王 學，伊 晴，劉小琴，張英為，周玉皆

南京中醫(yī)藥大學鼓樓臨床醫(yī)學院呼吸與危重癥醫(yī)學科，江蘇 南京 210008

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是以不明原因的肺泡結(jié)構(gòu)破壞和成纖維細胞灶聚集為特點的慢性間質(zhì)性肺炎，老年人發(fā)病率高，臨床上多表現(xiàn)為進行性呼吸困難伴刺激性干咳，患者多死于呼吸衰竭和繼發(fā)性肺部感染。本病的發(fā)病和進展機制尚未闡明，確診后中位生存期僅為2～3年，大部分患者預后較差［1］。目前已上市的吡非尼酮和尼達尼布雖可延緩肺纖維化進程，降低疾病死亡風險，但IPF的中位生存期并未顯著提升［2］?，F(xiàn)已知，IPF臨床過程個體差異性顯著，少數(shù)患者可以長期穩(wěn)定，一些患者緩慢進展，部分患者則快速進展而死亡，因此，急需簡單便捷的方法來預測疾病嚴重程度、進展風險，以便及時采取有效治療措施，提高患者生存率。

2012 年Ley 等［3］針對IPF 患者開發(fā)了一個多維風險預測模型和分期系統(tǒng)，稱為GAP模型。近年在臨床上已廣為應用。Tran等［4］的一項研究結(jié)果就是GAP 模型/分期對IPF 患者死亡風險預測作用的一個有力佐證。該研究納入了1 620例IPF患者，依據(jù)GAP評分將患者分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期，結(jié)果顯示與Ⅰ期患者相比，Ⅱ、Ⅲ期患者病死率升高，且Ⅲ期患者病死率最高；在校正患者肺動脈高壓、肺癌、長期氧療等影響因素后，Ⅱ、Ⅲ期患者病死率仍然高于I期患者。

此外，科學家也在探索其他生物標志物來預測IPF的病情進展及預后。其中最為大家所熟悉的就是趨化因子CCL2［chemokine（C?C motif）ligand 2］。CCL2在1977年被首次發(fā)現(xiàn)，是一類肝素結(jié)合蛋白，同時也是第1 個被發(fā)現(xiàn)的人趨化因子，可由內(nèi)皮細胞、成纖維細胞［5］、上皮細胞、單核細胞和小膠質(zhì)細胞等產(chǎn)生，其中單核細胞是CCL2的主要來源，因此又被稱為單核細胞趨化蛋白?1（monocyte chemotac?tic protein?1，MCP?1）。其主要功能是響應促炎細胞因子信號，選擇性招募單核細胞、中性粒細胞、淋巴細胞，趨化細胞定向轉(zhuǎn)移。在小鼠纖維化模型中，CCL2 的表達增加吸引成纖維細胞移動并刺激其膠原蛋白的分泌和增殖。當抑制肺泡上皮細胞中CCL2 產(chǎn)生或拮抗CCL2 作用時，小鼠肺組織膠原蛋白沉積及纖維化情況均減弱［6-7］。且CCL2敲除小鼠還可免受博來霉素誘導的肺纖維化。早期研究發(fā)現(xiàn)，與穩(wěn)定期相比，急性期IPF患者BALF中CCL2水平顯著升高［8］，在CCL2水平升高的10例患者中，9例患者5 年內(nèi)死亡。近期研究發(fā)現(xiàn)，與肺炎患者和正常對照組相比，特發(fā)性間質(zhì)性肺炎（idiopathic inter?stitial pneumonia，IIP）患者血清CCL2 水平顯著升高［9］。并且血清CCL2水平與肺間質(zhì)病變的嚴重程度顯著相關(guān)；隨后相關(guān)性分析顯示IIP 患者血清CCL2水平與肺組織彌散功能呈負相關(guān)，與乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）呈正相關(guān)。因此，CCL2可預測IPF的預后。

既然GAP和CCL2均可用于IPF預后分析，本研究旨在探討二者之間是否存在一定相關(guān)性，以及臨床實踐中二者對預后的判斷效能。

1 對象和方法

1.1 對象

研究回顧性分析了2017年1月—2019年12月在南京鼓樓醫(yī)院住院確診的35 例IPF 患者的臨床資料，同時收集了10 例門診因慢性咳嗽（chronic cough，CC）就診、但無其他肺部疾病或其他器官疾病患者的病歷資料。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準（倫理批準文號：2021?606?02），所有患者知情同意。

