李冬怡，鄧竹英，梁大成

(1.湖北省主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 荊州 434025；2.長江大學(xué) 濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心， 湖北省澇漬災(zāi)害與濕地農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 荊州 434025)

嫁接是指把一株植物的枝或芽接到另一株植物的莖或根上，二者切口緊密連接共同生長，使接在一起的2個(gè)部分長成一個(gè)完整植株的技術(shù)[1]，嫁接的方法有多種，包括側(cè)接、舌接、劈接、剪接等[2]。嫁接作為一項(xiàng)技術(shù)手段廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，用來提高作物產(chǎn)量、改變植株分支結(jié)構(gòu)、增強(qiáng)作物對生物和非生物脅迫的耐受性等[3-4]，同時(shí)也是研究參與基本生物過程的可移動蛋白、mRNA、小RNA的重要手段[5-8]。嫁接除了作為一項(xiàng)技術(shù)廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和基礎(chǔ)研究外，嫁接體接口愈合機(jī)制的研究也十分重要。

嫁接體愈合機(jī)制的研究主要涉及創(chuàng)傷應(yīng)急響應(yīng)、愈傷組織形成、維管束重連、砧穗間的通訊、遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移等方面[9-11]。在嫁接體接口細(xì)胞互作及遺傳物質(zhì)傳遞研究中，許多研究者認(rèn)為，砧穗間僅蛋白質(zhì)和RNA分子移動，并無遺傳物質(zhì)交流，Stegemann等[12]、Fuentes等[13]、Gurdon等[14]和Bock[15]的研究證明，整個(gè)基因組可以在接穗和砧木間移動。Stegemann等[16]將在葉綠體中表達(dá)壯觀霉素抗性基因和綠色熒光蛋白(GFP)基因的轉(zhuǎn)基因普通煙草接穗嫁接到在細(xì)胞核中表達(dá)卡那霉素抗性基因和黃色熒光蛋白(YFP)基因的轉(zhuǎn)基因粉藍(lán)煙草砧木上，接口愈合后，截取嫁接體接口部位移至含有卡那霉素和壯觀霉素的培養(yǎng)基中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，被截取的接口部位能夠在培養(yǎng)基中長出愈傷組織，并生長出新植株，這表明砧穗間已發(fā)生遺傳信息的轉(zhuǎn)移。它們利用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察到嫁接體中GFP和YFP熒光信號在同一細(xì)胞中表達(dá)，表明葉綠體基因組可以通過嫁接從一個(gè)物種傳遞到另一個(gè)物種。Lu等[17]的研究也證實(shí)了這一結(jié)論。前人的研究表明，植物細(xì)胞器的基因組參與嫁接體植物間水平基因組轉(zhuǎn)移，但并不清楚基因組是如何從一個(gè)細(xì)胞移至另一個(gè)細(xì)胞，以及它們是作為游離DNA分子還是包裹在細(xì)胞器中移動。Hertle等[18]為探究嫁接體接口處葉綠體在細(xì)胞間的移動機(jī)制，將Pt-spec∶dsRed接穗嫁接到Nuc-kan∶YFP砧木上，利用共聚焦顯微鏡觀察不同時(shí)期嫁接體接口處愈傷組織切片，發(fā)現(xiàn)砧穗間愈傷組織開始黏附時(shí)就已出現(xiàn)葉綠體的移動，葉綠體在砧穗間的移動可能發(fā)生在維管束重連之前。且利用透射電鏡觀察到，嫁接體接口愈傷組織形成初期，細(xì)胞壁會形成大孔，細(xì)胞質(zhì)中的物質(zhì)通過這些孔轉(zhuǎn)運(yùn)到相鄰細(xì)胞，證實(shí)細(xì)胞器可以在細(xì)胞間移動，表明遺傳物質(zhì)可能是被包裹在細(xì)胞器中移動的。

