劉宗義，朱付平，李武平

(湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007)

肢體缺血-再灌注損傷(Limb ischemic reperfusion injury，LI-RI)是肢體缺血損傷和再灌注損傷的合稱，LI-RI多繼發(fā)于擠壓綜合征、動脈栓塞、斷肢再植、動脈損傷等疾病，致殘率、病死率較高，不僅會導致患肢出現(xiàn)不可逆性肌肉壞死征象(小腿肌肉僵硬、腫脹、皮膚壞死等)，血流再灌注會加重損傷，誘發(fā)全身重要器官衰竭，甚至危及生命。目前，醫(yī)學界對于LI-RI的防治措施主要有預防性的筋膜切開術[1]、高壓氧治療[2]、基因治療[3]等，但治療成本較高，療效不穩(wěn)定，而且治療LI-RI的具體作用機制尚未完全闡明。長期臨床實踐和動物實驗研究表明，中醫(yī)藥在防治LI-RI方面具有獨特優(yōu)勢[4]，諸多中藥中的有效成分在缺血-再灌注損傷(Ischemia reperfusion injury，IRI)防治中具有廣闊前景[5]。課題組前期實驗研究發(fā)現(xiàn)，活血化瘀類藥物可通過調控Wnt/Ca2+信號途徑下調三磷酸肌醇受體(IP3R)、Wnt5a、骨骼肌鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)等蛋白表達從而減輕LI-RI[4，6]。

長鏈非編碼RNA H19(Long non-coding RNA H19，LncRNA H19)是一個長度為3.0 kb具有高度進化保守性的LncRNA，作為最早發(fā)現(xiàn)的印記基因，LncRNA H19在肢體缺血-再灌注損傷中發(fā)揮重要作用。研究顯示，LncRNA H19的異常表達與小鼠精原細胞(GC-1)缺血再灌注損傷密切相關[7],在機體重要臟器的缺血-再灌注損傷性疾病的病理機制研究中，顯示LncRNA H19是IRI的上游關鍵分子，通過調控NF-κB通路表達降低下游炎癥因子表達，發(fā)揮著重要的生物調控功能[7-9]。NF-κB 信號通路是 Wnt/Ca2+信號通路的主要小通路，可啟動和調控 IL-1、TNF-α等炎癥因子轉錄，而炎癥因子又能反向推進NF-κB信號通路中蛋白的表達，誘導加重炎癥反應[10]。課題組前期從Wnt/Ca2+信號通路中的蛋白分子相互關系角度研究，證實桃紅四物湯能調控通路中的關鍵蛋白、降低鈣超載、機體炎癥反應，而NF-κB通路作為Wnt/Ca2+信號通路的關鍵小通路，其與LI-RI發(fā)生的相互關系尚未闡明，本實驗著重探討上游分子LncRNA H19與NF-κB通路間的調控關系，尋找LI-RI 損傷中骨骼肌細胞損傷的關鍵分子靶點，深入研究肢體缺血-再灌注損傷中骨骼肌細胞損傷的分子病理機制并予桃紅四物湯干預，以多層面豐富LI-RI病理機制，為中醫(yī)藥防治LI-RI提供科學理論依據(jù)與新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：雄性SD大鼠78只，SPF級，8～10周齡，體重220～250 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物實驗倫理編號(LLBH-202103050001)、動物生產(chǎn)許可證號[SCXK(湘)2019-0004]、實驗單位使用許可證編號[SYXK(湘)2019-0009]。所有大鼠均喂養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心，相對濕度保持在50%～70%，溫度20～25 ℃，光照12 h/d，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.1.2 實驗藥物：桃紅四物湯由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑科利用現(xiàn)代技術工藝加工制成。組成藥物：桃仁、紅花各15 g，川芎、熟地、當歸、赤芍各10 g。根據(jù)藥物所含主要有效成分的理化性質，確定桃紅四物湯的制備工藝路線：桃仁、紅花、川芎、熟地、當歸、赤芍六味藥物提取，水提液減壓濃縮至相對密度1.08～1.12(熱測溫度 60 ℃)，加入苯甲酸鈉使其溶解，分裝，即得。桃紅四物湯原藥物濃度為0.15 g/ml(規(guī)格250 ml/瓶，批號20201215)。

