楊繼亮 陳潔肖 岳賢田
(1.巢湖學(xué)院 化學(xué)與材料工程學(xué)院,安徽 巢湖 238024;2.溫州市環(huán)境科技有限公司,浙江 溫州 325000)
磺胺甲基嘧啶(SMR)是畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)常用的磺胺類藥物,主要用以預(yù)防及治療細(xì)菌感染。近年來,在天然水體及二級出水中頻繁檢測出磺胺類抗生素,給環(huán)境和人類帶來了極大的健康風(fēng)險[1]?;前奉惪股氐膹V泛應(yīng)用使其在水中易發(fā)生富集現(xiàn)象,環(huán)境中微生物無法完全將其分解,從而逐漸誘發(fā)產(chǎn)生耐藥性,致使藥物生命周期縮短[2-4]??股啬退幮缘娜蛐月右殉蔀樯鐣P(guān)注的重大問題。
傳統(tǒng)的抗生素檢測方法包括高效液相色譜法、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、酶聯(lián)免疫吸附法以及氣相-質(zhì)譜聯(lián)用法等。這些方法普遍存在設(shè)備昂貴、成本高、操作復(fù)雜且基層檢測部門難以普及等缺點。因此,研究建立一種快速簡便準(zhǔn)確的檢測方法對于保障環(huán)境安全與人體健康具有重要的意義。熒光生物傳感器由于其操作簡單、檢測靈敏度高、響應(yīng)迅速、耗時短、成本較低等優(yōu)點成為研究的熱點。傳統(tǒng)的熒光生物傳感器存在識別能力不強的問題,分子印跡技術(shù)為解決這個問題提供了新的方法[5]。分子印跡技術(shù)(MIT)是一種通過具有特定空穴結(jié)構(gòu)與功能位點聚合物來實現(xiàn)特異性識別的技術(shù),將分子印跡技術(shù)與熒光生物傳感器結(jié)合制備分子印跡熒光傳感器受到廣泛的關(guān)注。邵可滿等[6]利用稀土配合物分子印跡熒光探針快速檢測水中孔雀石綠含量,其檢測線性范圍達(dá) 0~20 μmol·L-1,并成功應(yīng)用于魚肉中孔雀石綠的檢測。吳長春等[7]以摻氮碳量子點為熒光響應(yīng)信號構(gòu)建磺胺嘧啶比率熒光探針,對0~100 μmol·L-1的SDZ溶液具有較好的檢測效果。宋敏霞等[8]制備CsPbBr3量子點分子印跡熒光探針實現(xiàn)了膽固醇的檢測。目前,分子印跡熒光傳感器所采用的熒光源多為半導(dǎo)體量子點[9-10],對環(huán)境造成一定壓力。碳量子點作為新型零維納米碳材料,具有低毒性、良好的生物相容性、穩(wěn)定性、耐光漂白性等優(yōu)點,是制備環(huán)境友好型分子印跡熒光傳感器極具發(fā)展?jié)摿Φ臒晒庠床牧稀?/p>
分別以摻氮碳量子點、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、乙二醇二甲基丙烯酸酯和磺胺甲基嘧啶分別作為熒光源、功能單體、交聯(lián)劑和模板分子,制備了具有特異性識別能力的碳點基分子印跡熒光傳感器(CQDs-MIP)?;谀0宸肿优c特異性位點結(jié)合后發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移導(dǎo)致熒光猝滅的機理,建立了快速、高選擇性且可視化檢測水環(huán)境中磺胺甲基嘧啶的新方法。
前期已完成碳量子點的制備研究工作,制備方法如文獻[11]所示。具體步驟如下:取1 g無水檸檬酸和0.7 g三羥甲基氨基甲烷溶于30 mL去離子水中,攪拌至完全溶解成透明溶液,100 wps超聲處理30 min后將其移入100 mL高壓反應(yīng)釜中,170℃下反應(yīng)4 h,冷卻至室溫后透析12 h(透析袋截留分子量為3500 Da),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥至一定體積后冷凍干燥,最后將得到固體產(chǎn)物配成50 mg·L-的碳量子點溶液備用。
