王 逍，屈陽(yáng)柳，胡雪純，程 穎，李 雨，賈 妮

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 712021；2.商洛市中醫(yī)醫(yī)院，陜西 商洛 726000；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046)

中風(fēng)是導(dǎo)致全世界60歲以上老年人死亡的第二大原因，是致殘的第一大原因[1]。中風(fēng)分為缺血性和出血性兩類，出血性中風(fēng)是由腦內(nèi)血管破裂引起[2]，而腦血管堵塞導(dǎo)致血流障礙引起缺血性中風(fēng)，占中風(fēng)病例的85%以上[3]，具有高致殘率、高病死率的特點(diǎn)。研究表明，免疫反應(yīng)誘導(dǎo)的缺血損傷后炎癥是缺血性中風(fēng)進(jìn)展過程中必不可少的一步，缺血損傷后24 h內(nèi)，激活了適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中的輔助T細(xì)胞17(T helper cell 17，Th17)細(xì)胞介導(dǎo)的體液和炎癥效應(yīng)[4]。Th17細(xì)胞與其刺激釋放的其他促炎介質(zhì)一起造成了血腦屏障(BBB)破壞，故單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞等全身炎癥細(xì)胞會(huì)透過BBB持續(xù)進(jìn)入受損區(qū)域，加劇腦損傷[5]。

國(guó)醫(yī)大師張學(xué)文根據(jù)缺血性中風(fēng)的發(fā)病機(jī)制及長(zhǎng)期臨床實(shí)踐提出氣虛血瘀證是缺血性中風(fēng)的常見證型[6]，其課題組經(jīng)過多年的研究和探索制訂了益氣養(yǎng)血、活血化瘀、通脈舒絡(luò)的治則，并在此基礎(chǔ)上，擬定了通脈舒絡(luò)方，由該方制成的通脈舒絡(luò)膠囊對(duì)治療氣虛血瘀所致缺血性中風(fēng)取得了良好的治療效果。故本實(shí)驗(yàn)擬通過研究通脈舒絡(luò)膠囊對(duì)缺血性中風(fēng)大鼠Th17細(xì)胞介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)的影響，探討通脈舒絡(luò)膠囊是否通過影響神經(jīng)局部及外周免疫中Th17細(xì)胞亞群功能的失衡狀態(tài)，抑制促炎因子釋放，達(dá)到神經(jīng)保護(hù)作用，為缺血性腦卒中的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)成年雄性SD大鼠120只[合格證號(hào)SCXK(川)2020-030,成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司]，體重220～280 g。飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房，自由攝食、飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。本研究所有實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)手段均獲得陜西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物：通脈舒絡(luò)膠囊(規(guī)格0.4 g/粒，批號(hào)20200321)；注射用青霉素鈉鹽80萬(wàn)U(批號(hào)200409)；0.9% 氯化鈉注射液(100 ml/瓶，批號(hào)L116060801) 。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器：2%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色液(批號(hào)G3005-500ml，北京索萊寶)；Rat IL-17A ELISA Kit(批號(hào)70-EK317/3-96，杭州聯(lián)科)，RAT 維甲酸相關(guān)孤兒受體γt(Retinoic acid recept-related orphan receptor γt,RORγt) Elsia kit(批號(hào)ml560717-96，上海酶聯(lián))，4%組織固定液(批號(hào)AR1068，武漢博士德)，伊紅染色液(批號(hào)G1100-500ml，北京索萊寶)，Cole蘇木素染色液(批號(hào)G1140-500ml，北京索萊寶)。石蠟切片機(jī)(型號(hào)R2235，德國(guó)徠卡)；生物組織自動(dòng)脫水機(jī)(型號(hào)TC-120S+，德國(guó)徠卡)；自動(dòng)恒溫烘片儀(型號(hào)TK-213，德國(guó)徠卡)；組織攤片、烤片機(jī)(型號(hào)TK-21811，德國(guó)徠卡)；冷凍臺(tái)、包埋機(jī)(型號(hào)TB-7188L，德國(guó)徠卡)；高速離心機(jī)(型號(hào)SH01D，上海知信)；酶標(biāo)儀(型號(hào)Multiskan FC，Thermo公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備：采用大腦中動(dòng)脈栓塞法[7]制備大鼠缺血性中風(fēng)模型，采用TTC染色確定模型制備是否成功。缺血1 h后，取出插入的線栓，使缺血區(qū)再灌注，手術(shù)過程中及術(shù)后至麻醉清醒前利用取暖器維持動(dòng)物體溫在正常范圍，并給予大鼠青霉素4萬(wàn)U/只肌肉注射以預(yù)防感染。假手術(shù)組大鼠同上述操作方法，但僅分離血管，不插線栓。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥：成年雄性SD大鼠120只，體重220～280 g，隨機(jī)分為五組，包括假手術(shù)組、模型組、通脈舒絡(luò)低劑量組、通脈舒絡(luò)中劑量組、通脈舒絡(luò)高劑量組，每組24只。通脈舒絡(luò)劑量組大鼠分別按照1 ml/100 g給予低、中、高濃度(0.032、0.064、0.128 g/ml)的通脈舒絡(luò)膠囊藥液灌胃，假手術(shù)組、模型組大鼠同樣以1 ml/100g濃度的0.9%氯化鈉溶液灌胃，各組大鼠均每天灌胃1次，且給予同樣喂養(yǎng)方法。各組分別于模型建立后1、3、7、14 d進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分配6只大鼠，評(píng)分結(jié)束后處死，取材。