1.1.3 主要試劑與儀器：大鼠LncRNA H19阻斷劑hsa-miR-199a-5p miRNA Inhibitor(批號CIH0463，美國Cohesion公司)，大鼠NF-κB-p65 WB抗體(批號66535-1-Ig，Proteintech公司)，mRNA逆轉錄試劑盒(批號CW2569，中國北京康為世紀公司)，miRNA逆轉錄試劑盒(批號CW2141，北京康為世紀公司)，熒光定量RCP儀(型號PIKOREAL96)，臺式冷凍離心機(型號H1650R，湖南湘儀公司)，電泳儀(型號DYY-6C，北京六一公司)，BD-180S雙門冷凍柜(型號BC/BD-318HD，青島海爾冰箱通用有限公司)；Image Pro plus version 6.0(美國Media Cybernetics公司)；酶標儀(型號PO-9622A，上海培奧分析儀器有限公司)；實時PCR擴增儀(型號7500，美國ABI公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與給藥：按隨機數(shù)字表將78只SD大鼠分為空白組、模型組、LncRNA H19阻斷劑組、桃紅四物湯組，空白組6只，其余每組24只。桃紅四物湯組于缺血前3 d開始予桃紅四物湯灌胃，每天灌胃2次，缺血前2 h再給藥1次，除空白組外每只動物共灌胃7次，給藥劑量根據(jù)體質量通過“體表面積-劑量換算法”計算得出，依據(jù)課題組前期動物實驗結果，桃紅四物湯中劑量(0.15 g/ml)為最佳藥效濃度[11]，即每次灌胃給藥劑量為2 ml，未采用桃紅四物湯灌胃的其余各組在給藥相同時間點給予等體積蒸餾水灌胃。阻斷劑組造模前2 h予尾靜脈注射LncRNA H19基因阻斷劑3.75 mg/kg[12-13]。模型組、桃紅四物湯組在同樣時間點給予相同體積0.9%氯化鈉溶液尾靜脈注射，每日固定時間點給藥2次，除空白組外其余各組大鼠連續(xù)給藥7次。

1.2.2 大鼠LI-RI模型構建：所有動物置恒溫恒濕和自然光照的動物房中適應性飼養(yǎng)1周?？瞻捉M動物不造成肢體缺血-再灌注損傷，余下三組大鼠參照前期實驗方法造模[14]，用口腔正畸橡皮筋和塑料套管阻斷大鼠左后肢血流4 h，再解除患肢橡皮筋和扎帶阻斷恢復下肢血液灌注，制備LI-RI模型。阻斷大鼠左后肢血流4 h后，大鼠趾掌變得蒼白，局部皮膚青紫、皮溫發(fā)涼，患肢活動明顯受限，恢復患肢血流灌注后，大鼠趾掌恢復紅潤溫暖，提示造模成功。

1.2.3 實驗動物取材：在血流再灌注0、2、4、8 h 時間點，每組隨機選取6只大鼠(除空白組6只大鼠于0 h全部選取)，用3%戊巴比妥鈉1.5 ml/kg腹腔注射麻醉，麻醉成功后，將大鼠固定在手術臺上，用脫毛膏脫去左后肢毛發(fā)備皮，絡合碘體表消毒后75%酒精脫碘，沿左側后肢縱軸方向切開皮膚、筋膜，暴露左下肢腓腸肌，每只大鼠患肢截取腓腸肌組織300 mg，用0.9%氯化鈉溶液洗凈，干燥，刀片切割后裝入保存管中，迅速置于-70 ℃超低溫冰箱中保存。

1.2.4 HE染色：取0.25 mg缺血-再灌注4 h大鼠腓腸肌組織，用4%中性甲醇溶液固定腓腸肌組織，4 μm厚度石蠟切片后60 ℃恒溫，烤片12 h，切片脫蠟至水，將切片用蘇木素染1 min后用蒸餾水沖洗，PBS返藍后再用伊紅染30 s，再次用蒸餾水沖洗并用酒精脫水處理，置于二甲苯中10 min后封片，染色后在顯微鏡下觀察各組大鼠腓腸肌組織炎癥反應及形態(tài)學變化。

1.2.5 DAPI熒光染色：取0.25 mg再灌注4 h大鼠腓腸肌組織，60 ℃烤片12 h，切片，脫蠟至水，DAPI工作液37 ℃染核10 min，PBS沖洗，緩沖甘油封片，避光存放，熒光顯微鏡電腦采集，每個樣本取5個視野采集，倍數(shù)為400倍。骨骼肌細胞凋亡率=(細胞核濃縮細胞數(shù)÷細胞總數(shù))×100%。

