李冬怡,鄧竹英,梁大成
(1.湖北省主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心,湖北 荊州 434025;2.長(zhǎng)江大學(xué) 濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心, 湖北省澇漬災(zāi)害與濕地農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 荊州 434025)
嫁接是指把一株植物的枝或芽接到另一株植物的莖或根上,二者切口緊密連接共同生長(zhǎng),使接在一起的2個(gè)部分長(zhǎng)成一個(gè)完整植株的技術(shù)[1],嫁接的方法有多種,包括側(cè)接、舌接、劈接、剪接等[2]。嫁接作為一項(xiàng)技術(shù)手段廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,用來(lái)提高作物產(chǎn)量、改變植株分支結(jié)構(gòu)、增強(qiáng)作物對(duì)生物和非生物脅迫的耐受性等[3-4],同時(shí)也是研究參與基本生物過(guò)程的可移動(dòng)蛋白、mRNA、小RNA的重要手段[5-8]。嫁接除了作為一項(xiàng)技術(shù)廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和基礎(chǔ)研究外,嫁接體接口愈合機(jī)制的研究也十分重要。
嫁接體愈合機(jī)制的研究主要涉及創(chuàng)傷應(yīng)急響應(yīng)、愈傷組織形成、維管束重連、砧穗間的通訊、遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移等方面[9-11]。在嫁接體接口細(xì)胞互作及遺傳物質(zhì)傳遞研究中,許多研究者認(rèn)為,砧穗間僅蛋白質(zhì)和RNA分子移動(dòng),并無(wú)遺傳物質(zhì)交流,Stegemann等[12]、Fuentes等[13]、Gurdon等[14]和Bock[15]的研究證明,整個(gè)基因組可以在接穗和砧木間移動(dòng)。Stegemann等[16]將在葉綠體中表達(dá)壯觀霉素抗性基因和綠色熒光蛋白(GFP)基因的轉(zhuǎn)基因普通煙草接穗嫁接到在細(xì)胞核中表達(dá)卡那霉素抗性基因和黃色熒光蛋白(YFP)基因的轉(zhuǎn)基因粉藍(lán)煙草砧木上,接口愈合后,截取嫁接體接口部位移至含有卡那霉素和壯觀霉素的培養(yǎng)基中,結(jié)果發(fā)現(xiàn),被截取的接口部位能夠在培養(yǎng)基中長(zhǎng)出愈傷組織,并生長(zhǎng)出新植株,這表明砧穗間已發(fā)生遺傳信息的轉(zhuǎn)移。它們利用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察到嫁接體中GFP和YFP熒光信號(hào)在同一細(xì)胞中表達(dá),表明葉綠體基因組可以通過(guò)嫁接從一個(gè)物種傳遞到另一個(gè)物種。Lu等[17]的研究也證實(shí)了這一結(jié)論。前人的研究表明,植物細(xì)胞器的基因組參與嫁接體植物間水平基因組轉(zhuǎn)移,但并不清楚基因組是如何從一個(gè)細(xì)胞移至另一個(gè)細(xì)胞,以及它們是作為游離DNA分子還是包裹在細(xì)胞器中移動(dòng)。Hertle等[18]為探究嫁接體接口處葉綠體在細(xì)胞間的移動(dòng)機(jī)制,將Pt-spec∶dsRed接穗嫁接到Nuc-kan∶YFP砧木上,利用共聚焦顯微鏡觀察不同時(shí)期嫁接體接口處愈傷組織切片,發(fā)現(xiàn)砧穗間愈傷組織開(kāi)始黏附時(shí)就已出現(xiàn)葉綠體的移動(dòng),葉綠體在砧穗間的移動(dòng)可能發(fā)生在維管束重連之前。且利用透射電鏡觀察到,嫁接體接口愈傷組織形成初期,細(xì)胞壁會(huì)形成大孔,細(xì)胞質(zhì)中的物質(zhì)通過(guò)這些孔轉(zhuǎn)運(yùn)到相鄰細(xì)胞,證實(shí)細(xì)胞器可以在細(xì)胞間移動(dòng),表明遺傳物質(zhì)可能是被包裹在細(xì)胞器中移動(dòng)的。
