潘 雪，高春峰，邢玉斐，鐘安媛，周 童，張增利，施敏驊

蘇州大學附屬第二醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，江蘇 蘇州 215004

2021年美國癌癥協(xié)會數(shù)據(jù)報告，肺癌仍是目前人類死亡率最高（男性22%，女性22%）的腫瘤［1］。肺癌的惡性程度較高，病情進展較快，超過70%的患者在確診時已出現(xiàn)局部或遠隔器官的轉移，失去了手術治療的最佳時機［2］。表皮生長因子受體?酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor?tyrosine kinase inhibitor，EGFR?TKI）已成為表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因敏感突變患者的一線標準治療，建議初診非小細胞肺癌患者完善新一代基因測序（next?generation sequencing technology，NGS）檢測［3］。NGS 檢測除了可為患者選擇合適的靶向治療外，還可以預測療效，發(fā)現(xiàn)耐藥機制，同時能發(fā)現(xiàn)新的基因突變類型，為靶向藥物研發(fā)提供依據(jù)［4］。本研究回顧性分析經NGS檢測的71例肺癌患者的基因檢測數(shù)據(jù)，并進一步分析其臨床意義。

1 對象和方法

1.1 對象

納入蘇州大學附屬第二醫(yī)院2015 年12 月—2020年7月入組的肺癌患者，依據(jù)氣管鏡、電子計算機斷層掃描（computed tomography，CT）引導下經皮肺穿刺、胸腔積液病理結果明確診斷?；颊呋蚣覍倬押炇饡嬷橥鈺?，本研究已經蘇州大學附屬第二醫(yī)院倫理委員會審批［（2013）倫審科研第（K11）號］通過。

納入標準：①組織學或細胞學確診的肺癌患者；②年齡≥18歲。排除標準：①同時有其他惡性腫瘤；②存在可能影響隨訪和短期生存的其他嚴重疾病；③既往服用過EGFR?TKI 等靶向藥物、免疫藥物；④既往接受過化療、放療或其他治療。共納入71例患者（132份標本）。

1.2 標本收集及患者隨訪

1.2.1 檢測標本

腫瘤組織來源為氣管鏡下活檢組織標本、肺穿刺活檢組織標本，循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor deoxyribo nucleic acid，ctDNA）檢測標本為外周血液、胸腔積液、腦脊液。

1.2.2 標本收集

血液、胸腔積液、腦脊液標本：收集患者用藥前和耐藥后全血（8 mL）或胸腔積液（8 mL）或腦脊液（3 mL），保存于streck管，并于管壁標記患者姓名及樣品號，15～35 ℃條件下運輸，72 h內運送至實驗室。4 ℃條件下，1 590g離心10 min，收集上清至15 mL離心管，4 ℃條件下16 000g離心10 min，再次收集上清至新的15 mL離心管。封口膜封口后干冰運輸。

石蠟組織標本：收集患者腫瘤組織切片，要求惡性腫瘤細胞占比≥10%，壞死組織區(qū)域≤50%，標本編號標記規(guī)范清晰，石蠟組織標本切片厚度5 μm（防脫玻片），切片時攤片即可，無需烤片處理，取6 周以內的石蠟切片，每組切片15 張，常溫或2～8 ℃運輸。

1.2.3 檢測方法

采用NGS檢測技術（廣州燃石醫(yī)學檢驗所有限公司：Illumina 公司檢測平臺，美國）捕獲與腫瘤發(fā)生發(fā)展高度相關基因的全部外顯子，包括腺瘤性結腸息肉（adenomatous polyposis coli，APC）、乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）、細胞周期依賴性激酶抑制基因2A（cyclin?dependent kinase inhibitor 2A gene，CDKN2A）等，及與肺癌個性化治療相關或高頻突變基因的重要外顯子及部分內含子區(qū)域，包括間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）、鼠類肉瘤病毒癌基因同源物B1（v?raf murine sarcoma viral onco?gene homolog B1，BRAF）、細胞周期蛋白E1（cyclin E1，CCNE1）等，進行1 000×高深度測序，以測量上述基因中出現(xiàn)的低頻及超低頻的來自腫瘤的DNA突變、重排、拷貝數(shù)增加等。

