王藝樺，王紅坤，周云倩，董 坤，周丹銀，張 炫

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院蜂學(xué)系，云南 昆明 650201）

實(shí)時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，RT-qPCR）是一種在DNA 擴(kuò)增反應(yīng)中利用化學(xué)熒光物質(zhì)的積累，實(shí)時、準(zhǔn)確、快速地測定每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction,PCR）后產(chǎn)物總量的方法。測定過程中，通過選定參照物作為標(biāo)準(zhǔn)品，對待測樣品中的特定DNA 序列進(jìn)行定量分析。1985 年，美國PE-Cetus 公司人類遺傳研究室的Mullis 等研發(fā)了體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，即PCR 技術(shù)[1]。傳統(tǒng)PCR 技術(shù)通過高溫變性、低溫退火、適溫延伸3 個反應(yīng)階段，以待測DNA 片段為模板，合成DNA 新鏈[2]。傳統(tǒng)PCR 技術(shù)只能對產(chǎn)物進(jìn)行定性分析和粗略的定量分析，且實(shí)驗(yàn)過程中易受環(huán)境污染，這促使人們在原有PCR 技術(shù)上進(jìn)行改進(jìn)。1995 年美國PE（Perkin Elmer）公司研制出一種新型PCR 定量技術(shù)。1996 年美國ABI（Applied Biosystems）公司成功研發(fā)并推出實(shí)時熒光定量PCR 技術(shù)，該技術(shù)成功解決了傳統(tǒng)PCR 技術(shù)無法準(zhǔn)確定量以及環(huán)境污染導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果假陽性等問題[3]，且目的基因的循環(huán)擴(kuò)增以及產(chǎn)物的定量檢測分析同時進(jìn)行，極大地減少了檢測所需時間。實(shí)時熒光定量PCR 技術(shù)從根本上實(shí)現(xiàn)了DNA 的定量檢測分析，是基因擴(kuò)增技術(shù)方面的重大突破。

1 實(shí)時熒光定量P C R 的特點(diǎn)

（1）通過在PCR 反應(yīng)體系中加入能標(biāo)記特定PCR 產(chǎn)物的熒光基團(tuán)，利用其產(chǎn)生的熒光信號，可實(shí)時監(jiān)測PCR 反應(yīng)中特定產(chǎn)物每經(jīng)歷一次循環(huán)反應(yīng)所產(chǎn)生的變化量。

（2）熒光染料法和熒光探針法，均可以直接探測目的基因在擴(kuò)增過程中熒光信號的變化，從而獲得PCR 產(chǎn)物的定量結(jié)果，大大提高了檢測的靈敏度、特異性和精確性[4]。

（3）實(shí)時熒光定量PCR 儀檢測到的數(shù)據(jù)，通過連接計(jì)算機(jī)并安裝相應(yīng)分析軟件，可以在計(jì)算機(jī)上通過擴(kuò)增曲線圖、溶解曲線圖、標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，直觀反應(yīng)PCR 產(chǎn)物擴(kuò)增情況，操作簡便，效率高。

（4）RT-qPCR 反應(yīng)在一個全封閉狀態(tài)下進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和產(chǎn)物熒光信號檢測分析，有效避免了傳統(tǒng)PCR 在開放環(huán)境中檢測由于環(huán)境污染而導(dǎo)致假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，有效提高了實(shí)驗(yàn)的安全性和數(shù)據(jù)的可靠性。

（5）RT-qPCR 反應(yīng)可以一次性進(jìn)行批量樣本的PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，數(shù)據(jù)通過計(jì)算機(jī)進(jìn)行檢測分析，極大地減小了人眼觀察帶來的主觀誤差。

