張春磊,李秀婷,劉 娜,張成元

濰坊市婦幼保健院兒科,山東濰坊 261011

膿毒癥是指由感染、燒傷等因素導(dǎo)致宿主免疫反應(yīng)失調(diào)而誘發(fā)的全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，也是嚴(yán)重感染、外科手術(shù)、休克、創(chuàng)傷等患者的并發(fā)癥，具有病死率高、發(fā)病率高、預(yù)后差等特點(diǎn)[1-2]。近年來(lái)，膿毒癥在兒童中的發(fā)病率呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)，在病情進(jìn)展過(guò)程中可能造成多器官功能障礙綜合征、膿毒癥休克，嚴(yán)重威脅患兒生命健康[3-4]。目前，臨床認(rèn)為新生兒膿毒癥(NS)的發(fā)病機(jī)制與凝血功能異常、組織損傷、全身炎癥反應(yīng)、免疫功能障礙等有關(guān)，但臨床工作者對(duì)NS的病理生理學(xué)認(rèn)知上仍存在一定不足，深入分析本病具體病因及發(fā)病機(jī)制，尤其是借助測(cè)序技術(shù)、分子生物學(xué)等手段探索新型標(biāo)志物及靶點(diǎn)，在NS的早期診斷、治療中尤為重要[5]。作為一類新型的基因調(diào)控分子，微小核糖核酸(miRNA)可通過(guò)調(diào)節(jié)部分蛋白及基因的mRNA表達(dá)，而參與多種感染/炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[6]。miR-96是miR-183家族重要成員之一，已有諸多研究證實(shí)，其在食管癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，但目前關(guān)于miR-96在NS中表達(dá)情況的研究較少，且相關(guān)機(jī)制尚不清楚[7]。鑒于此，本研究就miR-96表達(dá)與NS及炎癥反應(yīng)的關(guān)系進(jìn)行分析，旨在進(jìn)一步闡述NS的機(jī)制，掌握miR-96表達(dá)與炎癥反應(yīng)的相關(guān)性，為臨床診治NS提供可靠的理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2018年6月至2020年4月在本院住院治療的65例NS患兒作為NS組，將同期65例非感染性SIRS患兒作為非感染性SIRS組，另選50例健康體檢兒童作為健康組。納入標(biāo)準(zhǔn)：NS組、非感染性SIRS組患兒符合美國(guó)重癥醫(yī)學(xué)會(huì)(ACCM)與歐洲重癥醫(yī)學(xué)會(huì)(ESICM)聯(lián)合發(fā)布的NS、非感染性SIRS相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；家屬自愿簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有心、肝、腎等重大臟器病變；伴有結(jié)締組織疾病、先天性畸形、染色體疾病、先天性遺傳代謝??；中途轉(zhuǎn)院或因其他原因而未完成相關(guān)指標(biāo)；入院24 h內(nèi)即出院；出生后不足7 d。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)制定標(biāo)準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1miR-96檢測(cè) 采集所有受檢者外周血2 mL[健康組于體檢當(dāng)日采集，NS組、非感染性SIRS組于入院后(治療前)采集]，置于EDTA抗凝試管，3 000 r/min離心10 min，取上層血漿于1.5 mL EP管。參考Trizol試劑盒、總RNA提取試劑盒(武漢純度生物科技有限公司)說(shuō)明書提取血漿中總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA(miR-96引物序列：上游為5′-TCT GGG TAC CGC ACT GGT AGA ATT CAC TG-3′，下游為5′-CCT TTC TAG ACC ACG GCA CCA TTC AGG A-3′)，按廠家說(shuō)明書進(jìn)行操作。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用熒光定量PCR技術(shù)(PRISM 7000型定量PCR儀)檢測(cè)miR-96的表達(dá)水平。反應(yīng)條件：94 ℃ 10 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，重復(fù)40循環(huán)，72 ℃ 10 min，采集熒光，以U6作為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-96的相對(duì)表達(dá)量。U6引物序列：上游引物為5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，下游引物為5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。