1.2.4 生存隨訪

通過門診或電話隨訪，于2016 年1 月開始，每個月隨訪1次，直至患者死亡或研究結束。隨訪截至2020年11月30日，患者在隨訪截止時間仍未死亡，則按截尾數(shù)據(jù)處理。中位隨訪時間28.5個月。隨訪率為95%，3例失訪?？偵嫫冢╫verall survival，OS）定義為患者治療開始至患者死亡或末次隨訪的時間，中位OS定義為生存率為50%時所對應的生存時間。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism7.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。定性資料采用例數(shù)和率描述；符合正態(tài)分布的定量資料，采用均數(shù)±標準差（）表示；非正態(tài)分布資料，采用中位數(shù)（四分位數(shù)）［M（P25，P75）］表示，兩組間比較采用Mann?WhitneyU檢驗，多組間比較采用Kruskal?Wallis 檢驗，配對設計資料采用Wil?coxon 符號秩和檢驗。采用Kaplan?Meier 法繪制生存曲線圖，比較采用Log?rank 檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般臨床資料

本研究共入組71 例患者，共132 份標本，檢測標本類型包括血液（67 份）、腫瘤組織（48 份）、胸腔積液（15 份）、腦脊液（2 份）。71 例患者均為初診患者，其中男性32 例、女性39 例；年齡（65±11）歲，年齡范圍36～85歲；其中Ⅰ期患者2例，Ⅱ期患者3例，Ⅲ期患者3 例，Ⅳ期患者63 例；吸煙患者23 例；腺癌患者62 例，鱗狀細胞癌患者7 例，小細胞肺癌患者2 例。所有檢測標本EGFR 突變陽性率39.4%（52/132）。所有檢測標本除EGFR 突變之外，另外可檢測到前5位基因突變/擴增分別是腫瘤蛋白p53（tumor suppressor protein p53，TP53）、鼠類肉瘤病毒癌基因（Kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS）、表皮生長因子受體2（human epithelial growth factor receptor 2，ERBB2）、視網膜母細胞瘤基因1（retino?blastoma 1，RB1）、肝細胞生長因子酪氨酸激酶受體（hepatocyte growth factor receptor，MET）。

2.2 初診肺癌患者血液伴隨基因狀態(tài)

共入組初診肺癌患者血液標本50例，基于血漿ctDNA NGS 檢測結果顯示，EGFR 突變陽性率34%（17/50），除EGFR 突變之外，所檢測標本還可檢測到79 種基因突變/擴增，共出現(xiàn)123 次伴隨基因突變/擴增，人均2.46次/例（123次/50例），伴隨基因突變/擴增頻數(shù)≥2 次的見圖1，伴隨基因突變/擴增頻數(shù)為1 次的共有60 種基因，伴隨基因突變/擴增（除EGFR 外）與患者臨床分期、吸煙、年齡、性別、病理類型均無關（均P＞0.05，表1）。

表1 50例初診肺癌患者血液標本伴隨基因突變/擴增頻數(shù)與臨床病理特征的關系Table 1 Correlation between frequency of associated gene mutation/amplification and clinicopatho?logical features in blood samples of 50 newly diagnosed lung cancer patients

圖1 50例初診肺癌患者血液標本伴隨基因突變/擴增頻數(shù)分布圖Figure 1 Frequency distribution of gene mutation/amplification in blood samples from 50 newly diagnosed lung cancer patients

除EGFR 突變之外，初診肺癌患者血液標本中伴隨基因TP53突變頻數(shù)最高，因此針對此基因做進一步生存分析。入組Ⅳ期肺癌患者血液標本40例，TP53陽性患者中位OS為66個月，TP53陰性患者中位OS 為47 個月，兩組生存曲線差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.321，P=0.571，圖2）。

