劉洋洋，姚杰然，林佳穎，丁瑩瑩，范 羽，倉 靜，冒海蕾

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院麻醉重癥醫(yī)學(xué)科，上海 200032

急性肺損傷（acute lung injury, ALI）是由嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷等非心源性疾病誘發(fā)，以肺部炎癥和通透性增強(qiáng)為主要表現(xiàn)的臨床綜合征。肺組織通透性增強(qiáng)導(dǎo)致彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，如不糾正就會導(dǎo)致急性缺氧性呼吸衰竭，即急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome, ARDS） 的發(fā)生［1-2］。ALI 進(jìn)展為ARDS 是連續(xù)進(jìn)行性的快速病理過程，臨床常難以分清。ALI 是全身炎性反應(yīng)綜 合 征（systemic inflammatory response syndrome,SIRS）的肺部表現(xiàn)。SIRS 本質(zhì)是機(jī)體遭遇嚴(yán)重?fù)p傷時的自我防御反應(yīng)，如果炎癥反應(yīng)失控，就可能影響重要臟器的功能。SIRS 失控通常首先打擊肺，導(dǎo)致ALI，甚至ARDS，促發(fā)器官序貫損傷且難以逆轉(zhuǎn)［3］。ALI 的發(fā)生與SIRS 的惡性進(jìn)展密切相關(guān)。

機(jī)體受到外界強(qiáng)烈損傷因素打擊后，進(jìn)入高度應(yīng)激狀態(tài)，分泌大量激素與炎癥介質(zhì)，進(jìn)而誘發(fā)代謝改變。此外，組織器官灌注、患者活動狀態(tài)和營養(yǎng)支持等也影響機(jī)體代謝，患者可表現(xiàn)為高分解代謝紊亂，進(jìn)一步加重器官功能障礙［3］。危重患者的代謝改變涉及糖、蛋白質(zhì)、脂類物質(zhì)合成與分解的多種途徑，引起細(xì)胞、器官功能的改變。因此，對炎癥反應(yīng)失控進(jìn)展過程中代謝物的變化進(jìn)行動態(tài)、定量監(jiān)測，有助于闡明ALI 發(fā)生發(fā)展中代謝模式的變化規(guī)律和分子機(jī)制。

NMR 代謝組學(xué)能實(shí)現(xiàn)對體液樣品快速、非破壞性、重復(fù)的定量分析，對危重病的早期診斷具有明顯優(yōu)勢［4-8］。本課題組前期研究［6］證實(shí)，通過血清NMR 譜能區(qū)分臨床危重病患者早期和后期的代謝紊亂狀態(tài)。然而，目前有關(guān)ALI/ARDS 患者代謝物研究［9-10］中的對照組各異，結(jié)果不一致，且均未涉及炎癥反應(yīng)早期患者的SIRS 狀態(tài)。

因此，本研究以外傷致SIRS 及ALI/ARDS 患者為研究對象，采用基于NMR 的代謝組學(xué)技術(shù)，通過其血清高分辨1H-NMR 譜圖，結(jié)合多種模式識別方法，量化分析SIRS 患者炎癥失控至ALI/ARDS 過程中整體代謝組變化，從而尋找疾病進(jìn)程中主要代謝物改變及關(guān)鍵調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為闡明導(dǎo)致肺損傷代謝紊亂發(fā)生的分子機(jī)制提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2012 年9 月至2017 年9 月就診于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院的創(chuàng)傷危重患者，均為男性，均因車禍、工傷、燒傷等原因入院。SIRS 診斷依據(jù)美國胸科學(xué)會（ATS）標(biāo)準(zhǔn)。ALI/ARDS 診斷依據(jù)歐洲呼吸與美國胸科學(xué)會（ERS/ATS）標(biāo)準(zhǔn)：（1）急性起病；（2）氧合指數(shù)降低（ALI：≤300 mmHg，ARDS：≤200 mmHg）；（3）X 線示雙肺浸潤影；（4）肺動脈楔壓≤18 mmHg 或無左房高壓的臨床證據(jù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）惡性腫瘤；（2）內(nèi)分泌疾病，如糖尿病、甲亢；（3）病理性肥胖（體質(zhì)量大于正常20%）；（4）既往有慢性器官功能障礙。選擇性別、年齡匹配且在2 周內(nèi)未患任何疾病的體檢健康者作為對照。研究獲本院倫理委員會批準(zhǔn)（B2012-56R）；研究對象均簽署知情同意書。