納入標準：①IPF 患者符合2011 年發(fā)布的美國胸科學會/歐洲呼吸學會/日本呼吸學會/拉丁美洲胸科學會的診斷標準［10］；②CC 患者符合中華醫(yī)學會CC診斷和治療指南［11］；③所有患者均進行支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）、肺功能、胸部計算機斷層掃描檢查和血液學分析；④IPF患者在治療前完成檢查。

排除標準：①其他已知原因的間質(zhì)性肺疾病，如家庭和職業(yè)環(huán)境暴露、結(jié)締組織病和藥物毒性導致的間質(zhì)性肺疾病等；②IPF的急性加重；③缺少任何一項該研究所需的檢驗或檢查結(jié)果者。

1.2 方法

1.2.1 血清和BALF中CCL2的收集

收集患者在南京鼓樓醫(yī)院檢驗科進行檢驗后剩余的血液標本，以3 000 r/min 離心5 min，收集上層血漿/血清并在-80 ℃下儲存直至測量。

全麻或局麻下，以電子支氣管鏡經(jīng)鼻或經(jīng)口進入氣管，常規(guī)觀察后插入右中葉或左舌葉支氣管開口處，以37 ℃的無菌等滲鹽水分次注入并回吸收，每次20 mL，共進行5次相同操作、總體積為100 mL?；旌纤谢厥盏腂ALF，除去正常送檢化驗外所剩標本立即通過兩層紗布過濾，并在室溫下以1 500 r/min離心10 min。BALF儲存在實驗室-80 ℃。

上述標本，通過酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme?linked immunosorbent assay，ELISA）測定其中血清和BALF中CCL2的水平。

1.2.2 GAP評分

GAP模型由4個基線變量性別（G）、年齡（A）和2個肺生理學變量（P）［用力肺活量與預計值百分比（percentage of predicted forced vital capacity，F(xiàn)VC%）和氧化碳彌散量（percentage of predicted diffusing capacity for carbon monoxide，DLCO%）］組成。根據(jù)患者的性別、年齡、生理學指標依次打分，總分為8 分。根據(jù)總評分，患者可分為Ⅰ期（0～3 分）、Ⅱ期（4～5分）和Ⅲ期（6～8分）。

1.2.3 患者預后

以電話隨訪的方式，聯(lián)系患者及家屬，咨詢患者當前的生存狀況，隨訪時間截至2021 年8 月31 日。不能接通電話者，再以短信息形式進行溝通。

1.2.4 小鼠肺纖維化模型的構(gòu)建

將32只6～8周齡雄性C57BL/6小鼠隨機分為生理鹽水對照（contrast，C）組、博來霉素（bleomycin，BLM）組，每組16 只小鼠。小鼠氣管內(nèi)霧化注入5 mg/kg 的BLM 構(gòu)建肺纖維化模型，于實驗造模后第21天，經(jīng)實驗動物電子計算機斷層掃描證實模型成功后，處死所有小鼠，收集小鼠肺組織、血清和BALF。對肺組織石蠟切片行蘇木精?伊紅（hematox?ylin?eosin staining，HE）染色以及馬松（Masson）染色，觀察小鼠肺組織的病理改變并行Ashcroft評分。

1.2.5 小鼠血清和BALF的收集

各組小鼠腹腔注射50 μL的3%戊巴比妥鈉進行麻醉后，固定四肢，并打開其胸腔，用1 mL注射器在小鼠心臟搏動最強處刺入，緩慢回抽針筒可見血液流入針管。室溫下靜置30～60 min，再以3 000 r/min離心5 min，收集上層血清并在-80 ℃冰箱儲存、待測。

用自制灌洗針插入小鼠主支氣管固定后，1 mL注射器吸取生理鹽水棄掉針頭連接灌洗針，緩慢注入小鼠全肺，行支氣管肺泡灌洗，每次灌注量為1 mL，回吸收后再灌注新的灌洗液，如此反復共3次，收集所有BALF，并在室溫下以1 500 r/min 離心10 min。上清儲存在-80 ℃冰箱、待測。

上述標本通過酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）測定其中血清和BALF中CCL2的水平。