圖2 肺癌患者血液標本伴隨基因TP53陽性和陰性患者生存曲線的比較Figure 2 Comparison of survival curves between patients with TP53 positive and negative concomitant gene in blood samples of lung cancer patients

2.3 初診肺癌患者腫瘤組織伴隨基因狀態(tài)

共入組初診肺癌患者腫瘤組織46 例，EGFR 突變陽性率50%（23/46），除EGFR 突變之外，所檢測標本還可檢測到160 種基因突變/擴增，所有標本共出現(xiàn)285 次伴隨基因突變/擴增，人均6.20 次/例（285 次/46 例），伴隨基因突變/擴增頻數(shù)≥2 次的見圖3，伴隨基因突變/擴增頻數(shù)為1 次的共有107 種，伴隨基因突變/擴增（除EGFR 外）與患者臨床分期、年齡均無關（均P＞0.05），與吸煙狀態(tài)、性別、病理類型均有關（均P＜0.05，表2）。

表2 46例初診肺癌患者腫瘤組織標本伴隨基因突變/擴增頻數(shù)與臨床病理特征的關系Table 2 Correlation between frequency of associated gene mutation/amplification and clinicopatho?logical features in tumor tissue samples of 46 newly diagnosed lung cancer patients

圖3 46例初診肺癌患者腫瘤組織標本伴隨基因突變/擴增頻數(shù)分布圖Figure 3 Frequency distribution of gene mutation/amplification in tumor tissue samples from 46 newly diagnosed lung can?cer patients

除EGFR 突變之外，初診肺癌患者腫瘤組織標本中伴隨基因TP53出現(xiàn)突變頻數(shù)最高，因此針對此基因做進一步生存分析，入組Ⅳ期肺癌患者腫瘤組織標本25 例，TP53 陽性患者中位OS 未達到，TP53陰性患者中位OS為38.5個月，兩組生存曲線間差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.309，P=0.579，圖4）。

圖4 肺癌患者腫瘤組織標本伴隨基因TP53陽性和陰性患者生存曲線的比較Figure 4 Comparison of survival curves between patients with TP53 positive and negative concomitant gene in tumor tissue samples of lung cancer patients

2.4 同時進行腫瘤組織和血液標本配對檢測的患者伴隨基因狀態(tài)

共入組25 例，初診腫瘤組織中基因突變/擴增頻數(shù)［3（1，8）］高于同一患者的血液組［3（0，1）］，兩者之間差異有統(tǒng)計學意義（W=-150，P=0.001）；動態(tài)監(jiān)測抗腫瘤治療前后的17例患者，其中使用EGFR?TKI 治療9 例，間變性淋巴瘤激酶抑制劑（anaplastic lymphoma kinase inhibitor，ALK?TKI）治療3 例，化療5 例，抗腫瘤治療前后兩組伴隨基因突變/擴增頻數(shù)相比［1（0，2）vs.1（0，3）］，差異無統(tǒng)計學意義（W=-3，P=0.916）。

3 討論

全面的分子生物學檢測信息可為肺癌患者方案選擇、預后判斷以及臨床試驗入組提供依據(jù)。準確獲取患者基因的突變狀態(tài)，有助于篩選更加合適的治療人群，精準地指導臨床個體化治療，為腫瘤診斷、治療方案選擇、預后監(jiān)控等提供重要信息［5］。以EGFR 為例，與標準化療方案相比，EGFR 敏感突變型晚期非小細胞肺癌患者使用小分子靶向藥物EGFR?TKI 治療，極大地提高了該患者群的臨床療效（客觀緩解率、無進展生存期、總生存時間）及生命質量［6］。但仍有20%～30%的EGFR 敏感基因突變的患者出現(xiàn)原發(fā)性耐藥或快速進展，可能是由于EGFR 突變合并其他伴隨基因突變，導致下游或旁路信號通路激活［7］。BENEFIT 研究是一項單臂、多中心、前瞻性、大型Ⅱ期臨床試驗（CTONG1405；NCT02282267），2014 年12 月—2016 年1 月，共納入中國15個中心的426例Ⅳ期肺腺癌患者，其中391例具有組織和血液樣本，188 例患者血液EGFR 突變陽性并接受吉非替尼治療（250 mg/d），在180 例具有基線NGS 數(shù)據(jù)的EGFR 突變患者中，僅存在EGFR 敏感突變患者，無進展生存期可達13.2個月，EGFR敏感突變合并TP53 突變患者，無進展生存期為9.3 個月，伴隨其他基因突變亞組患者，無進展生存期僅為5.5個月［8］。