1.2 血液樣本采集 研究對象均禁食或停止腸內(nèi)/腸外營養(yǎng) 8 h 后清晨采血。SIRS 組、ALI/ARDS 組在確診3 d 后采集。所采血液于室溫下自然凝固，離心后收集上層血清，－80 °C 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.31H-NMR 譜測定 血清解凍，離心后吸取500 μL上清，移入 5 mm NMR 專用試管中，加入 50 μL 重水，在振蕩器上混勻。在 Varian Unity INOVA 600 MHz 核磁共振譜儀上，用CPMG （Carr-Purcell-Meiboom-Gill）脈沖序列采集1H-NMR 譜。采用預(yù)飽和法壓制水峰，298 K 實(shí)驗(yàn)溫度，1.64 s 采樣時間，4 s 弛豫延遲時間。每幅 NMR 譜采集 128 個自由感應(yīng)衰減信號（free induction decay，F(xiàn)ID），每個 FID 收集 32 000 個數(shù)據(jù)點(diǎn)，充零到 64 000 個數(shù)據(jù)點(diǎn)。指數(shù)窗函數(shù)采用0.3 Hz 的線寬進(jìn)行傅立葉變換。相位和基線校正后，參照乳酸的甲基共振峰（δ1.33），對譜圖的化學(xué)位移進(jìn)行定標(biāo)。

1.4 NMR 譜數(shù)據(jù)處理1H-NMR 譜（δ 0.2～10）以0.04/106為單位劃分為245 個等寬區(qū)域，對各區(qū)域進(jìn)行分段積分。再對各積分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，以消除樣品濃度、pH、離子強(qiáng)度等的影響。為了消除飽和水峰引起的譜線差異，以及與溶劑交換質(zhì)子后部分飽和轉(zhuǎn)移所致的尿素信號差異，將δ 4.5～6.0 設(shè)為 0 積分段。

1.5 模式識別分析 模式識別分析采用SIMCAP 12（Umetrics AB，瑞典）軟件。設(shè)置 245 個分段積分值為自變量、疾病類別為反應(yīng)變量，分別進(jìn)行無監(jiān)督的主成分分析（principal component analysis, PCA）、有監(jiān)督的偏最小二乘法-判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLSDA）［11］。

1.6 代謝物指認(rèn)和代謝通路分析 導(dǎo)出所建PLSDA 模型對應(yīng)的變量重要性（variable importance in projection, VIP）與回歸系數(shù)（centered and scaled coefficients, CoeffCS），篩選出與疾病分類相關(guān)的NMR 積分區(qū)段，再結(jié)合原始譜圖，指認(rèn)肺損傷發(fā)生相關(guān)的代謝物。以VIP＞1 為標(biāo)準(zhǔn)（一般采用VIP＞0.7），增加統(tǒng)計學(xué)可信度和縮小主要NMR積分區(qū)段范圍，便于代謝物的指認(rèn)。

熱圖的繪制主要通過R 語言程序包（MetaboAnalyst 5.0）中聚類函數(shù)完成。將NMR積分區(qū)段數(shù)據(jù)導(dǎo)入程序，Distance measure 設(shè)置為Euclidean，Clustering options 選擇對列數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類（Cluster column），聚類方法選擇Complete，Scale method 選擇標(biāo)準(zhǔn)化（Normalized）［12］。

采 用 MetaboAnalyst 5.0 軟 件， 將 NMR 積 分區(qū)段數(shù)據(jù)導(dǎo)入網(wǎng)站通路分析模塊。先對數(shù)據(jù)進(jìn)行縮放變換，再選擇Global test 算法進(jìn)行代謝通路富集分析。通過代謝通路富集分析計算代謝物參與每個特定通路的P 值，P 值越小，代謝通路價值越有統(tǒng)計學(xué)意義［13］。并進(jìn)行通路拓?fù)浞治觯垣@得代謝物對通路影響程度的大小，即通路影響因子（Impact），其值越大代表代謝物所在通路的重要性越大。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 25.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以x±s 表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)（α）為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 臨床及血生化指標(biāo) 共入組41 例男性患者，其中創(chuàng)傷致SIRS 患者19 例，平均年齡（59.89±20.33）歲；創(chuàng)傷致ALI/ARDS 22 例，平均年齡（62.14 歲±12.72）歲。結(jié)果（表1）顯示：SIRS 患者APACHE Ⅱ評分及生化指標(biāo)改變程度較??；與SIRS 患者相比，ALI/ARDS 患者血乳酸、血糖、降鈣素原、C 反應(yīng)蛋白更高（P＜0.01）。