1.2.6 Ashcroft評分

Ashcroft 評分適用于評價肺、肝、心和腎的組織纖維化。根據(jù)組織染色后膠原蛋白面積與整個切片中選擇的分析區(qū)域面積之比定量纖維化程度。分為0～8 分：0 分，組織無纖維化改變；1 分，肺泡壁或支氣管壁輕微纖維增厚；2、3分，肺泡壁或支氣管壁中度增厚，對肺結(jié)構(gòu)無明顯損害；4、5分，纖維化增加，肺結(jié)構(gòu)明顯損傷，無纖維帶或小纖維團；6、7分，結(jié)構(gòu)嚴重變形，纖維面積大，“蜂窩肺”也屬于這一類；8分，視野下肺結(jié)構(gòu)大片纖維閉塞。分值越高，其纖維化程度越重。這部分實驗由2位病理學專家分別進行了獨立評分。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計分析。對服從正態(tài)或近似正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（）的形式表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。使用斯皮爾曼相關(guān)性分析。通過Kaplan?Meier 生存分析比較IPF Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期之間的生存時間。受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROS）曲線分析CCL2 與疾病進展之間的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

IPF組患者中，男23例，女12例，男∶女為23∶12。其中年齡最大為78歲，最小為43歲。吸煙者15例，不吸煙者20例。CC組患者因支氣管鏡檢的接受度差，故僅納入10例，其中男6例，女4例，年齡最大為72歲，最小為47歲（表1）。

表1 一般情況比較Table 1 Comparison of general conditions

2.2 血氣分析檢測結(jié)果

CC組、35例IPF患者依據(jù)GAP分期后分為（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）期的氧合指數(shù)、二氧化碳分壓檢測結(jié)果見表2。在血氣分析中，IPF組（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期）與CC組4組兩兩比較顯示二氧化碳分壓差異無統(tǒng)計學意義，氧合指數(shù)差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，圖1A）。

表2 血氣分析比較Table 2 Comparison of blood gas analysis

2.3 肺功能檢測結(jié)果

CC 組患者因胸部CT 均正常，為減少患者經(jīng)濟支出而只查FVC%。在肺功能中，與CC組相比，IPF組（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期）FVC%均下降（P<0.05）。Ⅱ期和Ⅲ期FVC%較Ⅰ期顯著下降（P<0.05），Ⅱ期和Ⅲ期之間FVC%差異不大（圖1B）；Ⅱ期和Ⅲ期DLCO%較Ⅰ期有明顯降低（P<0.05），Ⅱ期和Ⅲ期之間DLCO%無差異（圖1C）。

圖1 依據(jù)GAP評分血氣分析和肺功能組間比較Figure 1 Comparison between blood?gas analysis and lung function groups according to GAP score

2.4 BALF回收率及BALF中細胞分類計數(shù)

2.4.1 BALF回收率

IPF 組和CC 組比較，BALF 回收率差異沒有統(tǒng)計學意義（表3），IPF 組（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期）之間比較，BALF回收率差異也沒有統(tǒng)計學意義。

2.4.2 細胞分類

BALF 中細胞類型主要為巨噬細胞、淋巴細胞和中性粒細胞。與CC 組相比，IPF 組BALF 中淋巴細胞減少、中性粒細胞增加（P<0.05，表3），巨噬細胞差異無統(tǒng)計學意義。IPF組（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期）與CC組4組兩兩比較顯示淋巴細胞、巨噬細胞、中性粒細胞差異均無統(tǒng)計學意義。

表3 CC組和IPF組BALF中細胞比例及分類Table 3 Cell types in BALF of CC group and IPF group

2.5 血清和BALF中CCL2檢測

與CC 組相比，IPF 組血清中CCL2 水平明顯升高（P<0.05，圖2A）。IPF 組（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期）與CC 組4 組兩兩比較，IPF 組（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期）血清中CCL2 水平均升高（P<0.05），然而Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期之間兩兩比較差異無統(tǒng)計學意義（圖2B）。與CC 組相比，IPF 組BALF中CCL2水平顯著升高（P<0.05，圖2C），除了IPFⅠ期與CC組之間BALF中CCL2水平差異無統(tǒng)計學意義，IPF組Ⅱ期與CC組、Ⅲ期與CC組、IPF組（各期）之間BALF 中CCL2 差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05，圖2D）。

圖2 CC組和IPF組血清、BALF中CCL2水平比較Figure 2 Comparison of CCL2 levels in serum and BALF between CC group and IPF group

2.6 血清和BALF中CCL2的相關(guān)性分析

采用斯皮爾曼法分析IPF 患者血清和BALF 中CCL2的相關(guān)性。血清中CCL2水平與FVC%、DLCO%間無相關(guān)性（r=-0.088，P=0.617；r=-0.178，P=0.320）。同時，血清中CCL2 與GAP 評分也無相關(guān)性（r=0.082，P=0.639）。BALF中CCL2與巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞均無相關(guān)性，與FVC%（r=-0.488，P<0.01）和DLCO%（r=-0.581，P<0.01）均呈負相關(guān)。同時，BALF 中CCL2 與GAP 評分之間存在正相關(guān)（r=0.847，P<0.01，圖3）。