目前，綠色熒光蛋白(GFP)、黃熒光蛋白(YFP)和紅熒光蛋白(RFP)作為熒光標(biāo)簽多被用在嫁接體愈合機(jī)制的研究中[16-18]，本研究中用到自組裝拆分的超折疊綠色熒光蛋白(sfGFP)系統(tǒng)。sfGFP可拆分為2個(gè)片段，分別為sfGFP1-10和GFP11。這2個(gè)單獨(dú)的片段是非熒光的，因?yàn)镚FP11中保守的E222殘基對于發(fā)色團(tuán)的成熟至關(guān)重要，一旦它們鄰近存在，2個(gè)片段就會重組成β桶狀結(jié)構(gòu)并發(fā)出熒光[19]。前人利用自組裝拆分的sfGFP系統(tǒng)進(jìn)行亞細(xì)胞定位的研究有很多，Van Engelenburg等[20]利用自組裝拆分的sfGFP系統(tǒng)對沙門氏菌直接分泌的三型效應(yīng)物(T3E)進(jìn)行了監(jiān)測。Park等[21]基于改進(jìn)的sfGFP1-10優(yōu)化了自組裝拆分的sfGFP系統(tǒng)，提高sfGFP1-10片段的溶解度，增強(qiáng)GFP熒光強(qiáng)度，以監(jiān)測丁香假單胞桿菌三型效應(yīng)因子(T3Es)在植物細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。sfGFP系統(tǒng)還被用來研究哺乳動物蛋白的亞細(xì)胞定位[22]以及可視化通過T4SS傳遞的農(nóng)桿菌VirE2進(jìn)入植物細(xì)胞的過程[23]。目前，sfGFP系統(tǒng)還未被用在嫁接體愈合機(jī)制研究中。本研究構(gòu)建了在細(xì)胞質(zhì)中單獨(dú)表達(dá)sfGFP1-10和mCherry-11的轉(zhuǎn)基因擬南芥和在細(xì)胞質(zhì)中單獨(dú)表達(dá)sfGFP1-10和mCherry-11的轉(zhuǎn)基因煙草植株，嫁接后利用激光共聚焦顯微鏡觀察接口處GFP熒光信號，檢測嫁接體接口處細(xì)胞質(zhì)的融合發(fā)生事件。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

野生型擬南芥(Col-0)和野生型本生煙草(Nicotianabenthamiana)均由長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院濕地作物微嫁接實(shí)驗(yàn)室提供，轉(zhuǎn)化所用根癌農(nóng)桿菌GV3101由本實(shí)驗(yàn)室制作保存。試驗(yàn)所需分別帶有基因sfGFP1-10和mCherry-11靶向細(xì)胞質(zhì)的質(zhì)粒CYTO-sfGFP1-10和CYTO-mCherry-11由美國加州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物生物學(xué)系和基因組中心Park Eunsook博士提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化 將質(zhì)粒CYTO-sfGFP1-10和CYTO-mCherry-11分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101，轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌GV3101涂布于LB固體平板(含卡那霉素、利福平和慶大霉素)上，28 ℃培養(yǎng)2 d，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素、利福平和慶大霉素)中，28 ℃ 250 r/min搖菌48 h后，取1 mL菌液擴(kuò)繁培養(yǎng)。6 000 r/min 10 min收集菌體，重懸于侵染液(5%的蔗糖、0.05%的 SilwetL-77)，使OD600≈0.8。將野生型擬南芥Col-0的花苞分別浸泡在CYTO-sfGFP1-10和CYTO-mCherry-11的侵染液中1 min左右，暗處生長2 d后正常培養(yǎng)，10 d后進(jìn)行二次侵染，成熟后收取的擬南芥種子即為T0種子，在含潮霉素的MS培養(yǎng)基中篩選生長健康的單株并種植于土壤中，再收獲得到T1種子。

