于秋琳 馬婧怡 趙盼 孫鵬芳 何玉美 劉世彪 郭惠紅

（1.北京林業(yè)大學生物科學與技術學院，北京 100083；2.吉首大學生物資源與環(huán)境科學學院，吉首 416000）

絞股藍（Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino）是葫蘆科絞股藍屬的一種多年生草質藤本植物，因其根狀莖中富含的絞股藍皂苷具有調節(jié)血壓、降低膽固醇等重要的藥用價值而得到廣泛關注［1］。絞股藍為了生存演變出了一種重要的越冬繁殖策略，即在入冬前其地上莖的近頂端區(qū)域會膨大后鉆入土中發(fā)育成根狀莖以便來年長出新的植株［2］。絞股藍這種地上莖向根狀莖的轉變不僅是發(fā)育階段的變化，而且是其繁殖功能上的轉變，這種轉變機制是發(fā)育生物學領域中一個亟待解決的科學問題。

miRNAs是一類內源性的小分子非編碼RNA，通過在轉錄后水平上調節(jié)其下游靶基因的表達參與調控植物的生長發(fā)育過程［3］。越來越多的研究表明，一些miRNAs參與了植物發(fā)育的轉變，其中miR156和miR166被認為是兩個關鍵的調控因子［4］。miR156調控植物發(fā)育轉變的功能最初在擬南芥中得到證實，miR156b過表達使植株葉片數(shù)目增多、側枝增加和開花延遲，即miR156b會延長植株的童期，抑制童期向成熟期的轉變［5］。然而，通過突變或虛擬靶標技術下調miR156的水平使得擬南芥葉片數(shù)量減少，促進葉片背軸毛狀體的產生和童期向成熟期的轉變［6-7］。miR166也參與調節(jié)植物發(fā)育的轉變，但與miR156不同的是，在水稻中，miR166的表達下調延緩了生長發(fā)育階段的轉變［8］，表明miR166促進植株童期向成熟期的轉變。此外，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，miR166a表達水平的上調導致擬南芥植株矮化，miR166g過表達會導致嚴重的發(fā)育缺陷［9-10］，這些研究表明miR166還影響了器官發(fā)育中的正常轉變。miR156和miR166的這些表型在模式植物楊樹中也有類似的表現(xiàn)［11］。從前人的研究中可以發(fā)現(xiàn)，miR156是植物童期向成熟期轉變的負調控因子，而miR166是童期向成熟期轉變的正調控因子，并且還會影響器官的正常發(fā)育。

本課題組前期通過小RNA測序發(fā)現(xiàn)miRNAs參與了絞股藍地上莖向根狀莖的發(fā)育轉變過程，首次發(fā)現(xiàn)GpmiR156a和GpmiR166b在這個發(fā)育轉變過程中發(fā)揮了重要作用［2］。鑒于不同物種中miR156和miR166的同源物可能存在功能分化，我們通過轉化擬南芥進一步分析了GpmiR156a和GpmiR166b的生理功能，以期拓寬對miR156a和miR166b在調控植物生長發(fā)育方面的認識。

1 材料與方法

1.1 材料

用于基因克隆的絞股藍和用于遺傳轉化的擬南芥植株均栽培于組培室，溫度為（22±2）℃。

1.2 方法

1.2.1 絞股藍基因組DNA的提取 取絞股藍植株莖頂端的幼嫩莖段為材料，使用天根試劑盒提取絞股藍的基因組DNA。

1.2.2 絞股藍GpMIR156a和GpMIR166b的克隆 由于絞股藍未經過全基因組測序，所以本實驗采用兼并引物的方法設計絞股藍GpmiR156a和GpmiR166b的引物（表1）。以絞股藍基因組DNA為模版，進行PCR擴增，將擴增片段與pMD18-T載體連接，轉化大腸桿菌感受態(tài)TOP10，平板涂布培養(yǎng)后經抗性篩選獲得陽性單菌落，菌液PCR后送公司測序鑒定獲得GpmiR156a和GpmiR166b的前體序列。

1.2.3 GpmiR156a和GpmiR166b的生物信息學分析利用RNAfold分析絞股藍GpmiR156a和GpmiR166b的二級結構，通過MEGA X，構建NJ-系統(tǒng)進化樹（Bootstrap為1 000），利用在線網(wǎng)站psRNATarget預測絞股藍GpmiR156a和GpmiR166b的靶基因。