準(zhǔn)確稱量一定量的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)和磺胺甲基嘧啶,溶于40 mL溶劑中,攪拌30 min后加入10 mL 50 mg·L-1的碳量子點溶液,100 wps下超聲處理30 min,靜置預(yù)聚合4 h。加入50 mg偶氮二異丁腈及20 mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯,混合均勻后將混合溶液轉(zhuǎn)移至圓底三口燒瓶中,用N2抽吸三次,在N2氣氛中60℃水浴回流24 h。反應(yīng)結(jié)束后,用250 mL甲醇-乙酸混合溶液(V甲醇∶V乙酸=9∶1)對聚合物進行反復(fù)洗脫,24 h后用甲醇進一步洗脫至檢測不到模板分子為止。將聚合物置于真空干燥箱中,60℃真空干燥6 h,即可得碳點基熒光分子印跡探針(CQDs-MIP)。熒光非印跡聚合物(CQDs-NIP)的制備方法同上,但不添加磺胺甲基嘧啶。
以CQDs-MIP對磺胺甲基嘧啶的飽和吸附量作為制備工藝條件評價指標(biāo)。用移液管準(zhǔn)確移取10 ml 60 mg·L-1的磺胺甲基嘧啶溶液置于碘量瓶中,加入10 mg CQDs-MIP,置于恒溫?fù)u床中,在室溫下以80 r·min-1的頻率進行振蕩吸附,吸附結(jié)束后,用0.22 μm濾膜過濾并取清液用紫外-可見光分光光度計在波長λ=266 nm處測定溶液中磺胺甲基嘧啶的剩余濃度,磺胺甲基嘧啶吸附量 Q(mg·L-1)由式(1)計算[12]。
式中:C0、Ct分別為初始及t時刻磺胺甲基嘧啶溶液濃度,mg·L-1;V表示磺胺甲基嘧啶溶液體積,L;m 為 CQDs-MIP 質(zhì)量,g。
1.3.1 功能單體用量對CQDs-MIP性能的影響
分別取模板分子與功能單體摩爾比為1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12,按步驟 1.2 制備 CQDs-MIP。在10 mL 60 mg·L-1的磺胺甲基嘧啶溶液中加入相應(yīng)10 mg CQDs-MIP,在室溫下以 80 r·min-1的頻率振蕩吸附至平衡,按式(1)計算吸附量,考察功能單體用量對CQDs-MIP性能的影響。
1.3.2 溶劑對CQDs-MIP性能的影響
分別以乙醇、乙腈、甲醛為溶劑,按步驟1.2制備CQDs-MIP。在10 mL 60 mg·L-1的磺胺甲基嘧啶溶液中加入相應(yīng)10 mg CQDs-MIP,在室溫下以80 r·min-1的頻率振蕩吸附至平衡,按式(1)計算吸附量,考察溶劑種類對CQDs-MIP性能的影響。
1.3.3 交聯(lián)劑對CQDs-MIP性能的影響
分別以乙二醇二甲基丙烯酸酯、N,N-而亞甲基雙丙烯酰胺、二乙烯基苯為交聯(lián)劑,按步驟1.2制備CQDs-MIP。在10 mL 60 mg·L-1的磺胺甲基嘧啶溶液中加入相應(yīng)10 mg CQDs-MIP,在室溫下以80 r·min-1的頻率振蕩吸附至平衡,按式(1)計算吸附量,考察交聯(lián)劑種類對CQDs-MIP性能的影響。
在碘量瓶中分別加入 10 mL 10~100 mg·g-1的磺胺甲基嘧啶溶液和10 mg CQDs-MIP。在20℃下,以80 r·min-1的頻率振蕩吸附3 h。吸附完成后過濾取清液檢測剩余濃度,計算吸附量并利用Langmuir等溫吸附方程式(2)及Freundlich等溫吸附方程式(3)進行數(shù)據(jù)擬合分析。
