朱文瀟,王向陽,劉永輝,孔 亮,崔宏勛

(河南省洛陽正骨醫(yī)院，河南 鄭州 450016)

近年來，骨折已經(jīng)成為影響我國居民健康的重要因素，給社會、家庭造成沉重負擔(dān)[1]。中醫(yī)學(xué)認為，骨折的治療需內(nèi)外兼治，正如“肢體損于外，則氣血傷于內(nèi)，營衛(wèi)有所不慣，臟腑由之不和”[2]。平樂三七接骨丸是平樂郭氏正骨治療骨折的傳統(tǒng)藥物，該方由三七、乳香、沒藥、當(dāng)歸、自然銅等10余味中藥組成，臨床應(yīng)用多年，能顯著緩解患者骨折后疼痛及縮短愈合時間，療效較好，但其具體機制尚不明確。本研究將三七接骨丸作用于標(biāo)準(zhǔn)動物骨折模型，觀察三七接骨丸對骨折愈合過程中血清及骨折端骨痂轉(zhuǎn)化生長因子(Transforming growth factor-β,TGF-β)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic proteins，BMPs)表達的調(diào)控，從細胞分子水平初步闡釋三七接骨丸促進骨折愈合的作用機制，為其臨床應(yīng)用提供進一步的理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：普通級新西蘭大白兔[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2017-0011]72只由南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供，雌雄各半，平均體重(2.5±0.5)kg。全部動物在河南省中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心進行常規(guī)喂養(yǎng)，自由進食飲水，室溫25 ℃，濕度50%～80%。

1.1.2 主要試劑及儀器：TGF-β1試劑盒(上海雅吉生物公司)，BMP試劑盒(上海科興生物科技公司)，總RNA抽提試劑(Takara生物公司)。熒光PCR儀(型號CFX Connect，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)，超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(型號ChemiDocTM XRS+，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)，全自動生化分析儀(型號AU5800，Beckman Coulter公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗藥物：平樂三七接骨丸(豫藥制字Z04030007)、骨肽片(國藥準(zhǔn)字H20058927)均由河南省洛陽正骨醫(yī)院藥房統(tǒng)一提供。

1.2.2 實驗動物模型建立：依據(jù)參考文獻建立兔橈骨骨折模型[3]。所有動物術(shù)前24 h禁食，自由飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后稱重，采用0.3%戊巴比妥鈉30 mg/kg耳緣靜脈注射麻醉，麻醉后于兔雙側(cè)前肢備皮，將兔以俯臥位固定四肢，常規(guī)碘伏消毒，鋪巾，沿橈骨中下1/3縱行切開暴露橈骨，用骨鋸在橈骨中下1/3交界處旋前圓肌遠端止點處造成約3 mm的橫斷骨折，不固定，然后用0.9%氯化鈉溶液將切口沖洗干凈，逐層縫合。術(shù)后分籠常規(guī)飼養(yǎng)，術(shù)后肌肉注射青霉素預(yù)防感染，40 IU/次，1次/d，連續(xù)注射3 d。

1.2.3 動物分組與給藥：將成功建立骨折模型的72只新西蘭兔隨機分為空白對照組、骨肽對照組、中藥實驗組，每組24只。各組飼養(yǎng)于相同環(huán)境中，均于造模術(shù)后第2天開始給藥，給藥劑量為家兔對人等效劑量的2倍?？瞻讓φ战M給予0.9%氯化鈉溶液灌胃，骨肽對照組給予骨肽片溶液15 mg/kg灌胃，中藥實驗組給予三七接骨丸溶液0.2 g/kg灌胃。各組給藥頻次均為2 次/d，持續(xù)灌胃8周。

1.2.4 ELISA法檢測血清TGF-β1、BMP-2水平：在術(shù)后1、2、4、8周四個時間點每組隨機抽取6只兔，門靜脈采血5 ml，3000 r/min，離心15 min，取上清液冷凍保存待測。采用酶標(biāo)分析儀以ELISA法檢測血清TGF-β1、BMP-2水平，在450 nm波長下測量樣品的吸光度(A值)，檢測完成后，用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與A值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的A值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