2 實(shí)時熒光定量P C R 的原理

實(shí)時熒光定量PCR 是在傳統(tǒng)PCR 原理上的進(jìn)一步延伸。傳統(tǒng)PCR 是在體外條件下，加入模板DNA、4 種游離的脫氧核糖核苷酸、2 種引物以及具有熱穩(wěn)定性的DNA 聚合酶，通過高溫使DNA 變性解開雙鏈結(jié)構(gòu)、降低溫度使引物與模板DNA 的單鏈進(jìn)行互補(bǔ)序列結(jié)合形成局部雙鏈，最后通過溫度升高至72℃左右，以dNTP 為原料，短時間內(nèi)快速合成大量與模板DNA 互補(bǔ)的新鏈。實(shí)時熒光定量PCR 是在傳統(tǒng)PCR 體系的基礎(chǔ)上通過加入熒光基團(tuán)或熒光探針并通過實(shí)時熒光定量PCR儀器獲得相應(yīng)熒光積累信號，該熒光信號不斷積累形成“S”型曲線即為PCR 反應(yīng)進(jìn)程，通過曲線能夠計(jì)算獲得目的樣本的初始基因分子數(shù)，進(jìn)而對整個PCR 反應(yīng)進(jìn)行定量分析。

實(shí)時熒光定量PCR 反應(yīng)中，由熒光信號積累形成的曲線稱為PCR 擴(kuò)增曲線（圖1）。該曲線以PCR 反應(yīng)循環(huán)數(shù)作為橫坐標(biāo)，實(shí)時熒光信號強(qiáng)度作為縱坐標(biāo)并引入了基線（baseline）、熒光閾值（threshold）、Ct（threshold cycle）的概念。在PCR 擴(kuò)增反應(yīng)中，從擴(kuò)增反應(yīng)開始循環(huán)到熒光信號呈現(xiàn)指數(shù)增長之前的一段時間內(nèi)，熒光信號呈一條直線，該直線稱為基線。熒光閾值是指熒光信號指數(shù)增長時的臨界值，一般是PCR 反應(yīng)3～15 個循環(huán)熒光信號標(biāo)準(zhǔn)差的10 倍[5]。Ct 值是指PCR 反應(yīng)試管中熒光信號不斷積累達(dá)到熒光閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)。Ct 值與PCR 擴(kuò)增反應(yīng)的起始目的基因量的對數(shù)成反比線性關(guān)系，Ct 值越大，起始目的基因量越小[6]。PCR 擴(kuò)增曲線通過不斷收集每一個循環(huán)積累熒光信號的強(qiáng)度，根據(jù)熒光強(qiáng)度變化對目的基因的PCR 產(chǎn)物量進(jìn)行實(shí)時檢測，最終繪制成目的基因的擴(kuò)增曲線。

圖1 實(shí)時熒光定量PCR 擴(kuò)增曲線Fig.1 Amplification curve of RT-qPCR

實(shí)時熒光定量PCR 反應(yīng)中，通過升高溫度使PCR 擴(kuò)增后的目的基因解開雙鏈結(jié)構(gòu)，熒光信號強(qiáng)度快速降低而形成的一條單峰曲線稱為溶解曲線（圖2）。該曲線以溫度作為橫坐標(biāo)，隨著時間推移的相對熒光強(qiáng)度的導(dǎo)數(shù)作為縱坐標(biāo)。溶解曲線中通過對PCR 產(chǎn)物不斷加熱，使擴(kuò)增產(chǎn)物逐漸解開雙鏈結(jié)構(gòu)，由于熒光基團(tuán)需要結(jié)合到DNA 的雙鏈結(jié)構(gòu)中，才能產(chǎn)生游離狀態(tài)下10～100 倍的熒光信號[4]，所以當(dāng)溫度升高至Tm 值（DNA 雙鏈堿基對分離50%的溫度）時，大量DNA 雙鏈結(jié)構(gòu)被破壞，熒光信號強(qiáng)度急劇下降，從而產(chǎn)生一特征峰，進(jìn)而繪制成該產(chǎn)物的溶解曲線。不同目的基因所對應(yīng)的Tm 值也不相同，其熒光信號強(qiáng)度急劇下降的溫度也不同。由此可以通過溶解曲線的特征峰判斷PCR 產(chǎn)物的特異性[7]，出現(xiàn)單峰說明PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物特異性好，出現(xiàn)雜峰則代表產(chǎn)物受到污染或者有引物二聚體的產(chǎn)生，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性較差。