式中:Qe、Qm分別為平衡吸附量及最大吸附量,mg·g-1;Ce為平衡濃度,mg·L-1;b(L·mg-1)、Kf分別為Langmuir吸附系數(shù)及Freundlich吸附系數(shù);1/n為Freundlich常數(shù),與吸附強度相關(guān)。
在碘量瓶中加入10 mL 50 mg·g-1的磺胺甲基嘧啶溶液和10 mg CQDs-MIP。分別在20、40、60℃下,以80 r·min-1的頻率進行振蕩吸附,并每隔一段時間取樣分析磺胺甲基嘧啶溶液濃度,計算吸附量并利用準(zhǔn)一級動力學(xué)模型公式(4)與準(zhǔn)二級動力學(xué)模型公式(5)進行數(shù)據(jù)擬合分析。
式中:k1為準(zhǔn)一級吸附速率常數(shù),min-1;k2為準(zhǔn)二級吸附速率常數(shù),g·mg-1·min-1。
準(zhǔn)確稱取100 mg CQDs-MIP置于錐形瓶,分別加入10 mL 60 mg·L-1的磺胺甲基嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶溶液,在室溫下以80 r·min-1的頻率振蕩吸附3 h,過濾后取清液測量吸光度,根據(jù)式(1)計算吸附量。CQDs-NIP的吸附量測定方法同上。并根據(jù)式(6)、式(7)計算印跡因子I及選擇性系數(shù)α,驗證選擇性[13]。
式中:QMIP為CQDs-MIP對磺胺甲基嘧啶的吸附量,mg·g-1;
QNIP為非印記分子對磺胺甲基嘧啶的吸附量,mg·g-1。
Q模板分子為CQDs-MIP對磺胺甲基嘧啶的吸附量,mg·g-1;
Q非模板分子為CQDs-MIP對競爭吸附質(zhì)的吸附量,mg·g-1。
將 3 mL 300 mg·g-1的 CQDs-MIP溶液與 1 mL不同濃度的磺胺甲基嘧啶溶液混合,加入pH=6的檸檬酸鹽緩沖溶液定容至10 mL,靜置60 min后,在激發(fā)波長λex=365 nm處測定相對熒光強度。
2.1.1 功能單體添加量對CQDs-MIP性能的影響
由于3-氨基丙基三乙氧基硅烷 (APTES)作為擁有較多羥基的新型非乙烯基功能單體,具有可在水相環(huán)境下聚合及抑制強極性環(huán)境干擾的能力,因此本實驗以APTES作為功能單體[14]。功能單體用量與分子印跡識別功能密切相當(dāng)。若功能單體用量過少,則生成的模板-功能單體復(fù)合物數(shù)量不足,洗脫模板后所形成的功能位點數(shù)量少,識別效果差[15]。APTES與SMR的磺?;?、氨基通過氫鍵結(jié)合成預(yù)聚物,又通過氫鍵作用包覆在CQDs表面,通過交聯(lián)劑固定并去除模板分子后即可得具有特定空穴形狀的分子印跡聚合物,過程如圖1所示[16]。當(dāng)功能單體用量過大時,可能導(dǎo)致非選擇性功能位點數(shù)量增加,并引發(fā)功能單體自聚,反而使識別能力減弱,故而需要對功能單體用量加以優(yōu)化選擇[17]。由圖2可看出,當(dāng)功能單體用量為10 mmol時,CQDs-MIP平衡吸附量最大,表明特異性結(jié)合功能位點數(shù)量最多。故而選擇磺胺甲基嘧啶與3-氨基丙基三乙氧基硅烷的摩爾比為 1∶10。
圖1 CQDs-MIP合成原理圖
圖2 APTES添加量對CQDs-MIP性能的影響
2.1.2 溶劑對CQDs-MIP性能的影響
