周振杰，王冬梅，歐陽(yáng)松應(yīng),2

(1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117；2.福建師范大學(xué)南方生物醫(yī)學(xué)研究中心，福建 福州 350117)

2019年末爆發(fā)的新型冠狀病毒肺炎(簡(jiǎn)稱新冠肺炎，COVID-19)對(duì)全球公共衛(wèi)生安全構(gòu)成巨大挑戰(zhàn)，根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，截至2022年6月12日，全球新冠肺炎患者數(shù)量已超過(guò)5.4億人，累計(jì)死亡人數(shù)已超過(guò)633萬(wàn)人.隨著新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)變異株(例如Alpha、Beta和Delta等)，特別是Omicron新型變異毒株的出現(xiàn)，全球新冠新增確診病例數(shù)量經(jīng)歷了多次起伏，一直未能得到完全控制[1].防止SARS-CoV-2傳播的最重要對(duì)策是及早識(shí)別、隔離和監(jiān)測(cè)患者.現(xiàn)階段我國(guó)采用“抗原+核酸”組合檢測(cè)，抗原檢測(cè)用于居家自測(cè)和更快速的初篩，但其靈敏度低并會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)；核酸檢測(cè)即實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)限低、特異性強(qiáng)，但其依賴于先進(jìn)設(shè)備分析和專業(yè)人員操作，擴(kuò)增耗時(shí)長(zhǎng)，限制了其現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)診斷(point-of-care testing，POCT)的能力.新興的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP)具有替代常規(guī)qPCR的潛力，已經(jīng)以各種形式應(yīng)用于SARS-CoV-2檢測(cè)，最低檢測(cè)限可達(dá)1～10 copies/反應(yīng)，比傳統(tǒng)的RT-PCR方法靈敏度高約100倍[2]，由于LAMP容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增而產(chǎn)生錯(cuò)誤的結(jié)果[3]，研究人員根據(jù)實(shí)際檢測(cè)SARS-CoV-2需求對(duì)該技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，主要集中在增強(qiáng)特異性、提高反應(yīng)速率、簡(jiǎn)化樣本處理、實(shí)現(xiàn)多重?cái)U(kuò)增以及應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)平臺(tái)等方面[4].本文回顧了近年應(yīng)用于檢測(cè)SARS-CoV-2的LAMP技術(shù)，同時(shí)總結(jié)了新型LAMP檢測(cè)技術(shù)在簡(jiǎn)單化、快速化、特異化和產(chǎn)物檢測(cè)等方面取得的進(jìn)展.

1 LAMP的基本原理及檢測(cè)流程

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增是Notomi等[5]在2000年首次提出的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)通過(guò)設(shè)計(jì)2對(duì)引物(內(nèi)引物FIP與BIP，外引物F3與B3)特異性識(shí)別靶序列6個(gè)不同區(qū)域，同時(shí)設(shè)計(jì)1對(duì)環(huán)引物(LF與LB)增加反應(yīng)速度(引物結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1)，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在60～65 ℃恒溫條件下反應(yīng)15～60 min可特異、快速、高效完成核酸擴(kuò)增.LAMP反應(yīng)成功的關(guān)鍵是引物設(shè)計(jì)，需要注意的是內(nèi)引物(FIP和BIP)會(huì)自行折疊，容易形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；大量的引物(通常為6條)可能形成引物二聚體，這些交互作用容易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果[6].現(xiàn)在LAMP引物設(shè)計(jì)通常采用在線程序Primer Explore(http：∥primerexplorer.jp/)，導(dǎo)入靶基因自動(dòng)生成引物，之后LAMP引物通過(guò)一系列因素進(jìn)行優(yōu)化，例如Tm值、引物末端的穩(wěn)定性、G+C含量和引物之間的距離等.

