王倩倩，劉永惠，王 蒙，孫連慶

(西安交通大學第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科，陜西 西安 710061)

目前，全球范圍內(nèi)，糖尿病的患病率持續(xù)上升，據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟統(tǒng)計，2017年全球約有糖尿病患者4.15億，預計到2040年，全球糖尿病患者可能達到6.42億[1-2]。糖尿病周圍神經(jīng)病變(Diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥之一，90%以上的糖尿病患者伴有不同程度的周圍神經(jīng)病變[3]。糖尿病周圍神經(jīng)病變是糖尿病患者高致殘率、高病死率的因素，目前針對DPN治療藥物卻非常有限[4-5]。臨床發(fā)現(xiàn)，桃紅四物湯在改善DPN臨床癥狀方面效果較好，但作用機制尚不清楚。

網(wǎng)絡藥理學是一門運用網(wǎng)絡方法分析藥物與疾病之間“多成分、多靶點、多途徑”協(xié)同作用關系的藥理學分支學科。該方法既考慮了藥物之間的相互作用，也考慮了復方的復雜性和多樣性，與中醫(yī)的“整體觀念”“辨證論治”有異曲同工之妙。因此，網(wǎng)絡藥理學被廣泛用于探究中藥復方干預疾病的作用機制研究。本研究擬采用網(wǎng)絡藥理學技術和方法，對桃紅四物湯有效活性成分、靶點進行篩選，分析其治療DPN的作用機制，為桃紅四物湯治療DPN的基礎研究提供方向。

1 資料與方法

1.1 資料來源 本研究的文獻來源與分析平臺包括中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫及分析平臺(Traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)、Gene Cards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫、Uni Prot數(shù)據(jù)庫、String數(shù)據(jù)庫、Cytoscape 3.7.2軟件、R 3.8.6軟件。

1.2 研究方法

1.2.1 桃紅四物湯主要活性成分及作用靶點篩選：TCMSP數(shù)據(jù)庫具有識別藥物有效成分、作用靶點的能力，在該數(shù)據(jù)庫中分別檢索桃仁、紅花、熟地黃、當歸、白芍、川芎六味中藥的化學成分，按照口服生物利用度(Oral bioavailability,OB)≥30%，類藥性(Drug likeness,DL)≥0.18篩選藥物活性成分，進而篩選有效成分作用靶點，利用Uni Prot數(shù)據(jù)庫查詢?nèi)嗽窗械鞍祝M而將靶蛋白轉(zhuǎn)換為對應的靶基因，最終獲得靶基因的縮寫名稱。

1.2.2 疾病靶點篩選：以“Diabetic peripheral neuropathy”為關鍵詞，通過Gene Cards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫篩選DPN相關的疾病靶點基因信息，Excel中刪除重復基因并進行合并，得到DPN的靶基因，再將DPN靶基因信息與桃紅四物湯的靶基因進行匹配得到兩者的共同靶基因，即為桃紅四物湯治療DPN的潛在靶基因。

1.2.3 蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡構建：將桃紅四物湯有效成分對應靶基因和DPN靶基因輸入在線軟件作圖工具平臺繪制韋恩圖。兩者交集靶點基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫進行靶基因間的蛋白互作分析，物種限定為Homo sapiens,設定置信度>0.4代表兩個蛋白間有互作關系，構建PPI網(wǎng)絡圖。以網(wǎng)絡中各靶基因的節(jié)點連接度值(Degree)為指標，篩選出網(wǎng)絡中的核心蛋白質(zhì)靶標，以R軟件繪制Degree 排名前30的靶點柱狀圖。

1.2.4 構建“藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡：基于桃紅四物湯活性成分靶點與DPN靶點之間的相互作用關系，通過Cytoscape 3.7.2軟件構建“藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡。