(ⅱ) 對任意F∈CIrr(X),若Fδ∩(∪i∈IUi)=∪i∈I(Fδ∩Ui)≠?,則存在i∈I使得Fδ∩Ui≠?,由Ui∈τCSI及F∈CIrr(X),F∩Ui≠?,于是F∩(∪i∈IUi)≠?,從而∪i∈IUi∈τCSI。

圖2 實(shí)時熒光定量PCR 溶解曲線Fig.2 Melt curve of RT-qPCR

3 實(shí)時熒光定量P C R 的定量方法

實(shí)時熒光定量PCR 主要有2 種定量方法：絕對定量法（absolute quantification）和相對定量法（relative quantification）[8]。絕對定量法常用已知的樣本數(shù)據(jù)來確定未知樣本中某項(xiàng)數(shù)值的絕對量；相對定量法則應(yīng)用測定目的樣本和參照樣本之間某一數(shù)值的相對比率來確定。不同實(shí)驗(yàn)可以依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模x擇合適的定量方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

3.1 絕對定量法

絕對定量法是通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法對目的樣本的拷貝起始量進(jìn)行絕對定量。首先，該方法需要確定標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）；在已知標(biāo)準(zhǔn)品濃度的情況下，通常進(jìn)行10 倍稀釋，將稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時熒光PCR 反應(yīng)獲得不同稀釋程度下的拷貝數(shù)；最后，將標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對數(shù)值作為橫坐標(biāo)，所對應(yīng)的Ct 值作為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算出相應(yīng)的線性回歸方程。在定量分析過程中，將目的樣品實(shí)時熒光定量PCR 反應(yīng)過程中的Ct 值代入方程中，即可計(jì)算出目的樣本的起始拷貝數(shù)。

圖3 實(shí)時熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of RT-qPCR

3.2 相對定量法

相對定量法是指測定樣本中目的基因與另一參照基因兩者拷貝數(shù)的變化情況。實(shí)驗(yàn)過程中不需要知道它們在每個樣本中的拷貝數(shù)，便可獲得目的基因相對比值，然后判斷出目的基因在測定樣本中表達(dá)水平的高低。在使用相對定量法的實(shí)驗(yàn)過程中，待測樣本的目的基因的拷貝數(shù)來自標(biāo)準(zhǔn)曲線。將目的基因的拷貝數(shù)與參照基因的拷貝數(shù)相除，即可計(jì)算出目的基因的相對比值，該比值為參照基因拷貝數(shù)的n倍。由于在PCR 反應(yīng)中，管家基因正常表達(dá)且基本不受環(huán)境條件影響，因此需要加入管家基因作為標(biāo)準(zhǔn)參照物，從而校正上樣過程中存在的實(shí)驗(yàn)誤差，進(jìn)而保證相對定量法的真實(shí)性和準(zhǔn)確性。

4 實(shí)時熒光定量P C R 的檢測方法

實(shí)時熒光定量PCR 具有多種檢測方法，隨著分子生物學(xué)的不斷深入發(fā)展，相應(yīng)的科學(xué)檢測手段也應(yīng)運(yùn)而生。迄今為止，科學(xué)家已經(jīng)發(fā)明建立了一系列實(shí)時熒光定量PCR 技術(shù)檢測方法。具體分為2 大類，分別是DNA 染料法和熒光探針法[9]。

4.1 D N A 染料法

DNA 染料法通過在PCR 反應(yīng)體系中添加熒光染料，利用該染料會特異性結(jié)合到雙鏈DNA 小溝上并散發(fā)出熒光信號的特性[10]，散發(fā)出的熒光信號被熒光探測儀器檢測，從而實(shí)現(xiàn)對PCR 產(chǎn)物擴(kuò)增的實(shí)時檢測。實(shí)時熒光定量PCR 的DNA 染料包括SYBR Green 染料、SYBR Safe 染料、SYBR Gold 染料與 EB（Ethidium Bromide）染料，實(shí)驗(yàn)室常用的熒光染料為SYBR Green I，該染料使用方法簡單、技術(shù)成熟且成本相對較低。但是DNA 染料法在特異性檢測PCR 產(chǎn)物的過程中存在一定不足。由于該方法檢測的是PCR 反應(yīng)體系中所有的雙鏈DNA 分子，即熒光染料會與所有雙鏈DNA 分子小溝結(jié)合，當(dāng)反應(yīng)過程中有引物二聚體或非特異性擴(kuò)增的情況發(fā)生時，會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性和準(zhǔn)確性產(chǎn)生顯著影響。因此，要求實(shí)驗(yàn)過程中PCR 反應(yīng)的退火溫度要精確，所使用的引物要具有較高的特異性，在引物設(shè)計(jì)過程中減少引物二聚體的產(chǎn)生。針對這一問題還可以通過分析溶解曲線來分辨非特異性產(chǎn)物和引物二聚體，進(jìn)而排除產(chǎn)生的假陽性結(jié)果。