圖1 LAMP引物結(jié)構(gòu)[7]Fig.1 LAMP primer structure[7]

LAMP檢測(cè)較其他核酸診斷方法的最大優(yōu)勢(shì)在于操作流程簡(jiǎn)單，對(duì)儀器設(shè)備和人員要求低.LAMP檢測(cè)步驟(見(jiàn)圖2)包括：(1)標(biāo)本采集：核酸檢測(cè)流程的第一步，標(biāo)本放入樣本保存管中，其保存液具有滅活病毒的作用；(2)標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)：標(biāo)本在嚴(yán)密包裝下護(hù)送到實(shí)驗(yàn)室；(3)提取核酸：專業(yè)技術(shù)人員提取病毒樣本的核酸；(4)配制試劑、加樣：將反應(yīng)液、酶、引物和模板按照規(guī)定的量制備；(5)LAMP擴(kuò)增：置于水浴鍋或恒溫設(shè)備中進(jìn)行反應(yīng)，在1 h內(nèi)即可完成擴(kuò)增；(6)結(jié)果輸出：檢測(cè)人員對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析，排除假陰性和假陽(yáng)性可能，及時(shí)對(duì)異常結(jié)果樣本進(jìn)行復(fù)核.結(jié)果判讀方法多種多樣，包括電泳法、比色法、側(cè)流層析法、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、微流控技術(shù)和電化學(xué)傳感器等技術(shù).

圖2 LAMP檢測(cè)流程圖Fig.2 LAMP detection flowchart

2 LAMP檢測(cè)SARS-CoV-2靶基因的方式

2.1 單基因LAMP

SARS-CoV-2基因組全長(zhǎng)大約30 Kb，兩端為非編碼區(qū)域，中間是非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)和結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū).非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)序列保守包括5’端開放閱讀框(open reading frame，ORF)ORF1a/b，占全基因組的67%，主要編碼16個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(nonstructural protein，Nsp)，而結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)依次編碼刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)及核衣殼蛋白(N)[8-9].N基因是LAMP 檢測(cè)SARS-CoV-2最常用的靶基因，N蛋白的序列高度保守，在病毒復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮重要作用.Dong等[10]對(duì)19組RT-LAMP引物進(jìn)行比較評(píng)價(jià)，這些引物組在SARS-CoV-2的基因組中的分布包括2組與Nsp3結(jié)合、5組與RdRp結(jié)合、2組與E基因結(jié)合、6組與N基因結(jié)合，這些區(qū)域高度保守，另外4組引物分別位于Nsp1、Nsp3和S基因的基因組區(qū)域.而基于N基因的RT-LAMP方法擴(kuò)增速度最快，并且比基于其他基因的檢測(cè)更靈敏，最低檢測(cè)限可達(dá)1 copies/反應(yīng).

2.2 多重LAMP

多重環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(multiplex LAMP，mLAMP)可實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)多重基因的需求.SARS-CoV-2感染的早期臨床特征類似于常見(jiàn)呼吸道病毒的感染，如流感病毒和軍團(tuán)菌[11]，但SARS-CoV-2的死亡率更高，并且進(jìn)化的單堿基突變株比野生型SARS-CoV-2更具傳染性和致死性，除此之外多重病毒合并感染的幾率也很高[12]，因此，多重檢測(cè)和突變基因分型對(duì)于評(píng)估病毒的傳播性和致病性變得越來(lái)越重要[3].Kundrod等[13]針對(duì)N、E和ORF1a基因設(shè)計(jì)了3組獨(dú)特的引物集識(shí)別SARS-CoV-2基因組的不同區(qū)域，降低了病毒突變對(duì)擴(kuò)增的影響.研究表明與單引物組相比，RT-LAMP使用3個(gè)引物組可以提高靈敏度，加快擴(kuò)增速度，在50 copies模板濃度上有顯著差異.基于CRISPR的LAMP檢測(cè)需要多種CRISPR-Cas相關(guān)酶進(jìn)行切割，而Ye等[3]開發(fā)了一體式Ago切割的RT-LAMP檢測(cè)系統(tǒng)(MULAN)，該系統(tǒng)設(shè)計(jì)和檢測(cè)更簡(jiǎn)單；Manzanas等[14]開發(fā)的2-Plex VLEAD設(shè)備集成了球型閥門輸送試劑、裂解病毒并在紙墊上濃縮和純化、采集的RNA直接RT-LAMP擴(kuò)增，然后進(jìn)行比色分析，該設(shè)備成本低、使用簡(jiǎn)單，這兩種方法都適用于檢測(cè)SARS-CoV-2的不同變種、流感病毒亞型(A型和B型)或其他類型的病毒.

3 LAMP檢測(cè)SARS-CoV-2的應(yīng)用

3.1 電泳LAMP

由于LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物是不同數(shù)量的頸環(huán)結(jié)構(gòu)、不同長(zhǎng)度的DNA混合物，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳法可見(jiàn)特異的梯狀條帶.該方法操作繁瑣且容易產(chǎn)生氣溶膠污染，多用于驗(yàn)證LAMP.