1.2.4 植物表達載體的構建及農桿菌的轉化 以GpmiR156a和GpmiR166b測序驗證正確的菌液為模板，加有酶切位點的GpmiR156a/miR166b-Ft/Rt為引物（表1），進行PCR擴增，回收目的產物，并利用Xma I和Xba I限制性內切酶將pBI121載體線性化。利用T4連接酶進行連接，獲得pBI121-GpmiR156a/166b重組載體，轉化大腸感受態(tài)TOP10。經過菌液PCR檢測及測序驗證后，轉入GV3101農桿菌感受態(tài)，獲得陽性菌液。

1.2.5 轉基因擬南芥的檢測與篩選 采用花序浸染法轉化擬南芥，待擬南芥成熟后收取T0代種子，播在含有30 mg/L Kan的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至10-14 d時，將長勢良好的擬南芥移栽到營養(yǎng)土中。提取植株的基因組DNA，以pBI121載體的CaMV35S啟動子序列和GUS報告基因序列設計引物為p121-F和p121-R（表1）。用 GpmiR156a和 GpmiR166b過表達載體的質粒作為陽性對照，進行PCR擴增。將電泳檢測陽性的轉基因擬南芥進行GUS檢測。待檢測為陽性的植株成熟后收取T1代種子，按相同的篩選方法篩選出T2代種子，對T2代植株進行表型觀察。

表1 絞股藍GpmiR156a和GpmiR166b的引物信息Table 1 Primer information of G.pentaphyllu GpmiR156a and GpmiR166b

1.2.6 GpmiR156a和GpmiR166b轉基因擬南芥種子的播種處理與統(tǒng)計觀察 取GpmiR156a和GpmiR166b轉基因擬南芥的種子與野生型擬南芥種子播種到1/2 MS出芽培養(yǎng)基上，在4℃春化2 d后于光照培養(yǎng)箱中（22℃，光照16 h/黑暗8 h）培養(yǎng)，分別統(tǒng)計野生型和轉基因株系的種子萌發(fā)率。

待擬南芥種子萌發(fā)后，將生長8 d的幼苗移至1/2 MS生根培養(yǎng)基中，放置在光照培養(yǎng)箱中。生長7 d后，用刻度尺分別測量野生型擬南芥和轉基因株系的主根（即最長一條根）的長度。種子萌發(fā)率和根長均使用軟件SPSS Statistics 26進行單因素ANOVA統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 絞股藍GpMIR156a和GpMIR166b的克隆

提取的絞股藍基因組DNA經Nanodrop-2000檢測發(fā)現(xiàn)，A260/A280在1.85-1.93之間，A260/A230范圍在1.9-2.0之間，在凝膠成像儀下顯示出清晰的基因組條帶（圖1），表明提取的基因組DNA樣品純度高，降解少，能夠用于后續(xù)基因克隆。通過PCR擴增分別得到長度為365 bp、425 bp的GpmiR156a和GpmiR166b前體序列，兩者的成熟體均為21 bp（圖2）。

圖1 絞股藍基因組DNA電泳圖Fig.1 Genomic DNA electrophoresis of G.pentaphyllum

圖2 絞股藍GpmiR156a和GpmiR166b的前體序列Fig.2 Precursor sequences of G.pentaphyllu GpmiR156a and GpmiR166b

2.2 絞股藍GpmiR156a和GpmiR166b的生物信息學分析

使用RNAfold在線網(wǎng)站預測GpmiR156a和GpmiR166b的二級結構，GpmiR156a和GpmiR166b的最小自由能（minimum free energy，MFE）分別為-31.39 kcal/mol和-25.29 kcal/mol。MFE的值越小結構越趨于穩(wěn)定，GpmiR156a和GpmiR166b的MFE值較小說明它們的二級結構較為穩(wěn)定。GpmiR156a和GpmiR166b的MFE結構如圖3所示。

圖3 絞股藍GpmiR156a和GpmiR166b的二級結構Fig.3 Secondary structures of G.pentaphyllu GpmiR156a and GpmiR166b

使用NJ法構建GpmiR156a和GpmiR166b的系統(tǒng)進化樹（圖4）。GpmiR156a與禾本科的二穗短柄草聚在同一進化枝上，與葫蘆科的西葫蘆、南瓜、筍瓜親緣關系次之，GpmiR166b則與葫蘆科的物種親緣關系最近。GpmiR156a和GpmiR166b分別與禾本科和葫蘆科的親緣關系最近，這與核苷酸序列比對的結果一致。

圖4 絞股藍GpmiR156a和GpmiR166b的進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of G.pentaphyllu GpmiR156a and GpmiR166b

