馮麗婷，張劍峰，遲勝起

(青島農(nóng)業(yè)大學 植物醫(yī)學學院，山東 青島 266109)

甘薯，別名地瓜、紅薯等，一種旋花科的纏繞草質(zhì)藤本植物，主要以塊根及莖蔓繁殖，易遭受甘薯病毒的侵害[1]。全世界已報道的甘薯病毒有30余種，其中我國報道的甘薯病毒約有20多種[2]，且復合侵染嚴重，如甘薯病毒病害(Sweet potato virus diseases，SPVD)是由甘薯羽狀斑駁病毒(Sweetpotatofeatherymottlevirus，SPFMV)和甘薯褪綠矮化病毒(Sweetpotatochloroticstuntvirus，SPCSV)協(xié)生共同侵染甘薯引起的病毒病害，可引起葉片扭曲、畸形、葉片褪綠以及植株嚴重矮化等癥狀，對甘薯產(chǎn)量影響極大，一般可使甘薯減產(chǎn)50%～90%，甚至絕收，是甘薯生產(chǎn)上的毀滅性病害[3-6]。甘薯屬于無性繁殖作物，病毒可通過塊根及秧苗等進行傳播、積累，目前對于病毒病的防治并沒有有效的防治藥劑，生產(chǎn)上主要依靠莖尖脫毒，通過培育無毒薯苗，減少病毒病的發(fā)生，提高甘薯的產(chǎn)量[7]。脫毒苗的繁育，離不開便捷快速的病毒檢測方法，建立高效、快捷的甘薯病毒檢測方法刻不容緩[8]。

本試驗以甘薯生產(chǎn)上發(fā)生嚴重的4種甘薯RNA病毒(SPFMV、SPCSV、SweetpotatovirusG(SPVG)、SweetpotatovirusC(SPVC))為研究對象，開展了上述4種甘薯RNA病毒的多重RT-PCR的檢測方法研究，建立了4種甘薯RNA病毒的多重RT-PCR檢測技術(shù)，旨在為甘薯脫毒苗培育和甘薯病毒的田間檢測奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

帶有SPFMV、SPCSV、SPVG、SPVC的甘薯組培苗和無毒的甘薯組培苗均為青島農(nóng)業(yè)大學植物醫(yī)學院植物病毒學實驗室保存。

1.2 主要試劑與儀器

試劑：RNA提取試劑購自艾科瑞生物科技有限公司；cDNA合成試劑盒購自山東思科捷生物技術(shù)有限公司；PCR相關(guān)試劑購自寶生物工程(大連)有限公司。

儀器：全自動樣品快速研磨儀JXFSTPRP-24(上海凈信科技)、PCR擴增儀(BioRad T-100)、凝膠成像系統(tǒng)(UVP)。

1.3 特異性引物設(shè)計

根據(jù)GenBank中收錄的SPFMV、SPCSV、SPVG、SPVC 4種甘薯病毒外殼蛋白(Coat protein ，CP)序列，應用DNAMAN 8.0進行序列比對分析，應用Premier 5.0 軟件分別設(shè)計了上述4種甘薯病毒的特異性引物(表1)，相關(guān)引物由上海生工生物股份有限公司合成。

表1 所用甘薯病毒的特異性引物Tab.1 Specific primers of sweet potato virus used

1.4 樣品總RNA的提取

利用TRIzol法對甘薯病毒樣品進行植物總RNA提取。

1.5 單對引物的RT-PCR檢測

參照cDNA合成試劑盒說明書合成cDNA，以cDNA為模板，分別利用SPFMV、SPCSV、SPVG、SPVC的特異性引物，PCR擴增反應體系25 μL:10×PCR Buffer 2.5 μL，rTaq 0.25 μL，dNTPs 2.5 μL，F(xiàn)/R引物各0.5 μL，模板2.5 μL，ddH2O 16.25 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min；12 ℃保存。PCR反應結(jié)束后，1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)檢測并拍照。

1.6 多重RT-PCR檢測體系優(yōu)化與建立

在同一個反應體系中加入4對上述甘薯RNA病毒引物同時進行RT-PCR，對多重反應體系中的退火溫度(54，55，56，57，58，59 ℃)、模板量(1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 μL)、dNTPs量(2.0，2.5，3.0 μL)、引物濃度(2，5，10 μmol/L)、引物量(1∶1∶1∶1∶1、1∶1∶1∶2∶2、2∶2∶2∶1∶1)、循環(huán)次數(shù)(30×、35×、40×)、延伸時間(20，30，60 s)等因素進行優(yōu)化試驗。