3.2 可視化LAMP

3.2.1 比色法LAMP

比色法LAMP(colorimetric LAMP ，cLAMP)是指反應(yīng)前在體系中加入染料，通過(guò)觀察LAMP反應(yīng)前后顏色變化差異實(shí)現(xiàn)快速判讀反應(yīng)結(jié)果，適用于POCT.在檢測(cè)低拷貝數(shù)樣本時(shí)，RT-LAMP中瓊脂糖凝膠法顯示陽(yáng)性，但比色法沒(méi)有顏色變化，可能由于擴(kuò)增子的形成少，這表明比色法診斷靈敏性較低[6].改進(jìn)方法：(1)采樣時(shí)期的選擇：低病毒拷貝數(shù)下的檢測(cè)率取決于采樣時(shí)間和擴(kuò)增時(shí)間，在早期感染期間病毒載量很低，直到出現(xiàn)癥狀的第五天，病毒載量就相對(duì)較高，此時(shí)比色LAMP對(duì)新冠肺炎的診斷是有效的[15]；(2)增加擴(kuò)增時(shí)間：當(dāng)延長(zhǎng)LAMP反應(yīng)時(shí)間至50～60 min時(shí)，病毒載量較低的樣品也可被明顯區(qū)分開；(3)比色法定量：Aoki等[6]利用分光光度儀分析酚紅-LAMP檢測(cè)SARS-CoV-2的結(jié)果，陽(yáng)性反應(yīng)中粉紅色的強(qiáng)度降低、黃色的吸光度增加，從而通過(guò)ΔDO值(粉紅色吸光度減去黃色吸光度即434～560 nm)進(jìn)行客觀的顏色測(cè)定；Yoo等[16]基于平板電腦自動(dòng)圖像捕獲和編寫測(cè)試算法，引入了DEF(決定性、有效性和模糊性)對(duì)HNB-LAMP的顏色變化進(jìn)行分析，量化比色增加可視化的靈敏度.(4)使用新型混合染料：利用顏色之間的互補(bǔ)作用，使變色范圍變窄，從而使終點(diǎn)時(shí)顏色變化敏銳[17].Jaroenram等[18]將二甲酚橙(XO)與孔雀石綠(MG)結(jié)合成復(fù)合染料稱為薰衣草綠(LG)，帶來(lái)了一種新的RT-LAMP比色系統(tǒng)對(duì)SARS-CoV-2進(jìn)行檢測(cè)，紫色

表1 SARS-CoV-2檢測(cè)的LAMP比色指示劑Tab.1 LAMP colorimetric indicator for SARS-CoV-2 detection

3.2.2 LFD法

橫向流動(dòng)試紙條檢測(cè)(lateral flow dipstick，LFD)包括LAMP擴(kuò)增和橫向側(cè)流試紙條分析2個(gè)步驟，由于內(nèi)引物與環(huán)引物被標(biāo)記上生物素與地高辛，擴(kuò)增反應(yīng)形成雙標(biāo)記產(chǎn)物，然后產(chǎn)物通過(guò)橫向?qū)游雠c結(jié)合墊上偶聯(lián)地高辛抗體的金磁微粒、檢測(cè)線上生物素抗體及質(zhì)控線上的其他抗體結(jié)合，從而顯示出特定顏色[8]，通過(guò)不同的修飾物(FITC、Texas Red、熒光素、DIG等)標(biāo)記不同靶標(biāo)引物就可以實(shí)現(xiàn)雙重[26]、三重[27]靶點(diǎn)的檢測(cè).Waller等[27]將mRT-LAMP-LFIA利用移液機(jī)器人和位置傳感器來(lái)確保精度和重復(fù)性，實(shí)現(xiàn)完全自動(dòng)化，能在15 min內(nèi)檢測(cè)到SARS-CoV-2三個(gè)不同的基因靶點(diǎn)(ORF1ab、E和N)，檢測(cè)限低至3 copies/反應(yīng).橫向流動(dòng)LAMP檢測(cè)具有判讀方便、設(shè)備簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，但其在反應(yīng)后需要開蓋進(jìn)行雜交，這一步驟可能會(huì)引起污染造成假陽(yáng)性.