1.2.2 煙草的遺傳轉(zhuǎn)化 按1.2.1方法得到CYTO-sfGFP1-10和CYTO-mCherry-11的擴(kuò)繁菌液。83 r/s 5 min收集菌體，重懸于侵染液(液體MS培養(yǎng)基、100 μm AS)，使OD600≈0.5。將在無菌條件下生長28 d左右的野生型本生煙(Nicotianabenthamiana)葉片剪成圓片形狀，浸泡于侵染液中2 min，用鑷子取出葉片放在無菌濾紙上吸干表面殘留液體，放到含無菌濾紙的固體MS培養(yǎng)基(含100 μm AS和1 mg/L 6-BA)上，28 ℃黑暗條件下共培養(yǎng)2 d，移至新的固體MS培養(yǎng)基(含1 mg/L 6-BA、200 mg/L 頭孢噻肟、250 mg/L 特美汀和50 mg/L 潮霉素)中，28 ℃ 黑暗條件下生長7 d轉(zhuǎn)移到光照條件下生長，待愈傷長出煙草后移至生根培養(yǎng)基(含1 mg/L NAA、200 mg/L 頭孢噻肟、250 mg/L 特美汀和50 mg/L 潮霉素)中。長出根系的煙草移至土壤里種植，成熟后收獲得到T1種子。

1.2.3 嫁接體構(gòu)建 將在細(xì)胞質(zhì)中單獨(dú)表達(dá)sfGFP1-10和mCherry-11的轉(zhuǎn)基因擬南芥T1種子和在細(xì)胞質(zhì)中單獨(dú)表達(dá)sfGFP1-10和mCherry-11的轉(zhuǎn)基因煙草T1種子播種在MS培養(yǎng)基(含潮霉素)中，8 d后，選取生長健壯的擬南芥(At-1-10、At-11)和煙草(Nb-1-10、Nb-11)幼苗作為嫁接材料。將在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)sfGFP1-10的轉(zhuǎn)基因擬南芥接穗嫁接到在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)mCherry-11的轉(zhuǎn)基因煙草砧木上構(gòu)建遠(yuǎn)緣嫁接體At-1-10/Nb-11，將在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)sfGFP1-10的轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗接穗嫁接到在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)mCherry-11的轉(zhuǎn)基因擬南芥砧木上構(gòu)建自體嫁接體At-1-10/At-11，將在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)sfGFP1-10的轉(zhuǎn)基因煙草接穗嫁接到在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)mCherry-11的轉(zhuǎn)基因煙草砧木上構(gòu)建自體嫁接體Nb-1-10/Nb-11。同時(shí)構(gòu)建3組對照嫁接體：At-11/Nb-11、At-11/At-11、Nb-11/Nb-11。

1.2.4 共聚焦激光顯微鏡觀察 在嫁接后第4天，制作嫁接體徒手切片以及在細(xì)胞質(zhì)中單獨(dú)表達(dá)sfGFP1-10和mCherry-11的轉(zhuǎn)基因擬南芥未嫁接單株和在細(xì)胞質(zhì)中單獨(dú)表達(dá)sfGFP1-10和mCherry-11的轉(zhuǎn)基因煙草未嫁接單株的徒手切片，利用徠卡TCS SP8共聚焦顯微鏡觀察切片的GFP熒光信號(GFP熒光信號的觀察選擇488 nm激光波長進(jìn)行激發(fā))。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥、煙草轉(zhuǎn)化后代篩選及嫁接體的構(gòu)建

選取MS固體培養(yǎng)基(含潮霉素)中生長健壯的T1轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗(圖1-A、B)和T1轉(zhuǎn)基因煙草幼苗(圖1-C、D)作為嫁接材料，成功構(gòu)建嫁接體At-1-10/Nb-11、At-1-10/At-11 和Nb-1-10/Nb-11(圖1-E—G)，在嫁接后第4天，制作嫁接體及T1轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草未嫁接幼苗的徒手切片，利用激光共聚焦顯微鏡觀察GFP熒光信號。