圖3 BALF中CCL2與FVC%、DLCO%、GAP評分的相關(guān)性Figure 3 Correlation between CCL2 and FVC%，DLCO%and GAP scores in BALF

2.7 IPF組存活時間比較

35例IPF患者隨訪時間從2019年12月—2021年8月，其中14例患者死亡，11例存活，10例因患者或家屬拒接電話、無視短信溝通而失訪。通過Kaplan?Meier曲線分析IPF組（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期）間生存時間的差異，結(jié)果顯示Ⅱ、Ⅲ期患者生存時間明顯低于Ⅰ期患者（P<0.01）。Ⅱ期和Ⅲ期患者生存時間無明顯差異（圖4A）。

進一步通過ROC 曲線判斷BALF 中CCL2 水平對IPF患者死亡風險的評估作用，結(jié)果顯示BALF中CCL2水平≥363.74 pg/mL時，患者病死率增加，該結(jié)果的曲線下面積（area under curve，AUC）為0.916（95%CI為0.808～1.000），靈敏度為71.4%，特異度為100.0%（圖4B）。

圖4 IPF患者各期生存曲線、BALF中CCL2水平評估IPF患者死亡風險的ROC圖Figure 4 Survival curve of IPF patients and ROC chart of CCL2 level in BALF to evaluate the death risk of IPF patients

2.8 纖維化小鼠血清和BALF中CCL2的相關(guān)性分析

與C 組小鼠相比，BLM 組小鼠血清和BALF 中CCL2 水平均明顯升高（P<0.05）。血清中CCL2 和Ashcroft 評分間無相關(guān)性，但BALF 中CCL2 水平與Ashcroft評分間有相關(guān)性（r=0.559，P<0.05，圖5）。

圖5 纖維化小鼠血清和BALF中CCL2水平及與Ashcroft評分的相關(guān)性Figure 5 CCL2 levels in serum and BALF of fibrosis mice and their correlation with Ashcroft score

3 討論

IPF 是一種進行性纖維化性間質(zhì)性肺病，特征是成纖維細胞呈灶性增生、新老病灶并存，肺泡間隔因纖維組織增生和膠原蛋白沉積而明顯增厚，主要影響肺組織的彌散功能。病因和發(fā)病機制不明，中位生存期僅為2～3年。吡非尼酮和尼達尼布雖已獲批用于抗纖維化治療，但IPF 在診斷后的生存期似乎并未顯著提升。肺移植仍然是終末期肺纖維化患者延續(xù)生命的唯一措施。在臨床工作中，患者病情評估對于指導用藥和判斷預后具有重要意義，但IPF具有個體差異性，依靠肺功能、高分辨率計算機體層成像（high resolution computed tomography，HRCT）等檢查雖可協(xié)助判斷，但考慮到這些檢查的費用、患者的配合和依從性，以及反復接受影像檢查的輻射量等因素，迫切需要簡單可靠的方法以便臨床應用。

近年來一些生物標志物對IPF預后的判斷價值受到了廣大學者的關(guān)注。其中，研究最早也最深入和廣泛的為趨化因子家族中的CCL2。眾多研究顯示，與對照組相比，IPF 組血清和BALF 中CCL2 水平均顯著升高，且BALF 中CCL2 水平高于其在血清中的水平［12-13］；進一步分析發(fā)現(xiàn)與穩(wěn)定期相比，急性加重期患者BALF 中CCL2 水平、病死率均更高。CCL2 與肺功能的相關(guān)性，目前文獻報道的結(jié)果并不一致，有研究顯示血清CCL2 水平與FVC%、DLCO%呈負相關(guān)；有研究則顯示二者之間并無相關(guān)性［14-16］。本研究同樣檢測了CC 組和IPF 組血清及BALF中CCL2的濃度，結(jié)果顯示IPF患者無論血清還是BALF 中的CCL2 濃度均顯著升高（P<0.05）。同時，本研究還探討了兩組BALF中主要細胞占比、肺功能和動脈血氣分析的差異，結(jié)果顯示與CC 組相比，IPF 組BALF 中淋巴細胞占比降低、中性粒細胞占比升高，但巨噬細胞占比組間并無差別，氧合指數(shù)和FVC%均降低也都符合IPF 的疾病特征。相關(guān)性分析方面，本研究結(jié)果顯示血清CCL2與FVC%、DLCO%相關(guān)性不強；然而BALF 中CCL2與FVC%、DLCO%均呈負相關(guān)，且當CCL2水平升高時，患者病死率也增加。該結(jié)果與文獻報道相符，提示BALF中的高水平CCL2更能預測IPF患者的病情及死亡風險。同時本研究通過ROC曲線進一步發(fā)現(xiàn)，預測IPF患者死亡的BALF中CCL2最佳切割值為363.74 pg/mL，此時的AUC為0.916（95%CI為0.808～1.000），靈敏度和特異度分別為71.4%和100.0%。