1.7 靈敏度檢測

將cDNA按照10倍濃度梯度稀釋(100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6)，以稀釋后的cDNA分別為模板進行單對引物RT-PCR擴增和多重RT-PCR擴增，電泳、紫外檢測并進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單對引物的RT-PCR檢測

分別對4種病毒的特異性引物進行單對引物的RT-PCR驗證，由圖1可見，目的條帶與設(shè)計片段大小相符，通過進一步的測序分析，均為所檢測的目的片段，說明4個引物對的特異性較好。

M.DL2000 DNA Marker；1.SPFMV； 2.SPCSV；3.SPVG；4.SPVC； 5.陰性對照。 M.DL2000 DNA Marker；1.SPFMV；2.SPCSV；3.SPVG； 4.SPVC； 5.Negative control.

2.2 多重RT-PCR反應體系的優(yōu)化

以混合cDNA樣品為模板，分別對4種引物組合兩兩組合(圖2)，三三組合(圖3)和四重組合(圖4)，由圖2—4可見，任何2種引物對所擴增的目的條帶都與所設(shè)計片段大小相符，且任意非配對引物均不能產(chǎn)生額外雜帶，說明任意2種引物對之間都不能產(chǎn)生非特異性片段。

M.DL2000 DNA Marker；1.SPFMV/SPCSV；2.SPFMV/SPVG； 3.SPFMV/SPVC；4.SPCSV/SPVG；5.SPVG/SPVC；6.SPCSV/SPVC。

M.DL2000 DNA Marker；1—2.SPFMV/SPCSV/ SPVG/SPVC。圖5同。 M.DL2000 DNA Marker； 1—2.SPFMV/SPCSV/ SPVG/SPVC.The same as Fig.5.

通過對這4對引物的dNTPs量(2.0，2.5，3.0 μL)、退火溫度(54～59 ℃)、模板量(1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 μL)、循環(huán)次數(shù)(30×、35×、40×)、延伸時間(20，30，60 s)等試驗，確定了優(yōu)化組合(圖5)，其最佳的反應組合及反應條件見表2—4。

將加好的樣品管42 ℃孵育5 min后，立即加入10 μL Mix進行30 min 50 ℃孵育，85 ℃失活5 min，12 ℃保存合成20 μL cDNA。

圖5 優(yōu)化的四重RT-PCRFig.5 Reaction system of multiplex RT-PCR optimized

表2 cDNA合成的最佳反應體系(10 μL)Tab.2 The best reaction system for cDNA synthesis (10 μL)

表3 最佳的PCR反應組合Tab.3 The best combination of PCR reactions

表4 四重PCR的最佳反應條件Tab.4 Optimal reaction conditions for multiplex PCR

2.3 靈敏度檢測

將cDNA模板按照10倍梯度依次稀釋，再分別作為測試模板，在相同反應體系及反應條件下進行多重RT-PCR，結(jié)果表明，多重RT-PCR的cDNA稀釋10倍后仍能檢測到(圖6)。

M.DL2000 DNA Marker； 1—7.100～10-6.

2.4 特異性檢測

應用分別含有馬鈴薯Y病毒(PotatovirusY，PVY)的樣品1、含有甘薯桿狀病毒(SweetpotatobadnavirusB，SPBV-B)的樣品2和甘薯RNA病毒與甘薯DNA病毒復合侵染的樣品3(含有RNA病毒：SPFMV、SPCSV、SPVG、SPVC、甘薯潛隱病毒(Sweetpotatolatentvirus，SPLV)、DNA病毒(SPBV-B)，對該多重RT-PCR體系進行特異性檢測，由圖7，8可見，該多重RT-PCR系統(tǒng)沒有擴增出其他非特異性條帶，說明其具有較強的特異性。

M.DL2000 DNA Marker；1.樣品1陽性對照；2.樣品1的多重 RT-PCR檢測體系；3. 樣品2陽性對照；4.樣品2的多重檢測體系。 M.DL2000 DNA Marker；1.Positive control of sample 1； 2.Multiple detection of sample 1；3.Positive control of sample 2；4.Multiple detection of sample 2.