1.2.2炎性因子檢測(cè) 采集所有受檢者外周血2 mL[健康組于體檢當(dāng)日采集，NS組、非感染性SIRS組于入院后(治療前)采集]，離心10 min(3 000 r/min，離心半徑為6 cm)，取血清放于低溫冰箱中待測(cè)。使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平，試劑盒購(gòu)自北京億鳴復(fù)興生物科技有限公司。

2 結(jié) 果

2.13組一般資料比較 3組性別、孕周、年齡、體質(zhì)量、5 min Apgar評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；NS組、非感染性SIRS組原發(fā)疾病比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；NS組序貫器官衰竭評(píng)估(SOFA評(píng)分)、急性生理學(xué)和慢性健康評(píng)價(jià)Ⅱ(APACHEⅡ評(píng)分)比非感染性SIRS組高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組一般資料比較(n/n或

2.2miR-96、炎性因子水平比較 NS組miR-96 表達(dá)水平比非感染性SIRS組、健康組低，IL-1β、IL-6、TNF-α水平比非感染性SIRS組、健康組高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組血清miR-96、炎性因子水平比較

2.3miR-96表達(dá)水平與炎性因子水平相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，miR-96表達(dá)水平與IL-1β、IL-6、TNF-α水平均呈負(fù)相關(guān)(r<0，P<0.05)。見表3。

表3 miR-96表達(dá)與炎性因子水平相關(guān)性

2.4NS組不同預(yù)后患兒血清各指標(biāo)差異 根據(jù)入院28 d內(nèi)存活情況分為兩組。死亡組miR-96表達(dá)水平比存活組低，IL-1β、IL-6、TNF-α水平比存活組高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 NS組不同預(yù)后患兒血清各指標(biāo)差異對(duì)比

2.5miR-96對(duì)NS患兒預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值 將miR-96作為檢驗(yàn)變量，將NS患兒預(yù)后作為狀態(tài)變量(0=存活，1=死亡)，繪制ROC曲線，結(jié)果顯示，miR-96預(yù)測(cè)NS患兒病死的AUC為0.903(95%CI：0.846～0.978)，以0.75為臨界值，其靈敏度、特異度分別為0.894、0.855，約登指數(shù)為0.749。見圖1。

圖1 miR-96預(yù)測(cè)NS患兒預(yù)后的ROC曲線圖

3 討 論

由于新生兒各免疫器官、臟器不成熟，皮膚黏膜屏障功能差，獲得性免疫及固有免疫共同缺陷，加之受中心靜脈置管等有創(chuàng)操作影響，易發(fā)生感染，進(jìn)展為NS[9]。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)放大及激活，造成炎癥細(xì)胞因子過(guò)度釋放是誘發(fā)NS的主要機(jī)制之一[10]。因此，防治NS疾病及提升預(yù)后的關(guān)鍵在于維持機(jī)體內(nèi)抗炎因子、促炎因子間平衡、抑制促炎因子表達(dá)。已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-16、miR-21、miR-150、mR-146等多種miRNA通過(guò)作用于炎癥通路的重要基因而參與炎癥發(fā)展過(guò)程中[11-12]。

miRNA屬于一種易感基因，通過(guò)與目標(biāo)mRNA的3′-UTR區(qū)相結(jié)合，誘導(dǎo)目標(biāo)mRNA降解，調(diào)節(jié)靶基因蛋白和mRNA表達(dá)，進(jìn)而參與細(xì)胞血管生成、分化、凋亡等生物學(xué)過(guò)程中[13]。WANG等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞及介質(zhì)的表達(dá)過(guò)程中，通過(guò)靶控相關(guān)信號(hào)通路及免疫功能而影響膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展。miR-96為miR-183家族成員，定位于人類染色體7q32，在多種腫瘤中異常表達(dá)。SINGH等[15]研究報(bào)道，miR-96高表達(dá)可抑制相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄后蛋白表達(dá)，降低炎癥反應(yīng)，干擾相關(guān)免疫通路。LU等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miR-96在膿毒癥致腎損傷患者中呈異常表達(dá)，且其調(diào)節(jié)的靶基因主要參與Wnt信號(hào)通路及Ⅰ組代謝型谷氨酸受體通路、白細(xì)胞介素信號(hào)通路的調(diào)控中。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比非感染性SIRS組、健康組，NS組血清miR-96 mRNA表達(dá)較低，證實(shí)NS患兒血清miR-96水平下調(diào)，這可能與炎癥因子表達(dá)和炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)通過(guò)TLR/IL-1β或NF-κB信號(hào)通路而調(diào)節(jié)miR-96表達(dá)有關(guān)。陳建德t[17]研究發(fā)現(xiàn)，miR-96在NS患兒血清中呈低表達(dá)，預(yù)測(cè)免疫相關(guān)基因?yàn)镮L-16、CD4、IL-17B、TNFRSF13B等，在NS炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)及宿主免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，與本研究結(jié)論基本一致。