溶劑一方面可以為聚合反應(yīng)提供適合的反應(yīng)環(huán)境,另一方面在聚合過程中可在高分子鏈間撐出空間,作為致孔劑來使用,會影響功能單體和模板間的結(jié)合強度、聚合物的性能和形態(tài),具有重要的作用[18]。在相同條件下,分別以乙醇、乙腈、甲醛作為溶劑制備CQDs-MIP,并進行吸附實驗。結(jié)果表明,以乙腈為溶劑制備的CQDs-MIP平衡吸附量最大,達(dá)8.70 mg·g-1,而以乙醇和甲醛為溶劑制備的CQDs-MIP平衡吸附量分別為7.90及8.33 mg·g-1。這主要是由于大孔溶劑形成的大孔結(jié)構(gòu)更有利于物質(zhì)擴散,從而有利于提高其識別能力[19-20]。因此,乙腈為最適宜制備CQDs-MIP的溶劑。
2.1.3 交聯(lián)劑對CQDs-MIP性能的影響
交聯(lián)劑可將SM1-APTES聚合物交聯(lián)在一起,除去模板分子后,形成具有特殊立體空腔結(jié)構(gòu)形狀和功能基精確排布的聚合物。交聯(lián)劑用量對CQDs-MIP的特異性結(jié)合能力及構(gòu)型具有重要影響[14]。若交聯(lián)劑用量過少,則SM1-APTES聚合物無法保持穩(wěn)定的框架結(jié)構(gòu)和空腔形狀,若交聯(lián)劑用量過多,又會減少特異性結(jié)合位點的數(shù)量[18]。在相同條件下,分別以乙二醇二甲基丙烯酸酯、N,N-二亞甲基雙丙烯酰胺、二乙烯基苯為交聯(lián)劑制備CQDs-MIP,對應(yīng)的平衡吸附量分別為8.70、8.04及8.19 mg·g-1。因此,綜合考慮采用以乙二醇二甲基丙烯酸酯作為交聯(lián)劑。
如圖3所示,3426 cm-1為O-H/N-H伸縮振動峰;1630 cm-1為C-O伸縮振動峰[21]。相較于CQDs,CQDs-MIP的紅外光譜曲線出現(xiàn)了新吸收峰,2985 cm-1為APTES中N-H鍵彎曲振動吸收峰[22];2942 cm-1為C-H鍵伸縮振動吸收峰[23];1730 cm-1為C=O伸縮振動峰;1438 cm-1為APTES修飾后的氨基伸縮振動吸收峰[24];954 cm-1處為Si-O-Si不對稱拉伸峰[10];880~680 cm-1之間出現(xiàn)了苯環(huán)CH面外彎曲振動峰[25]。這表明APTES被成功結(jié)合在CQDs表面。
圖3 CQDs-MIP的紅外光譜圖
CQDs-MIP對磺胺甲基嘧啶的平衡吸附實驗結(jié)果如圖4(a)所示。CQDs-MIP吸附量隨著磺胺甲基嘧啶濃度的增加而增加,在0~30 mg·L-1區(qū)間吸附曲線陡峭上升,吸附量迅速增加至6.82 mg·g-1,隨后逐漸變?yōu)槠骄?,?dāng)磺胺甲基嘧啶濃度為 100 mg·L-1時,吸附量為 9.04 mg·g-1。這主要是由于在低濃度情況下,CQDs-MIP特異性結(jié)合位點數(shù)量較為充足,目標(biāo)分子結(jié)合后空置位點數(shù)量仍然較多,因而隨著磺胺甲基嘧啶溶液濃度增加,吸附量也隨之增加;當(dāng)溶液濃度再進一步增加時,CQDs-MIP表面閑置功能位點數(shù)量被模板分子占據(jù)而銳減,同時在CQDs-MIP表面吸附位形成空間位阻,阻礙了模板分子的靠近,因此吸附量逐漸趨于平緩。對上述數(shù)據(jù)分別利用Langmuir和Freundlich等溫吸附方程式進行擬合,其結(jié)果如圖 4(b)(c)及表 1 所示。擬合結(jié)果表明,Langmuir等溫吸附線方程為y=0.1121x+0.7112,R2=0.9854;Freundlich等溫吸附線方程為y=0.4297x+0.3861,R2=0.8852。結(jié)果表明Langmuir模型能更好的描述CQDs-MIP對磺胺甲基嘧啶的吸附過程,因此推測CQDs-MIP對磺胺甲基嘧啶的吸附為化學(xué)吸附過程,且理論飽和吸附量Qm為8.92 mg·g-1,與實驗值 9.04 mg·g-1接近[12]。1/n 介于0.1~0.5 之間,表明CQDs-MIP有利于吸附磺胺甲基嘧啶。