1.2.3 取 材：各組大鼠于腦缺血再灌注1、3、7、14 d后分別進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分并記錄。大鼠麻醉后摘除脾臟，用0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行心臟灌注，迅速取腦，分離出全腦，一部分全腦分離出雙側(cè)海馬置于2 ml離心管標(biāo)記號(hào)后-80 ℃冰箱備用，一部分全腦冠狀位用刀片切厚度約2～2.5 mm，剔除腦干、小腦部分，分別標(biāo)記好后置于組織固定液中備用；摘除的脾臟用預(yù)冷等滲鹽水沖凈，去除其表面筋膜后用濾紙吸水稱重后，切取一部分置于2 ml離心管標(biāo)記好后-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；剩余部分置?%多聚甲醛中固定。

1.2.4 梗塞灶TTC染色：大鼠麻醉后斷頭，迅速取出全腦，將腦組織置-20 ℃冰箱5～10 min后取出，置于新鮮冰塊上，切去額極1 mm，間隔2 mm作大腦連續(xù)冠狀切片，立即置于2%的TTC染液中，37 ℃水浴鍋避光孵育15～20 min。取出后可見正常腦組織呈紅色，梗塞區(qū)未被染色而呈白色。

1.2.5 神經(jīng)功能缺損評(píng)分：按照Longa 5分法對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。0分為無神經(jīng)功能損傷癥狀及體征；1分為不能夠完全伸展左側(cè)前爪；2分為爬行時(shí)向左偏斜或轉(zhuǎn)圈，有追尾現(xiàn)象；3分為爬行時(shí)身體向左側(cè)傾倒；4分為不能夠自發(fā)爬行，意識(shí)喪失。根據(jù)評(píng)分結(jié)果，納入1～3分的大鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，若各組出現(xiàn)樣本量不足，及時(shí)給予缺失組及時(shí)間點(diǎn)等量補(bǔ)充。

1.2.6 HE染色：每個(gè)大鼠樣本隨機(jī)選取腦切片進(jìn)行HE染色，首先脫蠟至水，再用蘇木素染色6 min，浸入分化液30 s后再用自來水浸泡15 min，然后用伊紅染色2 min，自來水浸泡2～5 min后再用5%乙醇脫水至透明，最后封片、采集圖像。

1.2.7 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)大鼠腦及脾臟勻漿中RORγt、白介素17(Interleukin-17，IL-17)含量：將組織取出解凍后，加入PBS溶液用勻漿機(jī)勻漿；取出96孔板，分別加入100 μl稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品和稀釋好的樣品，37 ℃孵育90 min；吸干酶標(biāo)板內(nèi)反應(yīng)液，加生物素標(biāo)記抗體，37 ℃孵育60 min，1×洗滌緩沖液洗滌3次，每次浸泡1 min，加過氧化物酶標(biāo)記的親和素(ABC)，37 ℃孵育30 min，1×洗滌緩沖液洗滌5次，每次浸泡90 s，加入底物(TMB)，37 ℃孵育避光孵育20 min，加終止液，輕柔混勻；根據(jù)酶標(biāo)儀器操作方法，上機(jī)檢測(cè)OD值(450 nm處)，通過ELISA Cale軟件計(jì)算獲得所測(cè)物質(zhì)濃度。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠TTC染色結(jié)果 假手術(shù)組大鼠均未閉塞其大腦中動(dòng)脈，故其TTC染色結(jié)果為明顯紅色，模型組及通脈舒絡(luò)各劑量組均行造模術(shù)，故其缺血區(qū)顯示為白色。