利用在線網(wǎng)站psRNATarget預測GpmiR156a和GpmiR166b的靶基因，獲得62個潛在的GpmiR156a靶基因和30個潛在的GpmiR166b靶基因。通過對靶基因的分析可知，GpmiR156a的靶基因主要為SPL家族成員，而GpmiR166b的靶基因主要為HDZIP III家族成員（表2）。

表2 絞股藍GpmiR156a和GpmiR166b的靶基因預測Table 2 Prediction of G.pentaphyllu GpmiR156a and GpmiR166b target genes

2.3 轉基因植株的檢測與表型分析

本實驗通過Kan抗性篩選（圖5-C），初步篩選出63株待檢測的GpmiR156a轉基因植株和39株待檢測的GpmiR166b轉基因植株。對抗性篩選后的轉基因植株進一步進行PCR檢測（圖5-A）和GUS檢測（圖5-B），轉基因陽性植株檢測出了預期的PCR擴增條帶、GUS染色明顯，獲得53株GpmiR156a過表達陽性植株和24株GpmiR166b過表達陽性植株。

為了探究轉基因植株的表型，我們將在培養(yǎng)基上培養(yǎng)了10-14 d、葉片發(fā)育良好、根系發(fā)達的擬南芥幼苗移栽到營養(yǎng)土中繼續(xù)觀察。結果發(fā)現(xiàn)GpmiR156a轉基因擬南芥的蓮座葉數(shù)量明顯多于野生型（圖5-D-a，b；圖6-A），其分枝也比野生型擬南芥顯著增多（圖5-D-d，e；圖6-B）。GpmiR166b轉基因擬南芥較野生型植株矮小，葉片數(shù)量減少（圖5-D-a，c；圖6-C），而且其莖上毛狀體較野生型明顯增多（圖5-D-d，f）。

圖5 轉基因植株的檢測與表型分析Fig.5 Detection and phenotype analysis of positive transgenic plants

圖6 轉基因擬南芥與野生型擬南芥的葉片及分枝數(shù)量Fig.6 Number of rosette leaves and branches in transgenic A.thaliana and WT

為了進一步研究GpmiR156a和GpmiR166b過表達對擬南芥種子萌發(fā)及根長的影響，我們將獲得的GpmiR156a和GpmiR166b轉基因擬南芥T2代種子種植于含Kan抗性的1/2 MS培養(yǎng)基上，以野生型為對照觀察、分析了GpmiR156a和GpmiR166b過表達株系種子萌發(fā)及根長的變化規(guī)律（圖7）。GpmiR156a轉基因株系的種子比野生型萌發(fā)速度快（圖7-A），而GpmiR166b過表達株系的種子萌發(fā)速度比野生型慢（圖7-B），說明GpmiR156a的過表達可以加速擬南芥種子的萌發(fā)，但GpmiR166b表達水平的上調則會減緩種子的萌發(fā)。GpmiR156a和GpmiR166b過表達對擬南芥種子萌發(fā)的速度有影響，但對最終的種子萌發(fā)率沒有影響。此外，GpmiR156a和GpmiR166b過表達植株的根長均長于野生型（圖7-C，D）

圖7 過表達GpmiR156a、GpmiR166b擬南芥與野生型擬南芥種子的萌發(fā)與根長Fig.7 Seed germination and root length of overexpressing GpmiR156a and GpmiR166b and wild-type A.thaliana

3 討論

遺傳轉化是開展植物基因功能研究的重要方法。由于絞股藍的全基因組尚未測序和絞股藍的遺傳轉化體系尚未建立，本實驗采用設計兼并引物的方法克隆了絞股藍GpmiR156a和GpmiR166b的前體序列，通過轉化擬南芥研究其生理功能，以拓寬miRNAs對植物生長發(fā)育調控機制的認識。

本實驗通過在線軟件預測的GpmiR156a靶基因主要包括SPL家族成員，SPL編碼植物特異性轉錄因子，控制著植物生長和發(fā)育的許多方面，包括營養(yǎng)相變、分枝和葉片數(shù)量等［12-13］。研究表明，功能缺失的spl13突變體增加了擬南芥幼苗的蓮座葉數(shù)目［14］。在紫花苜蓿中，SPL13的沉默導致植株分枝增多［15］。這些研究揭示SPL能夠抑制分枝和葉片的發(fā)育。在本研究中，過表達GpmiR156a的轉基因擬南芥葉片數(shù)量和分枝數(shù)量明顯多于野生型，推測GpmiR156a很可能通過抑制SPL的表達促進了植株葉片和分枝的增多，延長童期，從而抑制了童期向成年期發(fā)育的轉變。此外，本實驗發(fā)現(xiàn)，與野生型相比過表達GpmiR156a轉基因植株的種子萌發(fā)加速且根長增加。近幾年也有研究發(fā)現(xiàn)，在赤霉素途徑中miR156的表達上調解除了水稻種子的休眠，促進了種子的萌發(fā)［16］；在擬南芥中，miR156的過表達顯著增加了擬南芥幼苗的根長［17］，這些發(fā)現(xiàn)與我們的研究結果基本一致。在擬南芥中，miR156a的過表達使根中的生長素轉運體PIN表達上調，PIN表達水平的上調促進了幼苗根的伸長［18］。因此，我們推斷GpmiR156a可能通過對其靶基因SPL的調節(jié)參與了植物發(fā)育轉變的調控，還可能通過赤霉素途徑加速種子萌發(fā)及通過影響根中生長素的運輸促進根的伸長。