1.2.5 GO富集和KEGG通路分析：為進一步篩選出桃紅四物湯作用靶點蛋白，在基因功能及信號通路中的生物學效應，采用R軟件Bioconductor包分別進行GO富集和KEGG通路分析。

2 結(jié) 果

2.1 桃紅四物湯活性成分及靶點篩選 從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中得到桃紅四物湯化學成分，通過OB值、DL值篩選各單味藥中的潛在活性成分，共獲得桃紅四物湯43個活性成分。從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中篩選出855個桃紅四物湯作用靶點，將篩選出的靶蛋白輸入Uni Prot數(shù)據(jù)庫，查詢靶蛋白簡稱，去重后得到桃紅四物湯212個靶點基因。

2.2 疾病靶點篩選 在Gene Cards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫以“Diabetic peripheral neuropathy”為關鍵詞，篩選DPN相關的疾病靶點基因信息，去重后收集到DPN靶點基因4662個。

2.3 桃紅四物湯活性成分與DPN共同靶點韋恩圖 將桃紅四物湯活性成分相關的212個靶點和糖尿病周圍神經(jīng)病變的4662個靶點輸入Bioinformatics & Evolutionary Genomics在線軟件作圖平臺，繪制韋恩圖，兩者交集為桃紅四物湯活性成分與DPN共同靶點，共150個(圖1)。圖中藍色代表桃紅四物湯活性成分靶基因，黃色代表DPN靶基因，二者交集為桃紅四物湯活性成分-DPN共同靶基因。

圖1 桃紅四物湯活性成分與DPN靶點韋恩圖

2.4 PPI網(wǎng)絡的構建 將篩選出的桃紅四物湯活性成分與DPN的交集靶點基因?qū)朐诰€網(wǎng)站String進行靶基因間的蛋白互作分析，構建PPI網(wǎng)絡圖(圖2)。PPI網(wǎng)絡圖中節(jié)點表示蛋白質(zhì)靶點，每條邊則表示蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用關系，網(wǎng)絡中共150個節(jié)點，2826條邊，節(jié)點平均度為37.7。通過R軟件繪制桃紅四物湯-DPN核心靶基因，其中AKT1、JUN、MAPK1、HSP90AA1、RELA是桃紅四物湯作用DPN的核心基因。

圖2 桃紅四物湯與DPN共同靶點PPI網(wǎng)絡圖

2.5 構建“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡圖 利用Cytoscape軟件構建桃紅四物湯藥物-成分-靶點-疾病可視化圖(圖3)。圖中藍色代表桃紅四物湯；紅色代表桃紅四物湯中藥物的活性成分；綠色代表桃紅四物湯與DPN共有靶基因；黃色代表DPN。桃紅四物湯中作用于DPN的化學成分有43個，連接點多的藥物活性成分主要包括槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇、木犀草素、黃芩素。

圖3 “藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡圖

2.6 GO富集分析 使用R軟件Bioconductor對150個共同靶點基因做GO富集分析，得到GO條目155個，根據(jù)P-value值大小進行排序，選取前20條目可視化得到氣泡圖(圖4)。圖中橫坐標代表基因富集數(shù)，縱坐標代表功能富集；結(jié)果顯示桃紅四物湯主要作用細胞膜，通過影響核受體活性、配體激活轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等過程，參與化學應激、氧化應激、抗生素、脂多糖等反應。

圖4 桃紅四物湯與DPN共有靶基因GO富集分析

2.7 KEGG通路富集分析 使用R軟件Bioconductor對150個共同靶點基因做KEGG通路富集分析，得到166條通路，根據(jù)P-value大小進行排序，選取前20條目可視化(圖5)。圖5A中橫坐標代表通路中富集基因數(shù)目，縱坐標代表通路富集。圖5B紅色大小代表通路中基因數(shù)目多少；綠色代表各個通路中的具體靶基因；綠色大小代表基因在通路中出現(xiàn)的次數(shù)。KEGG通路富集分析顯示靶點基因顯著富集于糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、IL-17信號通路、前列腺癌、TNF信號通路、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、人巨細胞病毒感染等多種途徑。