目前,綠色熒光蛋白(GFP)、黃熒光蛋白(YFP)和紅熒光蛋白(RFP)作為熒光標(biāo)簽多被用在嫁接體愈合機(jī)制的研究中[16-18],本研究中用到自組裝拆分的超折疊綠色熒光蛋白(sfGFP)系統(tǒng)。sfGFP可拆分為2個(gè)片段,分別為sfGFP1-10和GFP11。這2個(gè)單獨(dú)的片段是非熒光的,因?yàn)镚FP11中保守的E222殘基對(duì)于發(fā)色團(tuán)的成熟至關(guān)重要,一旦它們鄰近存在,2個(gè)片段就會(huì)重組成β桶狀結(jié)構(gòu)并發(fā)出熒光[19]。前人利用自組裝拆分的sfGFP系統(tǒng)進(jìn)行亞細(xì)胞定位的研究有很多,Van Engelenburg等[20]利用自組裝拆分的sfGFP系統(tǒng)對(duì)沙門(mén)氏菌直接分泌的三型效應(yīng)物(T3E)進(jìn)行了監(jiān)測(cè)。Park等[21]基于改進(jìn)的sfGFP1-10優(yōu)化了自組裝拆分的sfGFP系統(tǒng),提高sfGFP1-10片段的溶解度,增強(qiáng)GFP熒光強(qiáng)度,以監(jiān)測(cè)丁香假單胞桿菌三型效應(yīng)因子(T3Es)在植物細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。sfGFP系統(tǒng)還被用來(lái)研究哺乳動(dòng)物蛋白的亞細(xì)胞定位[22]以及可視化通過(guò)T4SS傳遞的農(nóng)桿菌VirE2進(jìn)入植物細(xì)胞的過(guò)程[23]。目前,sfGFP系統(tǒng)還未被用在嫁接體愈合機(jī)制研究中。本研究構(gòu)建了在細(xì)胞質(zhì)中單獨(dú)表達(dá)sfGFP1-10和mCherry-11的轉(zhuǎn)基因擬南芥和在細(xì)胞質(zhì)中單獨(dú)表達(dá)sfGFP1-10和mCherry-11的轉(zhuǎn)基因煙草植株,嫁接后利用激光共聚焦顯微鏡觀察接口處GFP熒光信號(hào),檢測(cè)嫁接體接口處細(xì)胞質(zhì)的融合發(fā)生事件。
野生型擬南芥(Col-0)和野生型本生煙草(Nicotianabenthamiana)均由長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院濕地作物微嫁接實(shí)驗(yàn)室提供,轉(zhuǎn)化所用根癌農(nóng)桿菌GV3101由本實(shí)驗(yàn)室制作保存。試驗(yàn)所需分別帶有基因sfGFP1-10和mCherry-11靶向細(xì)胞質(zhì)的質(zhì)粒CYTO-sfGFP1-10和CYTO-mCherry-11由美國(guó)加州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物生物學(xué)系和基因組中心Park Eunsook博士提供。
1.2.1 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化 將質(zhì)粒CYTO-sfGFP1-10和CYTO-mCherry-11分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101,轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌GV3101涂布于LB固體平板(含卡那霉素、利福平和慶大霉素)上,28 ℃培養(yǎng)2 d,挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素、利福平和慶大霉素)中,28 ℃ 250 r/min搖菌48 h后,取1 mL菌液擴(kuò)繁培養(yǎng)。6 000 r/min 10 min收集菌體,重懸于侵染液(5%的蔗糖、0.05%的 SilwetL-77),使OD600≈0.8。將野生型擬南芥Col-0的花苞分別浸泡在CYTO-sfGFP1-10和CYTO-mCherry-11的侵染液中1 min左右,暗處生長(zhǎng)2 d后正常培養(yǎng),10 d后進(jìn)行二次侵染,成熟后收取的擬南芥種子即為T(mén)0種子,在含潮霉素的MS培養(yǎng)基中篩選生長(zhǎng)健康的單株并種植于土壤中,再收獲得到T1種子。