1.2.6 RT-qPCR檢測：取0.25 mg大鼠腓腸肌組織，采用Trizol法提取骨骼肌總RNA，將腓腸肌組織加液氮充分研磨，室裂解5 min，離心后取上層液相加入20～30 μl無菌無酶水溶解沉淀，紫外分光光度計測定濃度?；靹颍x心后孵育靶基因。再次離心，冷卻，以GAPDH為內參，采用SYBR法測定目標基因相對表達量。引物序列見表1。

表1 LncRNA H19、NF-κB-p65、GAPDH引物序列

1.2.7 Western blot法檢測：剪取0.025 g大鼠腓腸肌組織，預冷PBS洗組織，加入裂解液反復研磨，裂解后離心，灌膠，封膠。取50 μl的5×loading buffer加入蛋白上清中混勻，沸水煮5 min，電泳電壓設定為恒定78 V，時間2.5 h，Marker 2 μl點入第1孔，其余每孔點入10～30 μl已變性蛋白上樣，轉膜電流300 mA恒定，將膜取出放入1×PBST中洗1次，將膜浸入后配制好的5 %脫脂奶粉中室溫放置1 h，4 ℃過夜。再按照1∶2000比例稀釋，將膜與一抗一起孵育，室溫放置90 min，按照1∶5000比例用1×PBST稀釋HRP標記的二抗與膜共同室溫孵育90 min，ECL顯色曝光、成像。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計學軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)使用Graph Pad Prism 8軟件制圖分析。各組間比較采用單因素方差分析，若各組數(shù)據(jù)滿足正態(tài)性、方差齊性，則采用重復測量資料方差分析，若方差不齊，則用多因素方差分析比較各組不同時間段組間LncRNA H19、NF-κB-p65表達差異；P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠HE染色結果比較 見圖1。染色后顯微鏡觀察，空白組腓腸肌纖維排列整齊，結構清晰，呈長索狀，肌漿豐富，肌纖維表面有多個緊密附著的細胞核，核大小、著色均勻，未見異常改變。除空白組外，其余各組骨骼肌均可見不同程度的破壞和異常改變，隨著再灌注時間的延長，各組肌肉組織破壞和形態(tài)學改變越發(fā)明顯。模型組缺血-再灌注后骨骼肌纖維間縫隙增大，少量肌細胞破裂，細胞內可見明顯炎癥物質浸潤；桃紅四物湯組、LncRNA H19阻斷劑組肌纖維輕度破壞，細胞受損腫大畸形，排列整齊，肌纖維間縫隙稍增大，炎癥浸潤不明顯，較模型組減輕。

A：空白組；B：模型組；C：LncRNA H19阻斷劑組；D：桃紅四物湯組圖1 各組大鼠缺血-再灌注4 h后腓腸肌形態(tài)比較(HE染色，×400)

2.2 各組大鼠DAPI熒光染色及腓腸肌細胞凋亡率比較 見表2(圖2)?？瞻捉M腓腸肌細胞架構完整無變形，細胞核呈圓形或橢圓形，核外形、染色均勻。除空白組外，其余組均可見數(shù)量不等的凋亡小體，即細胞核碎裂成大小不等的圓形小體，核邊緣不規(guī)則，被細胞膜包繞。模型組細胞凋亡率高于空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組比較，LncRNA H19阻斷劑組、桃紅四物湯組細胞著色較重，核濃縮呈新月形，聚集于核膜一邊，但兩組細胞凋亡率均低于模型組，且桃紅四物湯組低于LncRNA H19阻滯劑組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠缺血-再灌注4 h后腓腸肌細胞凋亡率比較(%)

A：空白組；B：模型組；C：LncRNA H19阻斷劑組；D：桃紅四物湯組圖2 各組大鼠缺血-再灌注4 h后腓腸肌細胞比較(DAPI染色，×200)

2.3 各組大鼠腓腸肌LncRNA H19表達比較 見表3。與空白組比較，干預后模型組、LncRNA H19阻斷劑組、桃紅四物湯組中 LncRNA H19表達均上調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。隨著血流再灌注時間延長，LncRNA H19在骨骼肌中的表達逐漸增強，于再灌注4 h達到最高值，血流再灌注4 h后呈現(xiàn)下降趨勢。與模型組比較，桃紅四物湯組、LncRNA H19阻斷劑組的干預4、8 h，LncRNA H19表達均低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。干預4、8 h，LncRNA H19阻斷劑組的LncRNA H19表達量低于桃紅四物湯組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表3 各組大鼠不同時間點腓腸肌LncRNA H19表達比較