3.3 實(shí)時(shí)LAMP

3.3.1 實(shí)時(shí)濁度法

利用實(shí)時(shí)濁度儀對(duì)LAMP反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的焦磷酸鎂沉淀進(jìn)行濁度監(jiān)測(cè)，LAMP實(shí)時(shí)濁度監(jiān)測(cè)比傳統(tǒng)的RT-PCR實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)更簡(jiǎn)單[28].Chen等[29]通過(guò)實(shí)時(shí)濁度監(jiān)測(cè)來(lái)確定SARS-CoV-2 RdRp和N基因的RT-LAMP最佳擴(kuò)增溫度，測(cè)試了60～67 °C的反應(yīng)溫度，間隔1 °C得出對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增曲線，濁度>0.1是陽(yáng)性.Kitagawa等[30]通過(guò)LA-200濁度計(jì)對(duì)RT-LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，以10倍連續(xù)稀釋的SARS-CoV-2 RNA為模板，在35 min內(nèi)的檢測(cè)下限為10 copies·μL-1.

3.3.2 熒光定量法

基于SYBR Green I、SYTO系列等熒光染料與雙鏈DNA結(jié)合的實(shí)時(shí)熒光，趙大重[31]通過(guò)SYBR Green I熒光染料進(jìn)行SARS-CoV-2檢測(cè)的LAMP體系優(yōu)化，選擇擴(kuò)增曲線標(biāo)準(zhǔn)、出峰時(shí)間最早、最終達(dá)到的熒光信號(hào)值大為最優(yōu)體系，并觀察熔解曲線中空白對(duì)照沒(méi)有出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增.Oscorbin等[32]以MS2噬菌體為內(nèi)參照，通過(guò)熒光插層染料LAMP擴(kuò)增結(jié)合熔融曲線分析進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)SARS-CoV-2，與實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果的符合率為97.6%，最低檢測(cè)限為20 copies/反應(yīng).基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的實(shí)時(shí)熒光，Dong等[33]使用HFman-LAMP，熒光探針與LF或LB具有相同序列并分別在3′端和5′端標(biāo)記熒光團(tuán)和猝滅劑，由于探針被高保真DNA聚合酶切割，釋放出的熒光信號(hào)呈指數(shù)增加.因此可以簡(jiǎn)單地通過(guò)熒光強(qiáng)度來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)，還可以針對(duì)SARS-CoV-2的ORF、E基因以及人類看家基因β-肌動(dòng)蛋白在不同序列的HFman探針上使用不同的熒光基團(tuán)來(lái)實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè).對(duì)于探針?lè)ㄟ€有研究者引入校對(duì)酶和熒光探針的LAMP(RT-Proofman-LAMP)[34]提高擴(kuò)增效率；開發(fā)了環(huán)探針LAMP(oLAMP)[35]提高靈敏度.

3.3.3 BART和實(shí)時(shí)測(cè)序

Iijima等[28]建立了一種新型RT-LAMP-BART檢測(cè)SARS-CoV-2(野生型和4種變異型)，BART的原理是通過(guò)螢火蟲熒光素酶產(chǎn)生的生物發(fā)光，連續(xù)監(jiān)測(cè)核酸擴(kuò)增的副產(chǎn)物(PPi)轉(zhuǎn)化為ATP的過(guò)程.該檢測(cè)顯示了一個(gè)光輸出峰值，即在最初幾分鐘內(nèi)光輸出下降后，如果光信號(hào)顯著增加，則認(rèn)為樣本是陽(yáng)性，隨后光輸出下降.雖然RT-LAMP-BART不如傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)RT-PCR靈敏度高，但它產(chǎn)生結(jié)果的速度更快.Ptasinska等[36]將LAMP和納米孔測(cè)序(LamPORE)耦合進(jìn)行快速實(shí)時(shí)測(cè)序分析SARS-CoV-2或其他病原體.實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)比其他方法靈敏度高，但不適合現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè).