2.2 基于NMR 的代謝組學(xué)技術(shù)對肺損傷發(fā)生的判別分析 結(jié)果（圖1）顯示：PCA 法及PLS-DA法分析示，創(chuàng)傷致ALI/ARDS 患者血清NMR 譜明顯不同于健康人。PCA 分析無法區(qū)分創(chuàng)傷致ALI/ARDS 與 SIRS 患者血清 NMR 譜；PLS-DA 法分析可區(qū)分SIRS 患者發(fā)生ALI 甚至ARDS 后的代謝模式遷移改變，說明肺損傷導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生缺氧相關(guān)代謝改變。

2.3 肺損傷發(fā)生相關(guān)的代謝物及代謝通路

2.3.1 熱圖展示患者1H-NMR 譜 熱圖（圖2）顯示患者總體血清氫譜的聚類差別，其中SIRS 患者以左上區(qū)域的NMR 信號增強(qiáng)為主，ALI 與ARDS患者以右下方信號增強(qiáng)為主，提示兩組患者血清代謝物存在差異。

2.3.2 主要NMR 積分區(qū)段及對應(yīng)的代謝物指認(rèn) 結(jié)果（表2、表3、圖3A）顯示：根據(jù)PLSDA 模型對應(yīng)的變量 VIP 及 CoeffCS，SIRS 組患者血清NMR 氫譜積分區(qū)段為 δ7.18～7.22 和 δ1.90～1.94，主要為酪氨酸、賴氨酸等生酮氨基酸的譜 峰；ALI/ARDS 組 積 分 區(qū) 段 為δ1.02～2.50 和δ3.02～4.14，主要代謝物為乳酸、纈氨酸、精氨酸、谷氨酸等多種生糖氨基酸，以及丙酮酸、肌酸、脂質(zhì)的脂肪酸、甘油等譜峰。SIRS 患者以生酮氨基酸升高為主，提示炎癥反應(yīng)促使脂肪氧化代謝加速；肺損傷發(fā)生時，生糖氨基酸升高更顯著，說明缺氧促進(jìn)糖異生/糖酵解以快速為生物體供能。

表3 影響ALI/ARDS 與SIRS 分類的主要NMR 區(qū)段及對應(yīng)代謝物

2.3.3 代謝通路富集分析 根據(jù)上述指認(rèn)的ALI/ARDS 相關(guān)代謝物（圖3A），進(jìn)行代謝通路富集分析，共篩選出11 個代謝通路，其中氨酰tRNA合成、氰基氨基酸代謝、氮代謝、卟啉葉綠素代謝、谷胱甘肽代謝及半乳糖代謝的影響強(qiáng)度值均約為0，說明其對疾病發(fā)生的影響?。惶墙徒?、糖異生、丙酮酸代謝、甘油酯代謝、精氨酸代謝、初級膽汁酸合成等通路的激活參與肺損傷發(fā)生（圖3B）。

3 討 論

ALI/ARDS 是ICU 患者死亡的重要原因，是嚴(yán)重創(chuàng)傷等因素誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)的肺部表現(xiàn)。本研究從整體代謝組入手，對創(chuàng)傷致SIRS 與ALI/ARDS 患者的血清NMR 氫譜進(jìn)行PLS-DA 模式識別分析，監(jiān)測到炎癥反應(yīng)失控導(dǎo)致肺損傷時的系統(tǒng)代謝改變。如果炎癥反應(yīng)失控影響肺泡上皮及其表面活性物質(zhì)，則會引起肺損傷，導(dǎo)致呼吸功能障礙，機(jī)體缺氧。此時無氧糖酵解產(chǎn)生的ATP 成為主要熱量來源，以提供呼吸肌及應(yīng)激反應(yīng)所需的能量；丙酮酸為糖酵解終產(chǎn)物，缺氧時在細(xì)胞漿中還原成乳酸供能。丙酮酸的來源除了糖酵解，還可由丙氨酸通過轉(zhuǎn)氨基作用生成。同時，丙酮酸、乳酸、氨基酸、甘油等非糖物質(zhì)可通過糖異生轉(zhuǎn)變?yōu)樘窃蚱咸烟?，為糖酵解提供物質(zhì)來源。此外，纈氨酸水平增加可能與肺損傷時肺泡表面活性蛋白C 的水解有關(guān)［14］。脂質(zhì)可通過PI3K/AKT/NF-κB 通路參與機(jī)體氧化應(yīng)激，為ARDS 發(fā)生的獨(dú)立標(biāo)志物之一［15-16］。本研究表明，糖酵解、糖異生、丙酮酸代謝、甘油酯代謝作為主要的代謝通路，協(xié)同推進(jìn)肺損傷進(jìn)程。這些代謝改變與臨床上肺損傷患者血糖與乳酸升高、氧合指數(shù)降低符合，而肺損傷時缺氧所致的二氧化碳潴留及乳酸的積聚可共同促使機(jī)體酸中毒［17］。