1.2.2 煙草的遺傳轉(zhuǎn)化 按1.2.1方法得到CYTO-sfGFP1-10和CYTO-mCherry-11的擴(kuò)繁菌液。83 r/s 5 min收集菌體,重懸于侵染液(液體MS培養(yǎng)基、100 μm AS),使OD600≈0.5。將在無(wú)菌條件下生長(zhǎng)28 d左右的野生型本生煙(Nicotianabenthamiana)葉片剪成圓片形狀,浸泡于侵染液中2 min,用鑷子取出葉片放在無(wú)菌濾紙上吸干表面殘留液體,放到含無(wú)菌濾紙的固體MS培養(yǎng)基(含100 μm AS和1 mg/L 6-BA)上,28 ℃黑暗條件下共培養(yǎng)2 d,移至新的固體MS培養(yǎng)基(含1 mg/L 6-BA、200 mg/L 頭孢噻肟、250 mg/L 特美汀和50 mg/L 潮霉素)中,28 ℃ 黑暗條件下生長(zhǎng)7 d轉(zhuǎn)移到光照條件下生長(zhǎng),待愈傷長(zhǎng)出煙草后移至生根培養(yǎng)基(含1 mg/L NAA、200 mg/L 頭孢噻肟、250 mg/L 特美汀和50 mg/L 潮霉素)中。長(zhǎng)出根系的煙草移至土壤里種植,成熟后收獲得到T1種子。
1.2.3 嫁接體構(gòu)建 將在細(xì)胞質(zhì)中單獨(dú)表達(dá)sfGFP1-10和mCherry-11的轉(zhuǎn)基因擬南芥T1種子和在細(xì)胞質(zhì)中單獨(dú)表達(dá)sfGFP1-10和mCherry-11的轉(zhuǎn)基因煙草T1種子播種在MS培養(yǎng)基(含潮霉素)中,8 d后,選取生長(zhǎng)健壯的擬南芥(At-1-10、At-11)和煙草(Nb-1-10、Nb-11)幼苗作為嫁接材料。將在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)sfGFP1-10的轉(zhuǎn)基因擬南芥接穗嫁接到在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)mCherry-11的轉(zhuǎn)基因煙草砧木上構(gòu)建遠(yuǎn)緣嫁接體At-1-10/Nb-11,將在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)sfGFP1-10的轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗接穗嫁接到在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)mCherry-11的轉(zhuǎn)基因擬南芥砧木上構(gòu)建自體嫁接體At-1-10/At-11,將在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)sfGFP1-10的轉(zhuǎn)基因煙草接穗嫁接到在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)mCherry-11的轉(zhuǎn)基因煙草砧木上構(gòu)建自體嫁接體Nb-1-10/Nb-11。同時(shí)構(gòu)建3組對(duì)照嫁接體:At-11/Nb-11、At-11/At-11、Nb-11/Nb-11。
1.2.4 共聚焦激光顯微鏡觀察 在嫁接后第4天,制作嫁接體徒手切片以及在細(xì)胞質(zhì)中單獨(dú)表達(dá)sfGFP1-10和mCherry-11的轉(zhuǎn)基因擬南芥未嫁接單株和在細(xì)胞質(zhì)中單獨(dú)表達(dá)sfGFP1-10和mCherry-11的轉(zhuǎn)基因煙草未嫁接單株的徒手切片,利用徠卡TCS SP8共聚焦顯微鏡觀察切片的GFP熒光信號(hào)(GFP熒光信號(hào)的觀察選擇488 nm激光波長(zhǎng)進(jìn)行激發(fā))。
選取MS固體培養(yǎng)基(含潮霉素)中生長(zhǎng)健壯的T1轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗(圖1-A、B)和T1轉(zhuǎn)基因煙草幼苗(圖1-C、D)作為嫁接材料,成功構(gòu)建嫁接體At-1-10/Nb-11、At-1-10/At-11 和Nb-1-10/Nb-11(圖1-E—G),在嫁接后第4天,制作嫁接體及T1轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草未嫁接幼苗的徒手切片,利用激光共聚焦顯微鏡觀察GFP熒光信號(hào)。