4.2 熒光探針法

熒光探針法（Fluorescence Probe）由3 部分組成：熒光報(bào)告基團(tuán)、熒光淬滅基團(tuán)以及連接基團(tuán)。在PCR 反應(yīng)過程中，熒光探針會與目的基因發(fā)生特異性結(jié)合，在反應(yīng)起始階段目的基因和熒光探針的化學(xué)結(jié)構(gòu)不會被破壞。此時，根據(jù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET），在熒光探針結(jié)構(gòu)完整的情況下熒光淬滅基團(tuán)會抑制熒光報(bào)告集團(tuán)所激發(fā)出的熒光信號，使熒光信號的強(qiáng)度不會發(fā)生變化。當(dāng)PCR 反應(yīng)溫度升高時，DNA 的雙鏈結(jié)構(gòu)被破壞，特異性結(jié)合到DNA上的熒光探針，其上的連接基團(tuán)功能失效，導(dǎo)致熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)之間穩(wěn)定的能量結(jié)構(gòu)被破壞，熒光淬滅基團(tuán)無法抑制熒光報(bào)告基團(tuán)釋放熒光信號。此時，隨著目的基因的大量復(fù)制，相應(yīng)的熒光探針結(jié)構(gòu)被破壞，大量熒光信號被儀器檢測到，對應(yīng)擴(kuò)增曲線上熒光信號強(qiáng)度開始呈指數(shù)增長。簡而言之，探針法是利用熒光探針會特異性與目的基因片段結(jié)合，并隨著擴(kuò)增產(chǎn)物的增加而不斷發(fā)射熒光信號來實(shí)時檢測PCR 反應(yīng)進(jìn)程。熒光探針可細(xì)分為水解探針、分子信標(biāo)和雜交探針等。

水解探針法（hydrolysis probes）是一種應(yīng)用較廣的寡核苷酸探針。該熒光探針在5' 端含有熒光報(bào)告基團(tuán)，例如ROX、FAM、VIC、NED 等，在3' 端含有熒光淬滅基團(tuán)，如TAMRA、BHQ、QSY 等[11]。當(dāng)PCR 擴(kuò)增時，熒光探針結(jié)構(gòu)被破壞，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號無法被淬滅基團(tuán)抑制，從而使儀器檢測到大量熒光信號，即DNA 模板每復(fù)制一次，就有一個熒光信號被釋放，實(shí)現(xiàn)了對PCR 擴(kuò)增反應(yīng)的實(shí)時監(jiān)測。由于需要利用Taq 酶5'→3'外切核酸酶活性將熒光探針?biāo)猓栽撎结樣址Q為TaqMan 探針。

基于TaqMan 探針而研發(fā)的TaqMan-MGB探針，是在TaqMan 探針的3'端除了熒光淬滅基團(tuán)外，再加入一種可與雙鏈DNA 的螺旋小溝特異性結(jié)合的MGB（minor groove binder）分子。MGB 使探針的Tm 值上升10℃左右且探針的長度相對縮短，降低了合成探針?biāo)璧馁M(fèi)用。另外，由于TaqMan-MGB 探針在3' 端使用非熒光淬滅基團(tuán)，使得熒光反應(yīng)的本地信號大大降低，從而提高了反應(yīng)檢測的靈敏度[12]。