2.2 sfGFP系統(tǒng)可視化擬南芥/擬南芥嫁接體接口處細(xì)胞質(zhì)的融合

用共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞質(zhì)中單獨(dú)表達(dá)sfGFP1-10和mCherry-11的未嫁接擬南芥幼苗At-1-10和At-11以及嫁接體At-11/At-11中均無GFP信號的表達(dá)(圖2-A—C)。在擬南芥自體嫁接體At-1-10/At-11接口處觀察到GFP信號，出現(xiàn)的GFP信號多聚集在接口處，少量移動到接穗和砧木部位(圖2-D)。結(jié)果表明，在嫁接后第4天，擬南芥自體嫁接體砧穗間已經(jīng)發(fā)生了細(xì)胞質(zhì)的融合。嫁接體接口愈合過程中，擬南芥接穗中靶向細(xì)胞質(zhì)的sfGFP1-10和砧木中靶向細(xì)胞質(zhì)的mCherry-11重組成sfGFP發(fā)出熒光。因此，自組裝拆分的sfGFP系統(tǒng)可用于監(jiān)測擬南芥自體嫁接體接口處細(xì)胞質(zhì)的融合。

圖1 轉(zhuǎn)基因擬南芥與煙草及構(gòu)建的嫁接體Fig.1 Transgenic Arabidopsis thaliana and Nicotiana benthamiana plants and constructed grafts

圖2 轉(zhuǎn)基因擬南芥單株及擬南芥/擬南芥嫁接體GFP信號觀察Fig.2 GFP signal observation of transgenic Arabidopsis thaliana plants and At/At grafts

2.3 sfGFP系統(tǒng)可視化煙草/煙草嫁接體接口處細(xì)胞質(zhì)的融合

為了探究煙草自體嫁接體接口細(xì)胞質(zhì)的融合情況，用共聚焦顯微鏡觀察了在細(xì)胞質(zhì)中單獨(dú)表達(dá)sfGFP1-10和mCherry-11的未嫁接煙草幼苗Nb-1-10和Nb-11以及煙草自體嫁接體Nb-11/Nb-11和Nb-1-10/Nb-11。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未嫁接煙草幼苗Nb-1-10和Nb-11以及煙草自嫁接體Nb-11/Nb-11中無GFP熒光信號(圖3-A—C)，而在煙草自體嫁接體Nb-1-10/Nb-11的接口處觀察到GFP信號，且有部分熒光信號轉(zhuǎn)移到接穗和砧木中，聚集在維管部位(圖3-D)。

2.4 sfGFP系統(tǒng)可視化擬南芥/煙草嫁接體接口處細(xì)胞質(zhì)的融合

利用sfGFP系統(tǒng)識別擬南芥自體嫁接體和煙草自體嫁接體接口處細(xì)胞質(zhì)融合的方法是可行的，為進(jìn)一步監(jiān)測遠(yuǎn)緣嫁接體細(xì)胞質(zhì)融合情況，將在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)sfGFP1-10的擬南芥接穗嫁接到在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)mCherry-11的煙草砧木上構(gòu)建遠(yuǎn)緣嫁接體At-1-10/Nb-11。在嫁接后第4天，用共聚焦激光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，對照嫁接體At-11/Nb-11中無GFP信號(圖4-A)，擬南芥與煙草的遠(yuǎn)緣嫁接體At-1-10/Nb-11接口處檢測到GFP信號，拆分的sfGFP片段在接口處重組后移動到接穗部位，大量聚集在接穗維管束周圍(圖4-B)。

圖3 轉(zhuǎn)基因煙草單株及煙草/煙草嫁接體GFP信號觀察Fig.3 GFP signal observation of transgenic Nicotiana benthamiana plants and Nb/Nb grafts

圖4 擬南芥/煙草嫁接體GFP信號觀察Fig.4 GFP signal observation of At/Nb grafts

2.5 遠(yuǎn)緣嫁接與自體嫁接接口處細(xì)胞質(zhì)融合差異

為了比較自體嫁接體與遠(yuǎn)緣嫁接體在細(xì)胞質(zhì)融合上的差異，用LAS AF Lite統(tǒng)計(jì)嫁接體接口處及附近部位的GFP熒光表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在嫁接后第4天，擬南芥和煙草的遠(yuǎn)緣嫁接體At-1-10/Nb-11的GFP熒光強(qiáng)度顯著強(qiáng)于自體嫁接體At-1-10/At-11和Nb-1-10/Nb-11(P<0.05)，且擬南芥自體嫁接體的熒光強(qiáng)度顯著強(qiáng)于煙草自體嫁接體(P<0.05)(圖5)。

不同小寫字母表示數(shù)據(jù)之間存在顯著差異(P<0.05)。 Different lowercase letters indicated significant differences between the data(P<0.05).