3.4 微流控LAMP

微流控芯片微小可控、功能齊全，能夠簡(jiǎn)化操作過(guò)程、加快分析速度，還可避免常規(guī)方法中樣品轉(zhuǎn)移所帶來(lái)的污染和損失，LAMP與微流控技術(shù)結(jié)合的核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)最有潛力被應(yīng)用在POCT上[37].目前博奧晶芯生物科技有限公司的全集成碟式芯片法(LAMP恒溫?cái)U(kuò)增)新冠核酸試劑盒已獲批，對(duì)于最新毒株也可以做到不脫靶不漏檢，35 min內(nèi)檢測(cè)靈敏度可達(dá)150 copies·mL-1.Nguyen等[38]開發(fā)了一個(gè)完全集成的離心式微流控平臺(tái)可以一次對(duì)10個(gè)樣品進(jìn)行qLAMP擴(kuò)增分析，并設(shè)計(jì)了3個(gè)反應(yīng)室來(lái)靶向SARS-CoV-2的ORF1 ab、N和S基因，減少了假陽(yáng)性和假陰性的錯(cuò)誤結(jié)果，提高了準(zhǔn)確性.Yang等[39]利用靈敏的RT-LAMP來(lái)增強(qiáng)信號(hào)，然后通過(guò)特異的人絨毛膜促性腺激素(HCG)連接的足趾介導(dǎo)的鏈交換(TM)探針(HCGP)將其轉(zhuǎn)導(dǎo)到便攜式商業(yè)妊娠試驗(yàn)試紙(PTS)，整個(gè)檢測(cè)集成到一個(gè)四通道、手掌大小的微流控裝置，并成功應(yīng)用于SARS-CoV-2的M、N基因的檢測(cè)，其最低檢測(cè)濃度為0.5 copies·μL-1.

3.5 與其他技術(shù)聯(lián)合的LAMP檢測(cè)

Nguyen等[40]制作了一種將LAMP與聚多巴胺相結(jié)合的可滑動(dòng)紙質(zhì)裝置可在25 min內(nèi)檢測(cè)到SARS-CoV-2，在DNA擴(kuò)增子存在時(shí)阻礙了聚多巴胺變成聚集態(tài)，而在沒(méi)有擴(kuò)增時(shí)促進(jìn)了聚多巴胺的聚集.紙張的多孔性使得陽(yáng)性樣品中分散的聚多巴胺能夠在毛細(xì)管流動(dòng)，而陰性樣品中聚集態(tài)的聚多巴胺由于聚集體較大而留在紙條的底部.Day等[41]開發(fā)了一種乳化環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(eLAMP)平臺(tái)診斷SARS-CoV-2，LAMP反應(yīng)的分隔導(dǎo)致乳狀液特性變化更快，從而降低檢測(cè)時(shí)間.在這些液滴中，LAMP反應(yīng)產(chǎn)生擴(kuò)增子吸附到水-油界面使界面張力降低，導(dǎo)致乳狀液直徑變小，從而利用分光光度計(jì)和光纖光纜通過(guò)角度相關(guān)的光散射強(qiáng)度(基于Mie散射理論)來(lái)監(jiān)控反應(yīng)乳化劑直徑的變化.Alvarez等[42]使用基于Arduino的pH微電極輔助的便攜式LAMP擴(kuò)增系統(tǒng)，對(duì)于未提取的病毒載量中等或低的唾液樣本，擴(kuò)增3 min即可準(zhǔn)確可靠地診斷SARS-CoV-2，擴(kuò)增過(guò)程中固有的H3O+離子的釋放通過(guò)電勢(shì)的差異或pH變化來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè).但是這種診斷系統(tǒng)的性能依賴于相對(duì)昂貴的商用pH微電極，而且玻璃或膜的pH微電極可能是樣品中殘留DNA 的污染源(來(lái)自之前的陽(yáng)性擴(kuò)增)，因此還需要建立能夠在完成擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)后有效地將電極上殘存核酸去除的方案.Song等[43]研究了一種嵌套等溫?cái)U(kuò)增(Penn-RAMP)包括重組酶等溫?cái)U(kuò)增(RT-RPA)作為其第一階段，LAMP作為其第二階段，與單步擴(kuò)增的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(RT-LAMP)同時(shí)檢測(cè)CT<32的SARS-CoV-2進(jìn)行比較，Penn-RAMP的靈敏度是RT-LAMP的10倍.