正常情況下TP53可以控制細胞循環(huán)周期、調節(jié)轉錄、DNA復制和誘導細胞程序性死亡及抗血管生成。TP53突變幾乎在所有人類癌癥中均有發(fā)生，是最常見的突變基因之一，在肺鱗狀細胞癌患者中甚至高達80%［9-10］。TP53突變可激活T細胞介導的免疫反應，可能成為免疫治療療效的潛在預測因子［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，伴隨基因TP53 突變與否與生存率無關，可能與本研究入組患者多為使用靶向藥物治療患者，且免疫治療患者相對較少有關，后續(xù)有待進一步增大樣本量進行統(tǒng)計學分析。在肺癌患者組織標本中行生存分析時，TP53 陽性患者中位OS 未達到，考慮可能與隨訪時間仍較短，且樣本量不足有關，后續(xù)有待進一步增大樣本量行統(tǒng)計學分析。

本研究共入組初診肺癌患者血液標本50例，除EGFR 突變之外，所檢測標本還可檢測到79 種基因突變/擴增，共出現(xiàn)123 次伴隨基因突變/擴增；本研究入組初診肺癌患者腫瘤組織46例，除EGFR 突變之外，所檢測標本還可檢測到160 種基因突變/擴增，所有標本共出現(xiàn)285 次伴隨基因突變/擴增，同一患者腫瘤組織標本中伴隨基因突變/擴增頻數(shù)高于血液標本，原因可能是腫瘤患者體內ctDNA 的含量低、半衰期短、需要高靈敏度的檢測技術進行基因檢測［12］。另外，需考慮腫瘤存在異質性，腫瘤組織檢測反映腫瘤局部基因水平狀態(tài)，基于ctDNA 的基因檢測更能反映患者的整體狀態(tài)，并允許實時監(jiān)測，可作為腫瘤組織基因檢測的補充［13］。

本研究針對抗腫瘤治療前后的17 例患者進行基因檢測結果分析，發(fā)現(xiàn)抗腫瘤治療前和抗腫瘤治療后兩組伴隨基因突變/擴增頻數(shù)相比，差異無統(tǒng)計學意義，原因可能為入組病例較少，且各組患者一線治療方案有所差異，不同的治療方案可能導致基因突變/擴增發(fā)生改變，后續(xù)將進一步擴大樣本量，同時針對不同臨床標本及不同治療方案的患者分別進行統(tǒng)計分析。另外，本研究入組胸腔積液、腦脊液病例以及病理類型為鱗狀細胞癌、小細胞癌病例均較少，后續(xù)應盡可能擴大樣本量。本研究為單中心研究，期待有更多的隨機對照研究進一步探索伴隨基因異常對患者預后的影響。

肺癌患者抗腫瘤治療前即存在多種伴隨基因突變/擴增，有吸煙史、男性患者具有較高水平的伴隨基因突變/擴增頻數(shù)，伴隨基因突變/擴增頻數(shù)的改變不能提示患者病情進展，隨著靶向治療和免疫治療逐漸在腫瘤治療中占據(jù)主導地位，基因測序技術具有極大的發(fā)展前景。肺癌是一個多基因參與的復雜病變過程，采用多標本、多基因的平行、動態(tài)檢測有助于反映肺癌驅動基因全貌，更全面評估腫瘤的耐藥機制，對臨床具有指導意義。