1.2.5 RT-PCR檢測骨組織TGF-β1、BMP-2 mRNA表達水平：在術(shù)后第1、2、4、8周每組于兔橈骨折端取樣1 cm，進行PCR檢測時，從標(biāo)本上取骨痂組織200 mg進行充分研磨。將骨組織研磨充分后，加入Trizol進行裂解，提取骨組織中總RNA后依照試劑盒說明進行反轉(zhuǎn)錄，以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法進行相對定量分析，計算TGF-β1、BMP-2 mRNA的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.6 Western blot法檢測骨組織TGF-β1、BMP-2蛋白表達：將骨組織放入研缽中充分研磨，全蛋白提取試劑盒提取蛋白質(zhì)，利用BCA試劑盒進行蛋白濃度測定。SDS-PAGE分離蛋白后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉過夜,分別加入一抗和二抗孵育,以GAPDH為內(nèi)參，用Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t法；P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組不同時間點血清TGF-β1水平比較 見表2。三組血清TGF-β1水平均在術(shù)后第2周達到峰值，中藥實驗組TGF-β1峰值穩(wěn)定至術(shù)后4周開始下降。術(shù)后1、2、4、8周，中藥實驗組、骨肽對照組血清TGF-β1水平均高于對空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；中藥實驗組與骨肽對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組不同時間點血清TGF-β1水平比較(ng/ml)

2.2 各組不同時間點血清BMP-2水平比較 見表3。中藥實驗組血清BMP-2濃度在術(shù)后第2周達到峰值，峰值穩(wěn)定至4周后開始下降，空白對照組血清BMP-2濃度峰值為術(shù)后第4周。術(shù)后1、2、4、8周，中藥實驗組血清BMP-2水平均高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；中藥實驗組與骨肽對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

表3 各組不同時間點血清BMP-2水平比較(ng/ml)

2.3 各組不同時間點骨組織TGF-β1 mRNA表達比較 見表4。三組TGF-β1 mRNA表達均在術(shù)后2周達到峰值。術(shù)后1、2、4、8周，中藥實驗組TGF-β1 mRNA均高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；中藥實驗組與骨肽對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

表4 各組不同時間點骨組織TGF-β1 mRNA表達比較

2.4 各組不同時間點骨組織BMP-2 mRNA表達比較 見表5。中藥實驗組與骨肽對照組BMP-2 mRNA表達均在術(shù)后2周達到峰值，空白對照組峰值出現(xiàn)在術(shù)后4周。術(shù)后1、2、4、8周，中藥實驗組、骨肽對照組BMP-2 mRNA表達均高于空白對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，中藥實驗組與骨肽對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

表5 各組不同時間點骨組織BMP-2 mRNA表達比較

2.5 各組不同時間點骨組織TGF-β1蛋白表達比較 見表6(圖1)。各組骨組織TGF-β1蛋白表達均在術(shù)后2周達到峰值。術(shù)后1、2、4、8周，中藥實驗組、骨肽對照組TGF-β1蛋白表達水平均高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；中藥實驗組與骨肽對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

表6 各組不同時間點骨組織TGF-β1蛋白表達比較

圖1 各組骨組織TGF-β1蛋白表達電泳圖

2.6 各組兔骨折模型不同時間點骨組織BMP-2蛋白表達比較 見表7(圖2)。中藥實驗組與骨肽對照組兔骨組織BMP-2蛋白表達均在術(shù)后2周達到峰值，然后逐漸降低，空白對照組兔骨組織BMP-2表達峰值出現(xiàn)在術(shù)后第4周。術(shù)后1、2、4、8周，中藥實驗組、骨肽對照組兔骨組織BMP-2蛋白表達均高于空白對照組兔骨組織BMP-2蛋白表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。術(shù)后1、2、4、8周，中藥實驗組與骨肽對照組兔骨組織BMP-2蛋白表達比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