NS從本質(zhì)上來(lái)說(shuō)是機(jī)體對(duì)感染性因素的反應(yīng)，疾病發(fā)生時(shí)會(huì)大量釋放細(xì)胞因子、血管活性物質(zhì)、氧自由基、急性期反應(yīng)物質(zhì)、趨化因子等，破壞抗炎因子、促炎因子之間平衡，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體免疫功能受損[18-19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NS組血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平比非感染性SIRS組、健康組高，提示NS患兒血清炎性因子水平上調(diào)，機(jī)體處于感染狀態(tài)，體內(nèi)抗炎及促炎反應(yīng)系統(tǒng)紊亂。黃林楓等[20]研究結(jié)果顯示，膿毒癥組IL-6、IL-10、TNF-α表達(dá)明顯高于非感染性SIRS組和對(duì)照組，與本研究結(jié)果基本一致。Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，miR-96表達(dá)水平與IL-1β、IL-6、TNF-α水平均呈負(fù)相關(guān)，由此可以推測(cè)miR-96可通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)而參與NS發(fā)生中。原因可能在于miR-96作用于IL-16、PTGS2、CD4、IL-17B等多個(gè)靶點(diǎn)，并調(diào)控NF-κB信號(hào)通路，觸發(fā)多種級(jí)聯(lián)反應(yīng)，影響免疫細(xì)胞的分化、調(diào)節(jié)過(guò)程，進(jìn)而負(fù)反饋調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)，從而控制炎癥反應(yīng)。miR-96通過(guò)不同的作用機(jī)制影響NS患兒的炎癥反應(yīng)，從而在不同預(yù)后轉(zhuǎn)歸的患兒中得到體現(xiàn)，本研究中，死亡組血清miR-96表達(dá)水平比存活組低，miR-96預(yù)測(cè)NS患兒病死率的AUC為0.903，靈敏度、特異度、約登指數(shù)分別為0.894、0.855、0.749，故早期監(jiān)測(cè)血清miR-96表達(dá)水平變化可有效預(yù)測(cè)患兒近期預(yù)后，對(duì)NS預(yù)后評(píng)估具有重要意義，且利于指導(dǎo)臨床對(duì)應(yīng)治療。

綜上所述，NS患兒血清miR-96水平下調(diào)，炎性因子水平上調(diào)，二者呈負(fù)相關(guān)；且miR-96水平對(duì)NS預(yù)后有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值，有望成為基因轉(zhuǎn)錄水平早期診斷NS及評(píng)估預(yù)后的新型生物標(biāo)志物。但由于病例數(shù)相對(duì)較少，產(chǎn)生的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果可能存在一定偏倚，故后期還需擴(kuò)大樣本量及延長(zhǎng)隨訪時(shí)間，進(jìn)一步驗(yàn)證血清miR-96表達(dá)水平與NS炎性因子及預(yù)后的關(guān)系；此外，還需從分子生物學(xué)角度深入分析miR-96是通過(guò)何種信號(hào)通路而影響炎癥反應(yīng)，以進(jìn)一步明確miR-96在NS患兒致病過(guò)程中的作用機(jī)制。