表1 Langmuir、Freundlich等溫吸附模型參數(shù)
圖4 (a)CQDs-MIP對磺胺甲基嘧啶的平衡吸附曲線;(b)Langmuir等溫吸附線;(c)Freundlich 等溫吸附線
為了進一步了解CQDs-MIP對磺胺甲基嘧啶的吸附過程,分別在293、313、333K測定不同時間下CQDs-MIP的吸附量。如圖5(a)所示,在任意實驗溫度下,CQDs-MIP對磺胺甲基嘧啶的吸附在10 min左右基本達(dá)到吸附平衡狀態(tài),吸附速率如此迅速,也進一步驗證其為化學(xué)吸附過程。當(dāng)溫度為293 K增加至333 K時,平衡吸附量也由4.49 mg·g-1增加至 8.19 mg·g-1,平衡吸附量隨溫度增加而增加,表明其吸附過程為吸熱過程,升溫有利于吸附的進行[24]。
分別采用準(zhǔn)一級、準(zhǔn)二級動力學(xué)模型對數(shù)據(jù)進行擬合分析,結(jié)果如圖5(b)(c)及表 2所示。在3個溫度下,準(zhǔn)二級動力學(xué)模型擬合相關(guān)系數(shù)均達(dá)0.99以上,表明吸附過程為化學(xué)相互作用過程,化學(xué)吸附是限制吸附速率的主要因素[13,26]。
表2 不同溫度下動力學(xué)模型參數(shù)
圖5 (a)不同溫度下CQDs-MIP對磺胺甲基嘧啶的吸附曲線;(b)準(zhǔn)一級動力學(xué)模型曲線;(c)準(zhǔn)二級動力學(xué)模型曲線
為了評價CQDs-MIP對磺胺甲基嘧啶的特性異識別能力,對CQDs-MIP進行選擇性吸附實驗,實驗結(jié)果如表3所示。CQDs-NIP對三種磺胺類抗生素的吸附能力相當(dāng),表現(xiàn)出非選擇性吸附現(xiàn)象。而CQDs-MIP對磺胺甲基嘧啶表現(xiàn)出明顯的吸附優(yōu)勢,CQDs-MIP對磺胺嘧啶和磺胺二甲基嘧啶的選擇性系數(shù)分別為2.28及3.02,表明相較于其余兩種類似物,CQDs-MIP對磺胺甲基嘧啶具有選擇性。結(jié)合吸附等溫線及吸附動力學(xué)的討論結(jié)果,可以推測由于CQDs-MIP不僅具有有效形狀的三維孔穴,并且表面的功能性結(jié)合位點對磺胺甲基嘧啶有較強的親和力,因此對磺胺甲基嘧啶具有較強的特異性識別能力和競爭吸附能力[24]。為了驗證CQDs-MIP的3D結(jié)構(gòu),對其進行BET吸附性能表征,結(jié)果如圖6所示。由N2吸脫附曲線結(jié)果可知CQDs-MIP符合I型Langmuir等溫吸附線,表明CQDs-MIP具有微孔結(jié)構(gòu)。
表3 CQDs-MIP和CQDs-NIP選擇性吸附結(jié)果
圖6 CQDs-MIP的N2吸/脫附曲線
CQDs-MIP表面電荷及其與模板分子之間的猝滅反應(yīng)均受檢測體系pH值的影響[27-29]。實驗結(jié)果如圖7所示,結(jié)果表明在酸性條件下熒光體系猝滅效果較為顯著,當(dāng)pH=6時磺胺甲基嘧啶對CQDs-MIP的猝滅強度最大。這可能是由于在強酸條件下CQDs-MIP與模板分子均被質(zhì)子化發(fā)生靜電排斥作用,而在強堿條件下發(fā)生印跡層電離,因此削弱了功能位點與模板分子的結(jié)合[21,28-29]。故檢測體系pH值選擇為6。
圖7 pH對熒光猝滅強度的影響
熒光強度隨著CQDs-MIP對磺胺甲基嘧啶吸附時間的增加而變化,因此實驗考察了CQDs-MIP對磺胺甲基嘧啶的響應(yīng)時間,結(jié)果如圖8所示。隨著接觸時間的延長,熒光強度逐漸減弱,當(dāng)響應(yīng)時間高于60 min時,熒光猝滅強度基本達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài),因此選擇60 min作為最佳響應(yīng)時間。