4.2.2 分子信標(biāo)法

分子信標(biāo)法（molecular beacons）是一種具有莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈DNA 分子探針，由美國科學(xué)家Tyagi 和Kramer 發(fā)明[13]，該探針的兩端含有熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。由于分子信標(biāo)探針呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)，與TaqMan 探針相比，其5' 端的報(bào)告基團(tuán)與3' 端的淬滅基團(tuán)距離更近，淬滅基團(tuán)抑制熒光信號的效果更強(qiáng)。在PCR 反應(yīng)過程中，分子信標(biāo)與目標(biāo)序列的DNA 進(jìn)行互補(bǔ)結(jié)合時，莖環(huán)結(jié)構(gòu)被打開，位于5' 端報(bào)告基團(tuán)和3' 端的淬滅基團(tuán)相分離，淬滅基團(tuán)的抑制作用隨著距離的逐漸增大而減弱，進(jìn)而產(chǎn)生大量熒光信號。由于分子信標(biāo)具有極強(qiáng)的特異性，只有與其完全互補(bǔ)配對的DNA 序列存在時，才會與其特異性結(jié)合，而釋放熒光信號，因此分子信標(biāo)能夠做到準(zhǔn)確區(qū)分出只有一個核苷酸區(qū)別的DNA 序列，常用于鑒定點(diǎn)突變以及對DNA 序列進(jìn)行特異性檢測[14]。此外，發(fā)卡式引物、蝎狀引物以及LUX引物等熒光標(biāo)記引物，是基于分子信標(biāo)原理而開發(fā)的一類反應(yīng)速度快、熒光信號強(qiáng)的聯(lián)合分子探針系統(tǒng)[15]。

4.2.3 雜交探針法

雜交探針法（hybridization probes）是指在PCR 反應(yīng)體系中加入2 個特異性探針[16]，其中上游探針的5' 端標(biāo)記熒光受體基團(tuán)，下游探針的3'端標(biāo)記熒光供體基團(tuán)，2 個基團(tuán)分別位于2 個不同的探針上，且兩者需要結(jié)合到目標(biāo)序列上才可以釋放出熒光信號。在PCR 反應(yīng)進(jìn)行到退火階段時，2 個探針一前一后結(jié)合到擴(kuò)增產(chǎn)物上，兩者前后相接使受體基團(tuán)和供體基團(tuán)距離相近，供體基團(tuán)激發(fā)后產(chǎn)生的熒光能量轉(zhuǎn)移至受體基團(tuán)，使其發(fā)出紅色熒光信號從而被儀器檢測。當(dāng)2 個探針分離時，2 個基團(tuán)距離較遠(yuǎn)，儀器檢測不到受體基團(tuán)發(fā)出的紅色熒光信號。雜交探針由于需要2 個探針才能產(chǎn)生熒光信號，其特異性進(jìn)一步加強(qiáng)，但相應(yīng)的成本也較高。

5 實(shí)時熒光定量P C R 在蜜蜂科學(xué)研究中的應(yīng)用

5.1 蜜蜂疾病診斷

診斷蜜蜂疾病的方法主要有實(shí)驗(yàn)室診斷和臨床診斷。實(shí)驗(yàn)室診斷包括：病原學(xué)診斷、解剖學(xué)診斷以及血清學(xué)診斷[17，18]；臨床診斷主要是通過實(shí)際觀察蜂群整體以及蜜蜂個體（幼蟲、蛹、成蟲）的形態(tài)特征變化來判斷?；疾∶鄯渫ǔＰ袆舆t緩，蜂體形態(tài)和顏色會發(fā)生改變[19]。如蜜蜂殘翅病毒（Deformed wing virus，DWV）常使成年蜜蜂翅膀卷曲變皺，身體萎縮，體色變暗，失去飛行能力，翅膀常呈現(xiàn)“K”型且只能爬行，1～2 日后死亡；蜜蜂黑蜂王臺病毒常使蜂王幼蟲的王臺變成黑色，患病幼蟲多于前蛹期或蛹期死亡，死亡幼蟲會形成一個類似于囊狀幼蟲病的囊；螨害嚴(yán)重常出現(xiàn)幼蟲和蜂蛹死亡，在蜂箱周圍地面上可見到大量新羽化出房的幼蜂翅膀殘缺，到處爬行，衰竭死亡。