3 結(jié)論與討論

Stegemann等[16]、Lu等[17]和Hertle等[18]的研究表明，嫁接可以使葉綠體基因組跨越物種屏障，且葉綠體能夠在砧穗間移動，它們在試驗(yàn)中將GFP、YFP和RFP作為標(biāo)簽對嫁接體接口細(xì)胞器的移動進(jìn)行監(jiān)測追蹤。本研究利用拆分的sfGFP系統(tǒng)可視化自體嫁接與遠(yuǎn)緣嫁接細(xì)胞質(zhì)融合的方法更直觀簡便，省去雙抗性培養(yǎng)基篩選愈傷組織的過程，構(gòu)建了在細(xì)胞質(zhì)中單獨(dú)表達(dá)sfGFP1-10和sfGFP11的轉(zhuǎn)基因擬南芥和在細(xì)胞質(zhì)中單獨(dú)表達(dá)sfGFP1-10和sfGFP11的轉(zhuǎn)基因煙草植株，嫁接后利用共聚焦顯微鏡觀察嫁接體接口處是否存在GFP熒光信號，以此判斷接穗與砧木接口處細(xì)胞間細(xì)胞質(zhì)是否發(fā)生融合。結(jié)果表明，在嫁接后第4天，自體嫁接與遠(yuǎn)緣嫁接體接口處細(xì)胞質(zhì)已經(jīng)發(fā)生融合，遠(yuǎn)緣嫁接體與自體嫁接體接口處的GFP信號都向嫁接體接穗和砧木部位發(fā)生不同程度的轉(zhuǎn)移，大量聚集在維管束附近，這與Hertle等[18]和Melnyk等[24]的結(jié)論一致，推測細(xì)胞質(zhì)的融合發(fā)生在維管束重連(3 DAG)之前，可能在嫁接后短時(shí)間內(nèi)接口處就產(chǎn)生了細(xì)胞質(zhì)融合；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)緣嫁接體發(fā)生的細(xì)胞質(zhì)融合程度遠(yuǎn)強(qiáng)于自體嫁接，這可能與物種間不親和性有關(guān)，遠(yuǎn)緣物種在嫁接愈合過程中接口處細(xì)胞間的識別以及維管束的變化是劇烈的[25]，為響應(yīng)這一系列劇變，可能導(dǎo)致遠(yuǎn)緣嫁接體砧穗間細(xì)胞器的融合及移動發(fā)生時(shí)期更早，且強(qiáng)度強(qiáng)于自體嫁接體，具體原因尚需進(jìn)一步研究。本研究僅觀察了在嫁接后第4天嫁接體接口處細(xì)胞質(zhì)融合情況，尚不清楚接口處細(xì)胞質(zhì)是從何時(shí)開始融合轉(zhuǎn)移的。為進(jìn)一步探究嫁接體砧穗間細(xì)胞器的融合互作機(jī)制，在本研究的基礎(chǔ)上，可以構(gòu)建在細(xì)胞核、葉綠體和線粒體等細(xì)胞器單獨(dú)表達(dá)sfGFP1-10和mCherry-11的轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草植株，分別在嫁接后第3天、嫁接后第2天、嫁接后1天甚至嫁接后更短時(shí)間內(nèi)觀察接口處的熒光表達(dá)情況。

目前，砧穗間細(xì)胞互作相關(guān)研究還處于初級階段，尚未弄清接口處細(xì)胞間細(xì)胞器是如何融合移動的。本研究將sfGFP系統(tǒng)應(yīng)用于研究砧穗間細(xì)胞互作的方法是新穎的，利用這種自組裝拆分sfGFP系統(tǒng)的發(fā)光機(jī)制，可視化嫁接體接口處細(xì)胞質(zhì)的融合，證實(shí)了sfGFP系統(tǒng)在嫁接體愈合機(jī)制研究中的可行性，為研究嫁接體接口處細(xì)胞學(xué)事件提供了新思路和方法。