表7 各組不同時間點骨組織BMP-2蛋白表達比較

圖2 各組骨組織BMP-2蛋白表達電泳圖

3 討 論

骨折是臨床常見病和多發(fā)病，骨折愈合是復(fù)雜的組織變化過程，涉及一系列不同的細胞活動，包括細胞增殖、分化及細胞外基質(zhì)合成等[4]。據(jù)統(tǒng)計，約5%～10%的骨折患者由各種原因發(fā)生骨折延遲愈合或不愈合[5-6]。因此，探究骨折愈合機制，提高骨折愈合率是骨折治療的關(guān)鍵?，F(xiàn)階段，骨折的治療方法包括骨移植、甲狀旁腺激素注射、干細胞療法、低強度脈沖超聲等，以上方法存在創(chuàng)傷較大、治療費用昂貴及潛在不良反應(yīng)等問題[7-10]。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)細胞因子在骨折愈合過程扮演極為重要的角色，多種細胞及細胞因子共同發(fā)揮作用，促進骨細胞再生，調(diào)控骨折愈合的全過程，同時影響骨折愈合質(zhì)量和時間[11]。其中代表性的細胞因子包括TGF-β、BMPs，其在調(diào)節(jié)骨細胞的譜系分化、生長增殖、凋亡等方面發(fā)揮重要作用，TGF-β1在TGF-β家族中活性最強，所占比例最高，對骨組織修復(fù)與骨重建具有重要作用[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1在骨折早期通過血小板釋放啟動修復(fù)過程，能介導(dǎo)骨膜間充質(zhì)細胞增殖分化，促進成骨細胞和成軟骨細胞增殖，誘導(dǎo)膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)的成骨，促進血管形成，發(fā)揮修復(fù)功能[14]。BMP是一種多功能生長因子，在軟骨發(fā)育、骨形成中發(fā)揮重要作用，目前被認為是最強的骨誘導(dǎo)分化因子[15-16]。BMP-2在骨形成早期能誘導(dǎo)血管周圍游走的、未分化的間充質(zhì)細胞分化增殖為成骨細胞或成軟骨細胞，并決定間充質(zhì)細胞分化方向[17-18]。

中醫(yī)學(xué)治療骨折歷史悠久，近年來多項研究證實中醫(yī)藥在改善骨折癥狀、促進骨折愈合方面效果較好[19]。中醫(yī)學(xué)認為，骨折的核心病機為外傷傷及氣血，氣血運行受阻淤積，引起局部或全身癥狀，如疼痛、腫脹等，因此骨折的愈合是“瘀祛、新生、骨合”的過程[20-22]?！侗孀C錄》曰：“內(nèi)治之法，必須以活血化瘀為先，血不活則瘀不能祛，瘀不祛則骨不能接”，這與平樂郭氏正骨第五代傳人高云峰所提倡的“腫不消則骨不長，瘀不祛則新血不能生”理念不謀而合。三七接骨丸以祛瘀活血接骨為治療總則，方中三七為君藥,具有化瘀止血、消腫定痛的功效，乳香、沒藥為臣藥，活血止痛、消腫生肌，當(dāng)歸補血活血，牡丹皮祛瘀止痛，茯苓健脾安神，自然銅接骨續(xù)筋[23-25]，諸藥合用，通補兼施，溫涼并濟，破而不傷正氣，補而不留瘀滯，諸藥各司其能，共奏祛瘀活血、消腫止痛、續(xù)筋接骨之功效，符合中醫(yī)學(xué)“瘀祛、新生、骨合”理論，在骨折愈合早、中期具有重要作用[26-28]。張虹等[29]研究發(fā)現(xiàn)，三七接骨丸能夠活血行氣，有效改善骨折患者疼痛、腫脹等癥狀。秦月鵬等[30]應(yīng)用三七接骨丸治療股骨頸骨折發(fā)現(xiàn)，三七接骨丸能夠刺激骨折處的骨痂生長，縮短骨折愈合時間。本研究結(jié)果顯示，三組動物血清TGF-β1水平及骨組織TGF-β1 mRNA水平均于術(shù)后2周達到峰值，術(shù)后1、2、4、8周，中藥實驗組血清TGF-β1水平及骨組織TGF-β1 mRNA和蛋白水平均優(yōu)于空白對照組，中藥實驗組與骨肽對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明三七接骨丸、骨肽片均能夠在骨折早期提高TGF-β1表達，加速骨折愈合。中藥實驗組與骨肽對照組骨組織BMP-2蛋白表達峰值出現(xiàn)在術(shù)后2周，空白對照組則出現(xiàn)在術(shù)后4周，且術(shù)后1、2、4、8周，中藥實驗組指標(biāo)均優(yōu)于空白對照組，說明三七接骨丸能夠促進骨折愈合過程中BMP-2蛋白表達。以上結(jié)果說明三七接骨丸作用于兔橈骨骨折模型能夠促進TGF-β1/BMP通路表達，在骨愈合過程中誘導(dǎo)相關(guān)基因、蛋白早期表達，增加表達量，加速骨愈合。

綜上所述，三七接骨丸通過激活TGP-β/BMP信號通路，誘導(dǎo)TGF-β1、BMP-2蛋白早期表達，并增加其表達量，從而促進骨折愈合。但是臨床骨折愈合機制并不局限于單一信號通路，因此對于中藥促進骨折愈合的作用機制仍需更深入的研究。