此外，也有學者在思考如何通過簡單無創(chuàng)的方法來判斷IPF 患者的病情，因此建立了一個可應用于IPF 患者的風險評估模型，即GAP 評分與分期系統(tǒng)，該模型主要納入的指標是IPF患者的性別、年齡及肺功能等，自問世以來，已經(jīng)得到了業(yè)界的一致認可及廣泛應用。研究人員依據(jù)GAP評分將IPF患者分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期，發(fā)現(xiàn)Ⅲ期患者生存率顯著低于Ⅱ期和Ⅰ期患者，同時Ⅱ期患者生存率低于Ⅰ期患者；且相關(guān)分析顯示GAPⅢ期與IPF 患者的生存率高度正相關(guān)［17］。其他研究在IPF患者生存分析中也得出類似結(jié)果［18?19］。因此，本研究依據(jù)GAP 評分將入組的IPF 患者進行了分期。結(jié)果顯示，IPF 組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期患者血清中CCL2 水平無明顯差異；但在BALF 中，除了Ⅰ期與CC 組之間CCL2 水平差異不明顯外，IPF組Ⅱ期與CC組、Ⅲ期與CC組、IPF組各期之間CCL2水平均有明顯不同（P<0.05），這是以往文獻未曾報道的結(jié)果。在肺功能方面，Ⅱ期和Ⅲ期FVC%、DLCO%均較Ⅰ期顯著下降（P<0.05），Ⅱ期和Ⅲ期之間FVC%、DLCO%差異不大。隨后的生存分析也顯示Ⅱ、Ⅲ期患者生存時間明顯短于Ⅰ期患者（P<0.01），該結(jié)果與文獻報道相符。但Ⅱ期和Ⅲ期患者生存時間差異無統(tǒng)計學意義，該結(jié)果與文獻報道不符，考慮可能與本研究IPF 組Ⅲ期樣本量較少有關(guān)。

同時，本研究也探討了GAP 評分和CCL2 之間的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BALF中CCL2水平與GAP評分呈正相關(guān)（r=0.847，P<0.01），但血清中CCL2 水平與GAP評分無相關(guān)性。

本研究同樣在動物模型中觀察到BLM 組小鼠血清和BALF 中CCL2 水平均高于C 組（P<0.05），并且小鼠BALF中CCL2水平與Ashcroft評分也呈正相關(guān)（r=0.559，P<0.05），Ashcroft 評分從病理學角度評估了小鼠肺纖維化的嚴重度，GAP評分從生理學角度評估了IPF 患者病情的嚴重度。因此，該動物實驗結(jié)果佐證了IPF 患者的結(jié)果，即BALF 中CCL2 水平與病情嚴重度具有相關(guān)性。至于小鼠BALF 中CCL2濃度低于血清中的濃度，主要考慮可能與3次灌洗、3 mL灌洗液的稀釋作用有關(guān)。

綜上，本研究在以往研究的基礎上，除驗證了BALF中CCL2和GAP評分系統(tǒng)在臨床實踐中對IPF患者預后的判斷效能外，還首次探討了GAP分期中各期患者BALF 中CCL2水平的差異、BALF 中CCL2水平和GAP 評分的相關(guān)性、預測IPF 患者死亡的BALF 中CCL2 的最佳切割值，結(jié)果顯示IPF 組各期BALF 中CCL2水平差異明顯；BALF 中CCL2水平與GAP評分呈正相關(guān)；當BALF中CCL2≥363.74 pg/mL時，患者病死率增加。同時，動物實驗也進一步驗證了上述IPF患者的研究結(jié)果。未來，可擴大樣本量、增加檢測的生物標志種類，以便明確對IPF預后的早期判斷，為早期藥物介入提供更多的依據(jù)和線索。