M.DL2000 DNA Marker；1. SPFMV-F/SPFMV-R；2.SPCSV-F/SPCSV-R；3.SPVG-F/SPVG-R；4.SPVC-F/SPVC-R；5.SPBV-F/SPBV-R；6.SPLV-F/SPLV-R；7.多重RT-PCR檢測體系。

2.5 挑戰(zhàn)測試

應用本實驗室前期檢測含有混合病毒的甘薯樣品對該多重RT-PCR系統(tǒng)進行挑戰(zhàn)測試，其中樣品1帶有甘薯羽狀斑駁病毒(SPFMV)、甘薯G病毒(SPVG)；樣品2為甘薯羽狀斑駁病毒(SPFMV)、甘薯C病毒(SPVC)復合侵染；樣品3為甘薯羽狀斑駁病毒(SPFMV)、甘薯褪綠矮化病毒(SPCSV)、甘薯G病毒(SPVG)、甘薯C病毒(SPVC)復合侵染；樣品4同時被甘薯羽狀斑駁病毒(SPFMV)、甘薯G病毒(SPVG)、甘薯C病毒(SPVC)侵染。由圖9，10可見，該多重RT-PCR系統(tǒng)與單對引物檢測的結(jié)果一致，說明該系統(tǒng)用于這4種甘薯RNA病毒的檢測是可行的。本研究建立了可用于甘薯RNA病毒(SPFMV、SPCSV、SPVG、SPVC)的多重RT-PCR檢測體系。

M.DL2000 DNA Marker；1—4.分別為樣品1的SPFMV、SPCSV、SPVG、SPVC單對引物檢測；5.樣品1的多重RT-PCR檢測；6—9.分別為樣品2的SPFMV、SPCSV、SPVG、SPVC單對引物檢測； 10.樣品2的多重RT-PCR檢測。

M.DL2000 DNA Marker；1—4.分別為樣品3的SPFMV、SPCSV、SPVG、SPVC單對引物檢測；5.樣品3的多重RT-PCR檢測 ； 6—9.分別為樣品4的SPFMV、SPVG、SPCSV、SPVC單對引物檢測； 10.樣品4的多重RT-PCR檢測。

3 結(jié)論與討論

甘薯是我國重要的糧食、飼料和工業(yè)原料作物，具有重要的糧食、經(jīng)濟地位。近年來，各種甘薯病毒病頻繁暴發(fā)，使甘薯的產(chǎn)量和品質(zhì)下降，目前，甘薯病毒病的防治只有依靠脫毒苗的單一方法[8]，建立靈敏高效的病毒檢測技術(shù)在脫毒甘薯苗培育和檢測中起著至關(guān)重要的作用[9]。常用的病毒檢測方法有目測法、指示植物法、電鏡觀察法、血清學檢測法及分子生物學等方法，其中以PCR/RT-PCR的分子生物學方法進行病毒檢測已成為目前甘薯病毒檢測最常用和最主要的方法[10-14]。傳統(tǒng)的單一RT-PCR方法每次只能檢測一種病毒或一類病毒，對于復合侵染的甘薯病毒病，需要進行多次檢測，多重RT-PCR檢測技術(shù)可對多種病毒同時進行檢測，具有同樣具有特異性強、靈敏性高的特點，且能在較短時間內(nèi)同時完成多種病毒的檢測[15-17]，大大提高了工作效率，其中引物設(shè)計是多重RT-PCR檢測技術(shù)中最重要的一環(huán)[18]，引物既要具有特異性，又要避免引物之間相互影響[19]，研究認為在多重RT-PCR反應體系中，增加引物對的濃度可以得到理想的擴增效果[13]，提高長片段引物的濃度、增加延伸時間也有利于多重RT-PCR擴增[20-24]。

基于此，本研究針對甘薯生產(chǎn)上為害嚴重的甘薯RNA病毒：引起甘薯病毒病(SPVD)的2種病毒甘薯羽狀斑駁病毒(SPFMV)和甘薯褪綠矮化病毒(SPCSV)，以及經(jīng)常能夠復合侵染的甘薯病毒G(SPVG)和甘薯病毒C(SPVC)，成功建立了可以同時檢測4種甘薯病毒的多重RT-PCR檢測技術(shù)，并對影響多重PCR體系的因素進行了優(yōu)化，獲得了快速、準確、高效的多重RT-PCR檢測技術(shù)，為脫毒甘薯種苗及田間甘薯RNA病毒的快速檢測奠定了基礎(chǔ)。