圖8 響應(yīng)時間對熒光強度的影響
為了研究CQDs-MIP投加量對檢測系統(tǒng)熒光強度的影響,實驗考察了不同濃度CQDs-MIP在pH=6時的熒光猝滅強度,結(jié)果如圖9所示。當(dāng)CQDs-MIP濃度為300 mg·L-1時,檢測體系熒光猝滅強度最大,因此選擇300 mg·L-1作為最佳檢測濃度。
圖9 CQDs-MIP濃度對熒光猝滅強度的影響
CQDs-MIP能識別磺胺甲基嘧啶發(fā)生熒光猝滅現(xiàn)象,主要基于CQDs與磺胺甲基嘧啶之間發(fā)生的電荷轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。當(dāng)模板分子與特異性功能位點結(jié)合時,CQDs作為電子供體將電荷轉(zhuǎn)移至磺胺甲基嘧啶上而導(dǎo)致熒光猝滅[30]。熒光猝滅強度與模板分子的濃度息息相關(guān),兩者之間的關(guān)系可由Stern-Volmer方程進行表達(dá)[11]:F0/F=1+Ksv[C]。其中,F(xiàn)0與F分別表示加入模板分子前后的熒光強度;Ksv為Stern-Volmer方程常數(shù);C為磺胺甲基嘧啶溶液濃度。
如圖 10 所示,在 2~100mg·L-1檢測范圍內(nèi),熒光強度隨著磺胺甲基嘧啶溶液濃度的增加而減弱,F(xiàn)0/F與[C]之間表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,線性方程為 F0/F=0.0344[C]+1.6422,R2=0.9972。結(jié)果表明基于熒光猝滅法可以實現(xiàn)CQDs-MIP對磺胺甲基嘧啶的檢測識別。
圖10 不同SMR濃度下的熒光光譜圖(插圖為Stern-Volmer擬合曲線)
首先,以摻氮碳量子點作為熒光源,分別以磺胺甲基嘧啶為模板分子、以APTES為功能單體、乙腈為溶劑、乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑制備了熒光分子印傳感器,同時對CQDs-MIP進行紅外表征分析,結(jié)果表明APTES成功結(jié)合在碳點表面。
其次,以CQDs-MIP為吸附劑,對磺胺甲基嘧啶進行動態(tài)平衡吸附實驗,發(fā)現(xiàn)其吸附行為能夠用Langmuir吸附等溫模型和擬二階動力學(xué)方程進行很好的描述,表明CQDs-MIP對磺胺甲基嘧啶的吸附主要為化學(xué)吸附過程,與紅外分析結(jié)果一致。
再次,CQDs-MIP對磺胺甲基嘧啶表現(xiàn)出明顯的吸附選擇性,對磺胺嘧啶和磺胺二甲基嘧啶的選擇性系數(shù)分別為2.28及3.02。結(jié)合吸附等溫線及吸附動力學(xué)的討論結(jié)果,可以推測由于CQDs-MIP不僅具有有效形狀的三維孔穴,并且表面的功能性結(jié)合位點對磺胺甲基嘧啶有較強的親和力。
最后,CQDs-MIP表面的特異性結(jié)合位點與目標(biāo)分子通過氫鍵結(jié)合后,電荷由CQDs轉(zhuǎn)移至目標(biāo)分子從而導(dǎo)致熒光猝滅現(xiàn)象的發(fā)生。在CQDs-MIP濃度為300 mg·L-1、pH值為6、響應(yīng)時間為60 min的最優(yōu)檢測條件下,基于熒光猝滅機理可實現(xiàn)對磺胺甲基嘧啶的快速、靈敏、準(zhǔn)確檢測,其響應(yīng)線性范圍為2~100 mg·L-1,線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9972,為環(huán)境中抗生素污染物的快速檢測提供了新方法。