2.2 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較 見表1。分別在再灌注1、3、7、14 d后進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。假手術(shù)組大鼠未閉塞大腦中動(dòng)脈，故其神經(jīng)功能評(píng)分為0分。模型組神經(jīng)功能缺損評(píng)分與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在1 d時(shí)的神經(jīng)功能缺損評(píng)分中，通脈舒絡(luò)各劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。在3、7、14 d的神經(jīng)功能缺損評(píng)分中，通脈舒絡(luò)各劑量組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；其中通脈舒絡(luò)中劑量組在各時(shí)間點(diǎn)的評(píng)分最低，與通脈舒絡(luò)低劑量組、通脈舒絡(luò)高劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。

表1 各時(shí)間點(diǎn)各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較(分)

2.3 各組大鼠缺血腦組織病理形態(tài)變化 各個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察到的假手術(shù)組大鼠腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列層次分明，未見缺血或炎癥細(xì)胞損傷現(xiàn)象，細(xì)胞密度大，細(xì)胞核呈類圓形，核膜清晰，核仁明顯。

再灌注1 d時(shí)模型組及通脈舒絡(luò)各劑量組海馬CA1區(qū)表現(xiàn)為組織結(jié)構(gòu)紊亂，呈現(xiàn)出區(qū)域性溶解、腫脹等壞死特征，空泡樣改變明顯，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象明顯(圖1)。再灌注3 d時(shí)病理變化較1 d明顯，而通脈舒絡(luò)中劑量組的病理改變最少(圖2)。再灌注7 d時(shí)通脈舒絡(luò)各劑量組缺血海馬區(qū)正常神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目明顯減少，核固縮、溶解，胞間可見大小不等空泡；再灌注14 d時(shí)通脈舒絡(luò)各劑量組海馬CA1區(qū)空泡數(shù)量驟增，壞死組織已被清除。再灌注7、14 d時(shí)，通脈舒絡(luò)各劑量組缺血區(qū)病理改變較模型組輕，炎癥細(xì)胞損傷現(xiàn)象有所緩解，細(xì)胞排列較整齊，間質(zhì)水腫程度減輕，細(xì)胞皺縮畸形、胞核固縮深染等表現(xiàn)明顯減輕，其中通脈舒絡(luò)中劑量組改善較為顯著(圖3、4)。

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：通脈舒絡(luò)低劑量組；D：通脈舒絡(luò)中劑量組；E：通脈舒絡(luò)高劑量組圖1 各組大鼠再灌注1 d海馬CA1區(qū)病理學(xué)形態(tài)(HE染色，×400)

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：通脈舒絡(luò)低劑量組；D：通脈舒絡(luò)中劑量組；E：通脈舒絡(luò)高劑量組圖2 各組大鼠再灌注3 d海馬CA1區(qū)病理學(xué)形態(tài)(HE染色，×400)

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：通脈舒絡(luò)低劑量組；D：通脈舒絡(luò)中劑量組；E：通脈舒絡(luò)高劑量組圖3 各組大鼠再灌注7 d海馬CA1區(qū)病理學(xué)形態(tài)(HE染色，×400)

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：通脈舒絡(luò)低劑量組；D：通脈舒絡(luò)中劑量組；E：通脈舒絡(luò)高劑量組圖4 各組大鼠再灌注14 d海馬CA1區(qū)病理學(xué)形態(tài)(HE染色，×400)