用共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),在細(xì)胞質(zhì)中單獨(dú)表達(dá)sfGFP1-10和mCherry-11的未嫁接擬南芥幼苗At-1-10和At-11以及嫁接體At-11/At-11中均無(wú)GFP信號(hào)的表達(dá)(圖2-A—C)。在擬南芥自體嫁接體At-1-10/At-11接口處觀察到GFP信號(hào),出現(xiàn)的GFP信號(hào)多聚集在接口處,少量移動(dòng)到接穗和砧木部位(圖2-D)。結(jié)果表明,在嫁接后第4天,擬南芥自體嫁接體砧穗間已經(jīng)發(fā)生了細(xì)胞質(zhì)的融合。嫁接體接口愈合過(guò)程中,擬南芥接穗中靶向細(xì)胞質(zhì)的sfGFP1-10和砧木中靶向細(xì)胞質(zhì)的mCherry-11重組成sfGFP發(fā)出熒光。因此,自組裝拆分的sfGFP系統(tǒng)可用于監(jiān)測(cè)擬南芥自體嫁接體接口處細(xì)胞質(zhì)的融合。
圖1 轉(zhuǎn)基因擬南芥與煙草及構(gòu)建的嫁接體Fig.1 Transgenic Arabidopsis thaliana and Nicotiana benthamiana plants and constructed grafts
圖2 轉(zhuǎn)基因擬南芥單株及擬南芥/擬南芥嫁接體GFP信號(hào)觀察Fig.2 GFP signal observation of transgenic Arabidopsis thaliana plants and At/At grafts
為了探究煙草自體嫁接體接口細(xì)胞質(zhì)的融合情況,用共聚焦顯微鏡觀察了在細(xì)胞質(zhì)中單獨(dú)表達(dá)sfGFP1-10和mCherry-11的未嫁接煙草幼苗Nb-1-10和Nb-11以及煙草自體嫁接體Nb-11/Nb-11和Nb-1-10/Nb-11。結(jié)果發(fā)現(xiàn),未嫁接煙草幼苗Nb-1-10和Nb-11以及煙草自嫁接體Nb-11/Nb-11中無(wú)GFP熒光信號(hào)(圖3-A—C),而在煙草自體嫁接體Nb-1-10/Nb-11的接口處觀察到GFP信號(hào),且有部分熒光信號(hào)轉(zhuǎn)移到接穗和砧木中,聚集在維管部位(圖3-D)。
利用sfGFP系統(tǒng)識(shí)別擬南芥自體嫁接體和煙草自體嫁接體接口處細(xì)胞質(zhì)融合的方法是可行的,為進(jìn)一步監(jiān)測(cè)遠(yuǎn)緣嫁接體細(xì)胞質(zhì)融合情況,將在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)sfGFP1-10的擬南芥接穗嫁接到在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)mCherry-11的煙草砧木上構(gòu)建遠(yuǎn)緣嫁接體At-1-10/Nb-11。在嫁接后第4天,用共聚焦激光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),對(duì)照嫁接體At-11/Nb-11中無(wú)GFP信號(hào)(圖4-A),擬南芥與煙草的遠(yuǎn)緣嫁接體At-1-10/Nb-11接口處檢測(cè)到GFP信號(hào),拆分的sfGFP片段在接口處重組后移動(dòng)到接穗部位,大量聚集在接穗維管束周?chē)?圖4-B)。
圖3 轉(zhuǎn)基因煙草單株及煙草/煙草嫁接體GFP信號(hào)觀察Fig.3 GFP signal observation of transgenic Nicotiana benthamiana plants and Nb/Nb grafts
圖4 擬南芥/煙草嫁接體GFP信號(hào)觀察Fig.4 GFP signal observation of At/Nb grafts
為了比較自體嫁接體與遠(yuǎn)緣嫁接體在細(xì)胞質(zhì)融合上的差異,用LAS AF Lite統(tǒng)計(jì)嫁接體接口處及附近部位的GFP熒光表達(dá)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在嫁接后第4天,擬南芥和煙草的遠(yuǎn)緣嫁接體At-1-10/Nb-11的GFP熒光強(qiáng)度顯著強(qiáng)于自體嫁接體At-1-10/At-11和Nb-1-10/Nb-11(P<0.05),且擬南芥自體嫁接體的熒光強(qiáng)度顯著強(qiáng)于煙草自體嫁接體(P<0.05)(圖5)。
不同小寫(xiě)字母表示數(shù)據(jù)之間存在顯著差異(P<0.05)。 Different lowercase letters indicated significant differences between the data(P<0.05).