肺損傷時，精氨酸代謝活化與尿素、肌酸及NO 的產(chǎn)生有關(guān)。蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的氨基酸增多，相應(yīng)升高的血氨則須通過精氨酸介導(dǎo)的鳥氨酸循環(huán)生成尿素后排出。同時，精氨酸和脯氨酸為應(yīng)激壓力物質(zhì)，皆為生糖氨基酸，在炎癥進(jìn)展中為機(jī)體能量的來源之一［18］。谷氨酸除參與精氨酸代謝外，還與T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)相關(guān)。谷氨酸水平升高與ARDS 患者的代謝功能障礙相關(guān)［19］。缺氧導(dǎo)致呼吸困難，呼吸肌過度運(yùn)動又促進(jìn)肌酸產(chǎn)生，肌酸最終轉(zhuǎn)變?yōu)榧◆?。NO 作為應(yīng)激活性物質(zhì)，通過精氨酸-NO 通路在ALI/ARDS 中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［20］。這些代謝紊亂與ALI/ARDS 患者尿素氮、肌酐指標(biāo)的升高有關(guān)。

初級膽汁酸在肝臟中由膽固醇轉(zhuǎn)化而來，可能與脂肪動員甘油酯分解產(chǎn)生的脂肪酸增多及丙酮酸生成增加有關(guān)。同時，隨著炎癥反應(yīng)進(jìn)展，肝臟還需要將更多的葡萄糖轉(zhuǎn)化為脂肪酸和脂質(zhì)。這些代謝過程都會加重肝臟負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致肝內(nèi)膽汁淤積，甚至肝功能障礙，從而使肺損傷患者出現(xiàn)總膽汁酸、轉(zhuǎn)氨酶、膽紅素等臨床指標(biāo)的升高。

根據(jù)鑒定到的代謝物及代謝通路，結(jié)合臨床指標(biāo)，本研究推測肺損傷發(fā)生的代謝紊亂機(jī)制為：在創(chuàng)傷等因素打擊下，機(jī)體處于高度應(yīng)激狀態(tài)，炎癥細(xì)胞和炎癥因子網(wǎng)絡(luò)共同推動炎癥反應(yīng)進(jìn)展，引發(fā)體內(nèi)一系列代謝改變。早期階段，糖原和骨骼肌蛋白質(zhì)分解，導(dǎo)致血液中糖和氨基酸升高；隨著炎癥反應(yīng)進(jìn)展，儲存的脂肪動員并氧化為主要熱量來源，以代替消耗性糖原和蛋白質(zhì)，作為血液中脂肪分解終產(chǎn)物的游離脂肪酸和甘油隨之增加?？傊?，全身炎癥反應(yīng)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生以高分解代謝為特征的代謝紊亂（圖4）。

圖4 SIRS 患者肺損傷發(fā)生時可能的代謝紊亂機(jī)制

綜上所述，本研究提示，創(chuàng)傷等應(yīng)激因素打擊下，體內(nèi)炎癥細(xì)胞與炎癥因子網(wǎng)絡(luò)被激發(fā)導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)，誘發(fā)糖、蛋白質(zhì)、脂類物質(zhì)高分解代謝；一旦炎癥反應(yīng)影響肺泡，導(dǎo)致肺泡上皮和表面活性物質(zhì)改變，就會引起呼吸功能障礙，導(dǎo)致機(jī)體缺氧、二氧化碳潴留，繼而引發(fā)以糖酵解、糖異生、丙酮酸代謝、甘油酯代謝、精氨酸代謝、初級膽汁酸合成等通路激活為特征的系統(tǒng)代謝紊亂。本研究表明通過血清1H-NMR 譜能識別創(chuàng)傷致SIRS 至發(fā)生ALI/ARDS 后患者的代謝改變情況。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。