圖5 桃紅四物湯與DPN通路富集分析圖

3 討 論

中醫(yī)將糖尿病歸屬于“消渴病”范疇，后世醫(yī)家根據(jù)DPN臨床表現(xiàn)將其歸屬于“消渴痿證”“消渴痹證”范疇[6]。歷代醫(yī)家對DPN的發(fā)病機制進行探索，普遍認為DPN多因消渴病程日久，陰損及陽，使患者氣血虧虛，陰陽失調(diào)，虛實夾雜，導致瘀血阻滯，脈絡痹阻，可見“瘀血”是糖尿病周圍神經(jīng)病變的核心病機[7-8]。桃紅四物湯是活血化瘀的經(jīng)典方劑，在治療DPN方面具有較好的臨床效果，但作用機制尚不清楚[9-12]。

通過應用網(wǎng)絡藥理學的方法，對桃紅四物湯的成分進行了分析，篩選出桃紅四物湯有效活性成分43個，其中Degree排名前6位的化學成分是槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇、木犀草素、黃芩素。槲皮素是一種多酚類黃酮化合物，主要通過調(diào)節(jié)谷胱甘肽、酶活性、活性氧及信號轉(zhuǎn)導途徑維持氧化平衡[13]。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素的攝入量與2型糖尿病的患病率成反比，槲皮素可通過降低組織中的山梨醇，改善Na+-K+-ATP酶活性，減輕四氧嘧啶誘發(fā)DPN損傷[14-15]。山奈酚是一類黃酮類化合物，研究發(fā)現(xiàn)其可降低血糖，改善胰島素敏感性，同時可通過抗氧化應激、抗炎、抑制細胞凋亡，減少糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生[16-17]。β-谷甾醇是一種常見的植物甾醇，研究發(fā)現(xiàn)其可通過抗氧化、抗炎的作用抑制糖尿病及其并發(fā)癥的進展[18]。豆甾醇是一種植物甾醇，研究發(fā)現(xiàn)豆甾醇可通過增加血液中胰島素濃度，降低血糖濃度，同時豆甾醇可通過增加活動的過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽發(fā)揮抗氧化活性作用，抑制糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[19-20]。木犀草素是一種天然黃酮類化合物，研究發(fā)現(xiàn)木犀草素可明顯改善2型糖尿病大鼠胰島素抵抗作用，通過抗氧化、抗炎途徑抑制糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[21-23]。黃芩素是黃酮類化合物之一，研究發(fā)現(xiàn)黃芩素可減輕胰島損傷，通過抗氧化應激，抑制PKC、p38MAPK及多元醇途徑延緩DPN的發(fā)生[24]。根據(jù)網(wǎng)絡藥理學推測桃紅四物湯治療DPN的有效成分主要為槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇、木犀草素、黃芩素。

本研究篩選出藥物-疾病的共同靶標蛋白150個，這些蛋白主要作用于細胞膜，通過 AGE-RAGE信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、IL-17信號通路、前列腺癌、TNF信號通路參與氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡等過程。AKT1、JUN、MAPK1、HSP90AA1、RELA是以上信號通路中的核心蛋白。AKT1是AKT家族成員之一，AKT是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K/AKT信號通路的中心環(huán)節(jié)，PI3K/AKT信號通路的激活可抑制炎癥反應、細胞凋亡，在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。JUN、RELA屬于轉(zhuǎn)錄因子，主要通過調(diào)節(jié)免疫炎癥反應參與DPN的發(fā)生發(fā)展。MAPK1是MAPK家族的主要成員，在神經(jīng)元細胞死亡和再生中起重要作用。HSP90AA1是熱休克家族的重要成員，是細胞間重要的分子伴侶蛋白，主要參與細胞存活、信號轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和炎癥反應過程，是DPN發(fā)生發(fā)展的重要分子。