隨著實(shí)時熒光定量PCR 技術(shù)的不斷開發(fā)和應(yīng)用，蜜蜂疾病的診斷方法研究進(jìn)入到一個新的階段[20]。宋戰(zhàn)昀等[21]運(yùn)用TaqMan 探針實(shí)時定量PCR 技術(shù)成功檢測到蜜蜂囊狀幼蟲?。╯acbrood disease，SBV），該方法也適用于蜂蜜、花粉、蜂膠和蜂王漿等蜂產(chǎn)品中SBV 的檢測，為蜜蜂及相關(guān)蜂產(chǎn)品的質(zhì)量安全提供了檢測手段，為臨床快速確診蜜蜂囊狀幼蟲病，及時用藥治療并防止用藥超標(biāo)導(dǎo)致的藥物殘留提供理論和技術(shù)支撐。張?bào)w銀等[22]建立了蜜蜂克什米爾病毒（Kashmir bee virus，KBV）的Taq-Man 探針實(shí)時熒光定量方法，為KBV 的快速檢測提供了技術(shù)支撐；與此同時，張?bào)w銀等[23]建立了蜜蜂急性麻痹病毒（Acute Bee Paralysis Virus，ABPV）的TaqMan 探針實(shí)時熒光定量方法，為ABPV 的精確檢測提供了技術(shù)支持。楊倩等[24]通過TaqMan 探針實(shí)時定量PCR 技術(shù)原理，成功建立黑蜂王臺病毒(Black queen cell virus，BQCV)的快速檢測手段，為控制黑蜂王臺病毒的傳播和提高蜂王幼蟲成活率提供了技術(shù)保障。

王琛等[25]運(yùn)用TaqMan-MGB 探針建立的實(shí)時熒光定量RT-PCR 成功對DWV 進(jìn)行實(shí)時檢測，該方法與王蕾等[26]通過使用SYBR Green I熒光染料建立的實(shí)時熒光定量RT-PCR 檢測方法相比較，TaqMan-MGB 探針法能夠檢測到拷貝數(shù)10 以下的病毒載量，靈敏度更高。該方法還具有背景信號強(qiáng)度低、探針引物精確度高、特異性強(qiáng)，以及操作簡便、速度快等特點(diǎn)。TaqMan-MGB 探針的研究開發(fā)，為DWV的病原檢測及其流行病學(xué)調(diào)查提供了技術(shù)支撐。

5.2 蜜蜂病理學(xué)研究

美洲幼蟲腐臭?。ˋmerican foulbrood，AFB）又稱“爛子病”，是一種主要危害蜜蜂幼蟲并導(dǎo)致幼蟲蟲體腐爛的疾病。該病易造成幼蟲死亡以及蜂群整體群勢下降，一旦發(fā)生難以徹底清除。AFB 是由幼蟲芽孢桿菌引發(fā)的疾病，控制病因是一種有效的防范措施。何曉杰等[27]運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR TaqMan 探針法對幼蟲芽孢桿菌進(jìn)行定量檢測分析，進(jìn)而監(jiān)控蜜蜂體內(nèi)AFB 的含量。該方法的建立能夠?yàn)锳FB 的早期診斷和預(yù)防提供信息參考。

歐洲幼蟲腐臭病(European foulbrood，EFB)的致病菌為蜂房蜜蜂球菌，其余細(xì)菌如幼蟲芽孢桿菌等為次生菌。該病多發(fā)于群勢較弱的蜂群，幼蟲染病后蟲體失去光澤并發(fā)黃，病蟲死亡后會散發(fā)酸臭氣味，影響蜂群群勢。何曉杰等[28]通過實(shí)時熒光定量PCR 方法對蜜蜂歐洲幼蟲腐臭病病原菌進(jìn)行定量分析，為蜂產(chǎn)品中蜂房蜜蜂球菌的檢測以及EFB 的預(yù)防提供了技術(shù)指導(dǎo)。

5.3 蜜蜂基因功能表達(dá)研究

實(shí)時熒光定量PCR 技術(shù)是一種研究基因功能表達(dá)的良好平臺，通過該技術(shù)能檢測和分析目的基因在不同組織的時空表達(dá)模式，從而為進(jìn)一步闡明目的基因在樣本中的生物學(xué)功能提供理論依據(jù)。