CRISPR系統(tǒng)特異性識(shí)別序列將減少等溫?cái)U(kuò)增步驟中副產(chǎn)物造成的假陽(yáng)性結(jié)果，從而提高特異性[44].Cas12蛋白也被廣泛用于基于CRISPR/Cas的SARS-CoV-2核酸檢測(cè).在識(shí)別特定的靶核酸后，Cas12或Cas13核酸酶的非特異性反式切割活性被激活，從而切割報(bào)告探針，因此這些方法大多使用熒光探針，需要特殊的儀器來(lái)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)[45]；還有研究應(yīng)用耐熱的Cas12b與RT-LAMP結(jié)合一體式檢測(cè)SARS-CoV-2[46].基于Cas12的方法依賴于側(cè)向流動(dòng)分析[47]、離心機(jī)的使用[48]或磁力下拉操作[49]等，這些方法對(duì)于高通量檢測(cè)是困難的.Cas13由于其敏感性在檢測(cè)RNA病原體方面比Cas12更具優(yōu)勢(shì)[44].Mahas等[50]使用RT-LAMP偶聯(lián)mCas13(一種新的Cas13變體)系統(tǒng)檢測(cè)SARS-CoV-2，使用手持、廉價(jià)的熒光顯像儀輸出熒光信號(hào)，這是一種適用于POC和簡(jiǎn)單讀數(shù)的常規(guī)診斷，但也不適合高通量篩查.納米金(AuNP)因其較強(qiáng)的摩爾吸光系數(shù)而被用于可視分析， Zhang等[24]建立了一種Cas12a輔助結(jié)合AuNP目測(cè)的RT-LAMP擴(kuò)增方法(CLAP)，從肉眼可以觀察到紅色變成紫色，基于這兩種方法操作簡(jiǎn)單，有望在POCT中得到應(yīng)用.

4 LAMP檢測(cè)SARS-CoV-2的改進(jìn)

4.1 樣品處理簡(jiǎn)單化與快速化

現(xiàn)階段應(yīng)用于SARS-CoV-2核酸檢測(cè)的核酸提取方法包括離心吸附法、磁珠法、試劑盒提取，這些方法需要專門的昂貴設(shè)備和試劑，并且非常耗時(shí)[51].而超速提取和免提取核酸的設(shè)計(jì)可以大大縮短SARS-CoV-2核酸提取的時(shí)間，提高LAMP檢測(cè)效率[52].目前快速提取SARS-CoV-2核酸的方法不斷改進(jìn)：He等[53]探索了一種基于硅羥基MBS快速提取SARS-CoV-2 RNA的方法，實(shí)現(xiàn)核酸的自動(dòng)提取，MBS結(jié)合RNA分子的能力很強(qiáng)，當(dāng)被MBS捕獲后，RNA與MBS一起直接用于下游的RT-LAMP反應(yīng)；由于唾液可自行收集并保護(hù)了采集人員，Amaral等[54]建立了一種RT-LAMP直接從唾液樣本中檢測(cè)SARS-CoV-2，但是靈敏度較低.，研究人員對(duì)唾液進(jìn)行不同的處理，結(jié)合某些化學(xué)物質(zhì)和蛋白酶K可以改善唾液樣本中SARS-CoV-2的檢測(cè).

Mautner等[55]在90 °C加熱拭子樣品5 min后，直接用于RT-LAMP檢測(cè)；Ganguli等[56]將拭子移到病毒傳輸介質(zhì)(VTM)，95 ℃熱裂解1 min，直接取一定體積VTM進(jìn)行RT-LAMP分析，該方法30 min內(nèi)可檢出50 copies·μL-1.Jones等[57]將20 μL樣品與2×LAMP裂解緩沖液混合：2%Triton X-100調(diào)節(jié)至pH=8.0，2 mol·L-1Tris-HCl和80 U·mL-1蛋白酶K，在室溫下孵育15 min后滅活蛋白酶K，取樣品裂解液2 μL直接用作熒光RT-LAMP反應(yīng)的模板[3].用于SARS-CoV-2裂解緩沖液還有其他配方，對(duì)比熱裂解病毒，該法可有效地破壞病毒以釋放RNA，同時(shí)使未純化樣本中存在的核酸酶失活，但裂解緩沖液處理樣品會(huì)稀釋樣品而導(dǎo)致LAMP檢測(cè)靈敏度降低[56].Kundrod等[13]優(yōu)化裂解病毒方法，通過(guò)TCEP/EDTA裂解緩沖液處理和熱裂解病毒相結(jié)合，并得出結(jié)論：增加緩沖液濃度會(huì)使裂解效率顯著提高，5×濃度達(dá)到最完全的裂解，并且加入200 mmol·L-1鹽酸胍會(huì)導(dǎo)致更完全的核糖核酸酶失活.對(duì)于鼻咽、鼻拭子洗脫液和唾液樣本都具有臨床意義，三重檢測(cè)方法的最低檢測(cè)限可達(dá)20～23 copies/反應(yīng).