2.4 各組大鼠腓腸肌NF-κB-p65蛋白表達比較 見表4(圖3)。模型組大鼠腓腸肌NF-κB-p65蛋白表達高于空白組大鼠的腓腸肌NF-κB-p65蛋白表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。桃紅四物湯組、LncRNA H19阻滯劑組大鼠腓腸肌NF-κB-p65蛋白表達均高于模型組大鼠的水平；而隨著時間延長，NF-κB-p65蛋白表達升高，且在2、4 h兩組表達均高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。桃紅四物湯組、阻滯劑組大鼠腓腸肌NF-κB-p65蛋白表達比較，差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。

表4 各組大鼠不同時間點腓腸肌NF-κB-p65蛋白表達比較

A：空白組；B：模型組；C：LncRNA H19阻斷劑組；D：桃紅四物湯組圖3 各組大鼠不同時間點NF-κB-p65蛋白表達比較

2.5 各組大鼠腓腸肌NF-κB-p65 mRNA表達比較 見表5。隨著血流再灌注時間的延長，NF-κB-p65 mRNA在骨骼肌中的表達逐漸增強，于再灌注4 h到達最高值，血流再灌注4 h后表達量有所下調。與空白組比較，模型組、LncRNA H19阻斷劑組、桃紅四物湯組中NF-κB-p65 mRNA表達均增強，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。與模型組比較，桃紅四物湯組、LncRNA H19阻斷劑組NF-κB-p65 mRNA表達均低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。LncRNA H19阻斷劑組NF-κB-p65 mRNA表達低于桃紅四物湯組，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

表5 各組大鼠不同時間點腓腸肌NF-κB-p65 mRNA表達比較

3 討 論

LI-RI是肢體出現(xiàn)缺血后血液又回灌入組織而引起的一系列組織損傷，常繼發(fā)于動脈損傷、斷肢(指)再植、血栓性閉塞等臨床疾病中，是一種病理機制復雜且治療困難的臨床疾病，不僅可以引發(fā)局部組織和器官損傷，而且可誘發(fā)遠隔組織、器官的進一步損傷，嚴重時甚至可導致全身炎癥反應及多器官功能衰竭[15]。隨著現(xiàn)代醫(yī)學研究的深入，國內外學者發(fā)現(xiàn)LI-RI的發(fā)生發(fā)展與自由基、細胞凋亡、鈣超載、中性粒細胞的黏附與聚集、NO等眾多因素密切相關，以及誘發(fā)大量促炎癥細胞因子爆發(fā)式釋放，如NF-κB-p65、IL-1β、TNF-α等，不僅會再次加重肌肉組織的損傷，且炎癥因子進入血液循環(huán)，可誘發(fā)全身炎癥反應和遠隔重要器官損害[16]。

團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，桃紅四物湯可通過調控Wnt/Ca2+信號通路中IP3R、Wnt5a、CaMKⅡ等關鍵受體減輕鈣超載反應，降低LI-RI大鼠腓腸肌細胞凋亡率，并下調血漿中IL-1β、TNF-α等炎癥因子表達，起到減輕LI-RI作用[17]。桃紅四物湯由桃仁、干地黃、紅花、炒川芎、赤芍藥、當歸等中藥組成，其中桃仁、紅花能改善血管條件，防止血栓形成，加速溶栓過程。紅花能提高大鼠體內超氧化物歧化酶(SOD)生物活性，降低丙二醛(MDA)血清水平，紅花提取物預處理可降低大鼠腸缺血再灌注損傷的氧化應激反應、細胞凋亡率[18]。當歸可減少組織過氧化損傷和提高細胞生物膜的穩(wěn)定性，川芎具有抗氧化作用，在小腸缺血再灌注損傷中，其主要成分川芎嗪能夠拮抗內質網(wǎng)應激相關炎癥和細胞凋亡通路表達[19]。赤芍總苷可通過增強抗氧化酶的生物活性，降低組織的脂質過氧化反應，提高細胞膜穩(wěn)定性，減輕細胞因缺血而帶來的病理損傷[20]。桃紅四物湯可有效降低血漿中IL-1β、TNF-α等炎癥因子表達，減輕LI-RI作用[21]。在腦缺血-再灌注方面，桃紅四物湯可以通過激活PI3K/AKT信號轉導通路促進腦缺血部位的血管新生，使腦缺血-再灌注損傷大鼠損傷的神經(jīng)功能得到恢復[22]。