Stegemann等[16]、Lu等[17]和Hertle等[18]的研究表明,嫁接可以使葉綠體基因組跨越物種屏障,且葉綠體能夠在砧穗間移動(dòng),它們?cè)谠囼?yàn)中將GFP、YFP和RFP作為標(biāo)簽對(duì)嫁接體接口細(xì)胞器的移動(dòng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)追蹤。本研究利用拆分的sfGFP系統(tǒng)可視化自體嫁接與遠(yuǎn)緣嫁接細(xì)胞質(zhì)融合的方法更直觀簡(jiǎn)便,省去雙抗性培養(yǎng)基篩選愈傷組織的過(guò)程,構(gòu)建了在細(xì)胞質(zhì)中單獨(dú)表達(dá)sfGFP1-10和sfGFP11的轉(zhuǎn)基因擬南芥和在細(xì)胞質(zhì)中單獨(dú)表達(dá)sfGFP1-10和sfGFP11的轉(zhuǎn)基因煙草植株,嫁接后利用共聚焦顯微鏡觀察嫁接體接口處是否存在GFP熒光信號(hào),以此判斷接穗與砧木接口處細(xì)胞間細(xì)胞質(zhì)是否發(fā)生融合。結(jié)果表明,在嫁接后第4天,自體嫁接與遠(yuǎn)緣嫁接體接口處細(xì)胞質(zhì)已經(jīng)發(fā)生融合,遠(yuǎn)緣嫁接體與自體嫁接體接口處的GFP信號(hào)都向嫁接體接穗和砧木部位發(fā)生不同程度的轉(zhuǎn)移,大量聚集在維管束附近,這與Hertle等[18]和Melnyk等[24]的結(jié)論一致,推測(cè)細(xì)胞質(zhì)的融合發(fā)生在維管束重連(3 DAG)之前,可能在嫁接后短時(shí)間內(nèi)接口處就產(chǎn)生了細(xì)胞質(zhì)融合;同時(shí)發(fā)現(xiàn),遠(yuǎn)緣嫁接體發(fā)生的細(xì)胞質(zhì)融合程度遠(yuǎn)強(qiáng)于自體嫁接,這可能與物種間不親和性有關(guān),遠(yuǎn)緣物種在嫁接愈合過(guò)程中接口處細(xì)胞間的識(shí)別以及維管束的變化是劇烈的[25],為響應(yīng)這一系列劇變,可能導(dǎo)致遠(yuǎn)緣嫁接體砧穗間細(xì)胞器的融合及移動(dòng)發(fā)生時(shí)期更早,且強(qiáng)度強(qiáng)于自體嫁接體,具體原因尚需進(jìn)一步研究。本研究?jī)H觀察了在嫁接后第4天嫁接體接口處細(xì)胞質(zhì)融合情況,尚不清楚接口處細(xì)胞質(zhì)是從何時(shí)開(kāi)始融合轉(zhuǎn)移的。為進(jìn)一步探究嫁接體砧穗間細(xì)胞器的融合互作機(jī)制,在本研究的基礎(chǔ)上,可以構(gòu)建在細(xì)胞核、葉綠體和線(xiàn)粒體等細(xì)胞器單獨(dú)表達(dá)sfGFP1-10和mCherry-11的轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草植株,分別在嫁接后第3天、嫁接后第2天、嫁接后1天甚至嫁接后更短時(shí)間內(nèi)觀察接口處的熒光表達(dá)情況。
目前,砧穗間細(xì)胞互作相關(guān)研究還處于初級(jí)階段,尚未弄清接口處細(xì)胞間細(xì)胞器是如何融合移動(dòng)的。本研究將sfGFP系統(tǒng)應(yīng)用于研究砧穗間細(xì)胞互作的方法是新穎的,利用這種自組裝拆分sfGFP系統(tǒng)的發(fā)光機(jī)制,可視化嫁接體接口處細(xì)胞質(zhì)的融合,證實(shí)了sfGFP系統(tǒng)在嫁接體愈合機(jī)制研究中的可行性,為研究嫁接體接口處細(xì)胞學(xué)事件提供了新思路和方法。