鼻咽拭子樣本采集過(guò)程令人不適，操作需要專業(yè)人員，并容易感染測(cè)試人員；唾液檢測(cè)具有操作簡(jiǎn)單、侵入性小和感染風(fēng)險(xiǎn)低等優(yōu)點(diǎn)，但是唾液的粘性以及蛋白水解酶的存在使得唾液樣本的直接應(yīng)用具有一定困難.Duan等[58]為了檢測(cè)人體呼氣中的SARS-CoV-2 RNA，研制了一種在樣本采集現(xiàn)場(chǎng)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA的手持呼氣測(cè)定儀Bubbler，可以直接對(duì)呼氣中的氣霧化顆粒進(jìn)行采樣.Daniels等[59]研制了一種收集呼氣冷凝液(EBC)的口罩，對(duì)EBC口罩樣本進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果與鼻咽拭子樣一致.患者呼出的EBC可能是診斷SARS-CoV-2的一種重要的替代樣本類型.雖然呼氣中的病毒RNA更豐富，但病毒載量比鼻咽拭子中的病毒載量低幾個(gè)數(shù)量級(jí)，因此還是受到一定限制，目前還沒(méi)有應(yīng)用于LAMP擴(kuò)增，仍需要進(jìn)一步研究[58].

4.2 檢測(cè)智能化與潮流化

將智能手機(jī)、平板電腦轉(zhuǎn)變?yōu)榕R床POC診斷工具已被許多檢測(cè)模式所證明，Heithoff等[60]調(diào)查了一種基于智能手機(jī)的實(shí)時(shí)LAMP(SMART-LAMP)的技術(shù)測(cè)試，以了解它是否具備POC檢測(cè)的速度、靈敏度、低成本、可擴(kuò)展性和可訪問(wèn)性的組合屬性.Papadakis等[61]報(bào)道了一種便攜式的實(shí)時(shí)定量比色LAMP(qcLAMP)裝置，比色法檢測(cè)依賴于肉眼對(duì)顏色變化的評(píng)估很難辨別，利用智能手機(jī)相機(jī)結(jié)合算法或輻射成像獲得更準(zhǔn)確和定量比色檢測(cè)SARS-CoV-2的結(jié)果.Rohaim等[62]為了進(jìn)一步提高分析性能并消除操作員分析結(jié)果的主觀性，設(shè)計(jì)了一種新型手持式智能診斷儀，配備了自動(dòng)圖像采集和處理算法，并通過(guò)人工智能(AI)管道對(duì)整理的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，這種先進(jìn)的人工智能算法實(shí)現(xiàn)的LAMP(AI-LAMP)針對(duì)SARS-CoV-2的RdRp基因顯示了很高的分析靈敏度和特異性.將物聯(lián)網(wǎng)、機(jī)器學(xué)習(xí)工具和大數(shù)據(jù)分析等應(yīng)用于新冠肺炎診斷，可以快速準(zhǔn)確地得出結(jié)果[63].

5 總結(jié)與展望

快速檢測(cè)戰(zhàn)略是防治和管理未來(lái)潛在流行病的關(guān)鍵[64].快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高的LAMP擴(kuò)增檢測(cè)平臺(tái)具有廣闊的應(yīng)用前景.例如，微流控芯片技術(shù)把樣品前處理、LAMP擴(kuò)增、檢測(cè)集成于芯片中，將生物傳感器的超高靈敏度與人工智能和物聯(lián)網(wǎng)的進(jìn)步相結(jié)合的LAMP檢測(cè)方法有助于更好地控制潛在的疾病傳播[64]，實(shí)現(xiàn)了樣品到檢測(cè)結(jié)果的可視化監(jiān)測(cè).因此，未來(lái)LAMP 的應(yīng)用研究主要往集成式、便攜式、操作簡(jiǎn)便、高通量、低成本、易判讀、人工智能的方向發(fā)展，為病毒檢測(cè)的快速化、現(xiàn)場(chǎng)化、可視化提供更多的手段.