近年來國內外學者對LI-RI的防治和病理損傷的機制研究重心逐漸發(fā)展至分子生物學、細胞機制水平和信號因子、基因靶向調控等方面。LncRNA H19是一個長度為3.0 kb具有高度進化保守性的長鏈非編碼RNA，在機體眾多內臟器官的I-RI類疾病的病理機制中，LncRNA H19均起到了生物調控功能[23]。LncRNA H19可通過敲減miR-103/107表達，抑制細胞壞死和拮抗小鼠I-RI心梗的出現(xiàn)[24]。在動脈粥樣硬化調控機制的研究中發(fā)現(xiàn)，LncRNA H19在動脈粥樣硬化患者血清中高度表達，通過NF-κB信號通路調控動脈粥樣硬化疾病，促進血管平滑肌細胞增殖并抑制細胞凋亡[25-27]。LncRNA H19過表達后，NF-κB-p65蛋白在血管平滑肌細胞中高度表達[28-30]。而NF-κB信號通路是 Wnt/Ca2+信號通路中的主要小通路，普遍分布于細胞漿中，靜息狀態(tài)下它與抑制性蛋白IκB結合而為非活性狀態(tài)。NF-κB是一種快反應轉錄因子，可被許多物質激活，如病毒、細胞內因子、蛋白激酶C激活劑及細胞外刺激等[31-33]。NF-κB信號通路被激活后可參與許多基因轉錄與調控過程，可調控與啟動腫瘤壞死因子-α、白介素-1等炎癥因子轉錄，進而引起一系列炎癥反應[34-36]。在機體免疫、氧化應激、組織炎癥、細胞增殖與凋亡等生理病理過程中發(fā)揮重要作用[37]。近年研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA H19-NF-κB信號通路可相互作用，發(fā)揮其生物學作用[38]。劉湜樺等[39]研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA H19通過激活NF-κB信號通路，促進幽門螺旋桿菌感染的GC細胞增殖、遷移、侵襲。Jiang等[40]通過抑制腦出血模型大鼠中LncRNA H19表達，發(fā)現(xiàn) LncRNA H19沉默后，腦出血大鼠腦組織NF-κB-p65表達降低，提示LncRNA H19可導致神經(jīng)損傷，釋放炎癥因子，加劇氧化應激，并通過激活NF-κB通路進一步加重腦出血大鼠腦損傷。以上研究表明，LncRNA H19-NF-κB信號通路與LI-RI炎癥反應、細胞凋亡密切相關，并可調控NF-κB信號通路和介導炎癥反應發(fā)生。

本研究HE染色結果顯示，桃紅四物湯組和LncRNA H19阻滯劑組腓腸肌纖維的破壞程度較模型組明顯減輕，且桃紅四物湯組的肌纖維輕度破壞，炎癥浸潤不明顯，較LncRNA H19阻斷劑組稍減輕。DAPI 熒光染色顯示，桃紅四物湯組、LncRNA H19阻滯劑組細胞凋亡率低于模型組，說明LncRNA H19阻滯劑、桃紅四物湯預處理可減少細胞凋亡，減輕LI-RI作用。 RT-qPCR 、Western blot檢測結果顯示，與空白組相比，各組大鼠NF-κB-p65蛋白及其mRNA表達一致性上調，說明NF-κB-p65是LI-RI Wnt5a/Ca2+信號通路的關鍵蛋白；與模型組相比，桃紅四物湯組、LncRNA H19阻滯劑組不同時間點腓腸肌 LncRNA H19表達一致性下調，提示桃紅四物湯可抑制LncRNA H19表達。桃紅四物湯組、阻滯劑組的NF-κB- p65表達比較差異無統(tǒng)計學意義，表明桃紅四物湯可通過調控上游分子LncRNA H19途徑下調NF-κB- p65表達，減輕LI-RI作用。這為 LI-RI骨骼肌細胞損傷的分子機制和桃紅四物湯的防治作用提供了實驗證據(jù)。在研究 LI-RI 發(fā)生、進展、預防的分子病理機制中，NF-κB是Wnt/Ca2+信號通路的一條關鍵小通路，上游分子LncRNA H19是否可以通過調控Wnt/Ca2+信號途徑中其他小通路的表達協(xié)同影響LI-RI，以及桃紅四物湯在抑制LI-RI細胞凋亡方面可能存在多通路、多靶點效應，值得進一步開展體外細胞實驗研究。