2.4 各組大鼠海馬組織勻漿中RORγt、IL-17含量比較 見表2、3。各組大鼠造模后海馬組織RORγt、IL-17含量均高于假手術(shù)組，再灌注1 d時(shí)模型組、通脈舒絡(luò)低劑量組、通脈舒絡(luò)中劑量組、通脈舒絡(luò)高劑量組海馬組織RORγt、IL-17含量均高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。再灌注3 d時(shí)造模大鼠海馬組織RORγt、IL-17含量升至高峰。再灌注7、14 d模型組、通脈舒絡(luò)低劑量組、通脈舒絡(luò)中劑量組、通脈舒絡(luò)高劑量組海馬組織RORγt、IL-17含量均有所下降，且通脈舒絡(luò)中劑量組大鼠海馬內(nèi)RORγt、IL-17含量最低，與通脈舒絡(luò)低劑量組、通脈舒絡(luò)高劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。

表2 各組大鼠海馬組織RORγt含量比較(ng/ml)

表3 各組大鼠海馬組織IL-17含量比較(pg/ml)

2.5 各組大鼠脾臟組織勻漿中RORγt、IL-17含量比較 見表4、5。與假手術(shù)組比較，造模成功大鼠的脾臟RORγt、IL-17含量均較高。再灌注1、3、7、14 d模型組、通脈舒絡(luò)低劑量組、通脈舒絡(luò)中劑量組、通脈舒絡(luò)高劑量組脾臟RORγt、IL-17含量均高于假手術(shù)組脾臟RORγt、IL-17含量(均P<0.01)；其中再灌注3 d時(shí)含量達(dá)高峰。通脈舒絡(luò)中劑量組大鼠脾臟中RORγt、IL-17含量最低，與通脈舒絡(luò)低劑量組、通脈舒絡(luò)高劑量組大鼠脾臟中RORγt、IL-17含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。

表4 各組大鼠脾臟組織RORγt含量比較(ng/ml)

表5 各組大鼠脾臟組織IL-17含量變化(pg/ml)

3 討 論

缺血性腦卒中屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，病位在腦，與氣血密切相關(guān)[8]。中醫(yī)認(rèn)為氣血是大腦生長(zhǎng)發(fā)育及功能活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)[9]，腦為元神之府，血液是神志活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，大腦必須通過氣血的溫煦、濡養(yǎng)，才能發(fā)揮正常的生理功能，所以缺血性中風(fēng)的基本病機(jī)是氣血失調(diào)。清代醫(yī)家王清任創(chuàng)立“氣虛血瘀”理論，開益氣活血化瘀法治療中風(fēng)病之先河，其創(chuàng)立的補(bǔ)陽(yáng)還五湯，成為治療中風(fēng)氣虛血瘀證的經(jīng)典名方[10]。國(guó)醫(yī)大師張學(xué)文認(rèn)為因虛致瘀，瘀阻脈絡(luò)是中風(fēng)發(fā)病的根本，瘀血貫穿中風(fēng)之始終，并根據(jù)缺血性中風(fēng)的發(fā)病機(jī)制及長(zhǎng)期臨床實(shí)踐提出氣虛血瘀證是缺血性中風(fēng)的常見證型[11-12]。其課題組經(jīng)過多年的研究和探索制訂了益氣養(yǎng)血、活血化瘀、通脈舒絡(luò)的治則，并在此基礎(chǔ)上，擬定了黃芪、丹參、赤芍、川芎、地龍、紅花、當(dāng)歸、水蛭為成分的通脈舒絡(luò)方，由該方制成的通脈舒絡(luò)膠囊是陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院的協(xié)定處方制劑，在治療缺血性中風(fēng)氣虛血瘀證中取得了較好療效。中醫(yī)理論認(rèn)為氣行則血行，氣滯則血瘀，方中用大劑量黃芪補(bǔ)中益氣，為君藥；丹參活血祛瘀，赤芍清熱涼血、散瘀止痛，川芎活血行氣、祛風(fēng)止痛，地龍清熱、通絡(luò)，水蛭破血通經(jīng)、逐瘀消癥，紅花活血化瘀，通脈舒絡(luò)共為臣藥；佐以當(dāng)歸補(bǔ)血活血，改善缺血性中風(fēng)血虛癥狀；全方共奏益氣養(yǎng)血、活血化瘀、通脈舒絡(luò)之功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芪主要成分黃芪甲苷[13]、丹參提取物丹酚酸A[14-15]、當(dāng)歸[16-17]等的有效成分對(duì)機(jī)體有抗炎、抗氧化、抗興奮性毒性和免疫調(diào)節(jié)作用，可活化T淋巴細(xì)胞，加速脾細(xì)胞分裂，使T細(xì)胞功能增強(qiáng)。