GpmiR166b靶基因的預測結果指出，其靶基因主要包括HDZIP III家族成員。前人研究發(fā)現(xiàn)，miR166a的過表達通過抑制HDZIP III類靶基因的表達，導致擬南芥植株矮化和SAM缺失［10］。在本研究中，我們觀察到過表達GpmiR166b的擬南芥植株矮小、幼苗葉片數(shù)量減少，這與前人的研究結果基本一致。同時，本研究首次發(fā)現(xiàn)GpmiR166b轉基因植株花序莖上毛狀體數(shù)量增多。在擬南芥中，葉背面毛狀體的產生常被視作童期向成熟期發(fā)育轉變的關鍵標志［19］。我們認為植株矮小，幼苗葉片數(shù)量減少也是童期縮短、加速向成熟期轉變的現(xiàn)象，綜合考慮GpmiR166b過表達植株的表型，推測GpmiR166b不僅促進了植物童期向成熟期的發(fā)育轉變，而且影響器官的正常發(fā)育。本研究還發(fā)現(xiàn)GpmiR166b會影響種子萌發(fā)，GpmiR166b過表達植株與野生型相比種子萌發(fā)速度受到抑制。前人研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥miR166的特異性缺失激活了種子萌發(fā)相關基因，促進了種子萌發(fā)［20］。這些研究表明miR166表達上調延緩萌發(fā)而表達下調促進萌發(fā)。但也有相反的報道，在落葉松中miR166a過表達促進了種子的萌發(fā)［21］。推測miR166存在這種相反的調節(jié)作用可能是由于該基因家族中的不同成員在種子萌發(fā)階段具有不同的調節(jié)作用，因為有研究表明同一個miRNA家族成員的前體序列存在差異會出現(xiàn)一定的功能分化［22-23］。本研究中，GpmiR166b過表達促進了根長，在煙草中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象［24］。最近，研究發(fā)現(xiàn)miR166通過影響生長素分布和信號轉導來促進根的伸長［25］。綜合前人的研究和本研究結果，推測生長素的合成和信號轉導在轉基因GpmiR166b植株根的伸長方面可能發(fā)揮了一定的作用。綜上，GpmiR166b促進了植株童期向成熟期發(fā)育的轉變和根的伸長，但影響器官的正常發(fā)育并延緩種子的萌發(fā)。

關于miRNAs調節(jié)植物發(fā)育轉變和器官形成的分子機制仍有待研究，這將是通過基因調節(jié)植物生長發(fā)育的重要分子基礎。值得注意的是，盡管基因過表達可以幫助了解目的基因在植物尤其是非模型植物中的生理功能，但基因的過表達可以表現(xiàn)出多效性表型，有時可能無法很好地闡明其功能。因此，更多的突變分析和基因編輯技術的應用，如CRISPR-Cas9，可為將來由miRNAs及其靶基因調控的植物發(fā)育調節(jié)機制提供新的見解。

4 結論

本研究克隆了GpMIR156a和GpMIR166b兩個miRNAs基因，進行了生物信息學分析。GpMIR156a的過表達導致擬南芥幼苗葉片數(shù)量和分枝的增多，而GpMIR166b的過表達導致擬南芥植株早熟和矮化，并首次發(fā)現(xiàn)了花序莖上毛狀體數(shù)量增多，揭示GpmiR156a能夠促進營養(yǎng)器官的發(fā)育、抑制童期向成熟期發(fā)育的轉變，而GpmiR166b雖影響器官的正常發(fā)育但促進童期向成熟期發(fā)育的轉變。GpMIR156a過表達加速種子的萌發(fā)并促進根的伸長，GpMIR166b過表達延緩種子萌發(fā)但促進根的伸長。