷具有重要意義。

Claudins是細胞內(nèi)緊密連接的主要封閉蛋白，Claudins蛋白的異常表達可引起疾病的發(fā)生，甚至產(chǎn)生腫瘤[14]。SzabóI等[15]總結(jié)了近年來一些關(guān)于Claudins與婦科惡性腫瘤的研究，結(jié)論顯示在婦科惡性腫瘤中Claudins大多數(shù)是上調(diào)表達的。CLDN1是緊密連接20余個家族成員之一，有研究證明CLDN1在子宮頸癌中高表達，其在宮頸腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[16]，但CLDN1在CIN中的表達研究較少。本研究中CLDN1在各級CIN中的表達雖然有差異，但與病變級別不相關(guān)（r=-0.340），不支持將CLDN1作為一種標(biāo)記物用于CIN的病理分級診斷。此外，Szekerczés Tímea等[17]認為使用p16/Ki67和CLDN1/Ki67雙重免疫反應(yīng)在宮頸癌篩查中的敏感性和特異性是相似的，本研究內(nèi)容雖不相同，但CLDN1與P16和Ki67的陽性表達均不具有相關(guān)性（r=-0.095、0.118，P＞0.05），無法證明在腫瘤評估方面3者之間有協(xié)同關(guān)系。實驗結(jié)果的差異一方面不排除在實驗過程中與試劑來源、實驗操作、實驗方法等因素有關(guān)，另一方面不排除本研究的樣本量較小，且標(biāo)本來源于同一地區(qū)，不能充分說明CLDN1在CIN中的作用機制。

綜上所述，P16、Ki67提高了CIN分級診斷的準(zhǔn)確性和一致性，防止過度治療，減少了手術(shù)和日后妊娠相關(guān)的并發(fā)癥，在臨床中有可用性和可重復(fù)性。CLDN1作為一種比較新的生物標(biāo)記物在CIN進展過程中的作用及病理診斷意義尚不明確，今后還需要更多的研究來探索。