T淋巴細(xì)胞通過參與適應(yīng)性免疫系統(tǒng)影響缺血性卒中發(fā)生，具有調(diào)節(jié)免疫的作用，可分為CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞和CD4+輔助性T(Th)細(xì)胞，其中Th17主要通過表達(dá)促炎細(xì)胞因子來介導(dǎo)腦缺血后炎癥反應(yīng)[18]。Th17細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子是RORγt，可誘導(dǎo)和編碼IL-17A和IL-17F的基因表達(dá)。Th17通過產(chǎn)生多種細(xì)胞因子發(fā)揮作用，IL-17是其最重要的效應(yīng)因子。張立堂等[19]研究表明，急性腦梗死患者外周血中Th17細(xì)胞及IL-17水平均高于正常，說明Th17細(xì)胞可能參與腦梗死的發(fā)病過程。劉貴香等[20]發(fā)現(xiàn)腦梗死患者外周血中存在 IL-17A、IL-23、 IL-6、RORγt、Th17 的增高，說明Th17細(xì)胞參與了缺血性腦卒中的病理生理過程。脾臟作為主要的外周免疫器官，在腦缺血誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)中也起著重要作用[21]。

本研究中以通脈舒絡(luò)膠囊為給藥組，觀察大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分變化、腦組織病理改變，并檢測(cè)腦、脾臟RORγt、IL-17指標(biāo)含量的變化。通脈舒絡(luò)膠囊治療3 d以后，各給藥組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分較模型組開始降低，其中通脈舒絡(luò)中劑量組評(píng)分降低最為明顯，說明通脈舒絡(luò)膠囊可以減緩缺血性中風(fēng)大鼠神經(jīng)功能缺損程度，具有神經(jīng)保護(hù)作用。缺血性腦卒中后，腦組織內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞逐步發(fā)生變性、壞死、腫脹及溶解，最終導(dǎo)致腦組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)破壞。給藥7 d后，各劑量組腦組織缺血區(qū)病理改變較模型組減輕，炎癥細(xì)胞損傷現(xiàn)象有所緩解，細(xì)胞排列較整齊，間質(zhì)水腫程度減輕，細(xì)胞皺縮畸形、胞核固縮深染等表現(xiàn)明顯減輕。由此可知，通脈舒絡(luò)膠囊能改善缺血腦組織神經(jīng)細(xì)胞的炎性損傷。模型組腦及脾臟RORγt、IL-17含量在造模后逐漸升高，于3 d后達(dá)到頂峰，7、14 d的含量較假手術(shù)組仍有升高，說明Th17不僅參與了缺血性腦卒中發(fā)展過程，且隨著再灌注時(shí)間延長(zhǎng)Th17比例也在發(fā)生變化，腦缺血損傷的同時(shí)，局部及外周免疫炎癥反應(yīng)也被激活，而當(dāng)給予通脈舒絡(luò)膠囊治療后，各時(shí)間點(diǎn)缺血大鼠腦及脾臟內(nèi)RORγt、IL-17含量較模型組降低，其中通脈舒絡(luò)中劑量組改變最為明顯，進(jìn)一步說明通脈舒絡(luò)膠囊能降低大鼠缺血腦組織局部及外周免疫器官脾臟內(nèi)的Th17細(xì)胞比例，改善缺血性腦卒中引起的Th17細(xì)胞亞群功能的失衡狀態(tài)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，通脈舒絡(luò)膠囊通過抑制腦缺血后局部及外周的炎癥反應(yīng)，抑制炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本研究旨在探究Th17細(xì)胞在缺血性中風(fēng)發(fā)展過程中的變化，但實(shí)驗(yàn)觀察的時(shí)間點(diǎn)不夠細(xì)化，在接下來的研究中擬增加更多的時(shí)間點(diǎn)，并進(jìn)行通脈舒絡(luò)膠囊對(duì)抗炎因子影響的觀察。