王宇飛等[29]和齊磊等[30]運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR 檢測了意大利蜜蜂不同日齡的工蜂觸角中化學(xué)感受蛋白基因 CSPs家族（Amel-CSP1～Amel-CSP6，其中Amel-CSP5 表達(dá)穩(wěn)定無特異性)的表達(dá)情況，結(jié)果顯示Amel-CSP1、Amel-CSP6 可能與意蜂工蜂工作行為轉(zhuǎn)變有關(guān)；Amel-CSP2 則與工蜂羽化和信息素的接受有關(guān)；Amel-CSP3 在蜜蜂搜索蜜源過程中具有一定的氣味運(yùn)輸功能；Amel-CSP4可能與信息素的傳遞和運(yùn)輸有關(guān)。王琦[31]等通過實(shí)時熒光定量PCR 技術(shù)測定了西方蜜蜂各級型不同發(fā)育階段昆蟲血淋巴19 k Da 蛋白（HP19）的轉(zhuǎn)錄水平，揭示了該蛋白在西方蜜蜂變態(tài)發(fā)育期起重要調(diào)控作用。劉川東等[32]應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR 測定西方蜜蜂蛻皮激素早期應(yīng)答因子ecr 和usp 在蜜蜂不同級型、不同發(fā)育時期的表達(dá)水平，揭示了蛻皮激素對蜜蜂生長發(fā)育、蛻皮變態(tài)有調(diào)控作用。李曉燕等[33]利用實(shí)時熒光定量PCR 技術(shù)對MRJP7（王漿蛋白基因家族成員之一）在意大利蜜蜂各級型不同發(fā)育階段、不同組織中進(jìn)行定量檢測分析，結(jié)果表明MRJP7 在工蜂羽化后9 日齡前后的哺育蜂王漿腺和頭部高水平特異性表達(dá)，這與工蜂會哺育幼蟲和蜂王的行為相適應(yīng)，證明MRJP7 具有一定的營養(yǎng)功能。

5.4 蜂產(chǎn)品運(yùn)用研究

實(shí)時熒光定量PCR 技術(shù)在蜜蜂蜂產(chǎn)品研發(fā)中也有一定程度的研究。王芳[34]使用實(shí)時熒光定量PCR 技術(shù)檢測了不同濃度下水溶性殼聚糖對蜂花粉源菌群的抑制作用，結(jié)果表明將殼聚糖運(yùn)用到蜂花粉中可抑制菌群生長，并為由蜂花粉引起的蜜蜂疾病提供預(yù)防作用，為相關(guān)藥物的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。柳吉芹等[35]利用實(shí)時熒光定量PCR TaqMan 探針法，通過設(shè)計(jì)2 種針對中蜂和意蜂的特異性探針，對中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜之間MRJP2 的分子量進(jìn)行檢測鑒定。PCR 擴(kuò)增結(jié)果顯示大多數(shù)中蜂蜂蜜存在摻假現(xiàn)象。研究提供的鑒別方法能夠快速有效地區(qū)分中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜，并為蜂產(chǎn)業(yè)的良好健康發(fā)展提供了方法。

6 展望

實(shí)時熒光定量PCR 技術(shù)自發(fā)明至今，在蜜蜂疾病診斷檢測方面已得到廣泛應(yīng)用。蜜蜂病毒如：DWV、SBV、KBV 等，其病原體的檢測診斷已得到較為充分的研究。由于實(shí)時熒光定量PCR 技術(shù)能夠定量測定基因量且具有檢測速度快、精度高、誤差小、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，目前已經(jīng)成為分子生物學(xué)相關(guān)研究的重要技術(shù)。隨著實(shí)時熒光定量PCR 技術(shù)的不斷更新?lián)Q代，儀器操作更加簡便、實(shí)驗(yàn)成本降低、反應(yīng)靈敏度大幅提高，結(jié)合生物芯片技術(shù)、肽核酸技術(shù)、微解剖技術(shù)等其他先進(jìn)檢測技術(shù)，實(shí)時熒光定量PCR 技術(shù)在蜜蜂科學(xué)研究中將會有更為廣闊的應(yīng)用前景。