王亞男，梁巖巖，嚴(yán)文培，張銀萍，李 強(qiáng)，吳秀菊

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

O-甲基轉(zhuǎn)移酶是一類調(diào)控植物次生代謝的關(guān)鍵酶，在木質(zhì)素、類黃酮等次生代謝產(chǎn)物的合成與修飾中起著重要作用[1]。O-甲基轉(zhuǎn)移酶催化的反應(yīng)是將S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的甲基轉(zhuǎn)移到底物的O-原子上，從而得到相應(yīng)的甲基化產(chǎn)物[2]。一般根據(jù)OMT蛋白的大小和是否依賴二價陽離子輔助催化來進(jìn)行分類，一類是催化過程依賴于金屬離子的輔助且催化活性較小的OMT，另一類是常以二聚體的形式存在，催化過程不依賴金屬離子即可發(fā)揮活性的OMT[3]。O-甲基轉(zhuǎn)移酶家族具有5個保守結(jié)構(gòu)域，Ⅰ～Ⅲ區(qū)參與S-腺苷蛋氨酸甲硫結(jié)合，Ⅳ區(qū)負(fù)責(zé)金屬離子的結(jié)合， Ⅴ區(qū)參與催化[4]。

中藥細(xì)辛在2020版《中國藥典》中規(guī)定為馬兜鈴科植物北細(xì)辛(AsarumheterotropoidesFr.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.)Kitag.)、漢城細(xì)辛(A.sieboldiiMiq. var.seou1enseNakai)或華細(xì)辛(A.sieboldiiMiq.)的干燥根和根莖[5]，常用于痰飲喘咳、風(fēng)寒感冒等癥狀[6]。自明代以來認(rèn)為北細(xì)辛品質(zhì)佳，并逐漸成為主流商品，延續(xù)至今[7]。北細(xì)辛主要分布在吉林、遼寧、黑龍江一帶[8]，其主要活性物質(zhì)是揮發(fā)油，基本在3%以下[9]，不同產(chǎn)地的揮發(fā)油成分均以甲基丁香酚與黃樟醚為主[10]。其中甲基丁香酚是通過苯丙烷代謝途徑合成的[11]，其合成通路中的重要中間產(chǎn)物阿魏酸、松柏醛、松柏醇也用于合成木質(zhì)素，而木質(zhì)素的合成主要受咖啡酸O-甲基轉(zhuǎn)移酶(Caffeic acid O-menthyl-transferase，COMT)和咖啡酰CoA O-甲基轉(zhuǎn)移酶(Caffeoyl coenzyme A-O-methyltransferase，CCoAOMT)基因的調(diào)控[12]。Shaipulah 等[13]研究表明，在矮牽牛中沉默CCoAOMT基因會導(dǎo)致植株中花青素積累，并降低丁香酚的含量。這些研究結(jié)果表明，OMT在植物次生代謝通路中具有控制物質(zhì)合成和調(diào)控物質(zhì)流向的重要作用。

甲基丁香酚的生物合成最終是以丁香酚為底物，在丁香酚O-甲基轉(zhuǎn)移酶(EOMT)的催化作用下完成[14]。目前僅在月季(Rosachinensis)、枇杷(Eriobotryajaponica)、羅勒(Ocimumbasilicum)、仙女扇(Clarkiabreweri)、蘋果(Malusdomestica)和胡蘿卜(Daucuscarota)中克隆得到具催化合成甲基丁香酚功能的O-甲基轉(zhuǎn)移酶[15-20]。Gang等[14]研究表明，ObEOMT1催化丁香酚，也可催化胡椒酚與異丁香酚。胡蘿卜DcE(I)OMT1可催化丁香酚、異丁香酚、胡椒酚，催化效率依次減弱，最適底物為丁香酚[20]。枇杷中分離得到4個OMT，其中EjOMT1的表達(dá)量隨著花的發(fā)育增加，可以催化愈創(chuàng)木酚、異丁香酚、丁香酚、兒茶酚、阿魏酸、香蘭素6種底物，愈創(chuàng)木酚為最適底物[16]。這些研究表明，以二聚體形式存在的OMT類可催化與最適底物結(jié)構(gòu)相似的其他化合物，也驗證了以丁香酚為底物進(jìn)行體外酶活反應(yīng)可以生成甲基丁香酚。

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)吳秀菊課題組前期圍繞甲基丁香酚合成途徑，基于本地北細(xì)辛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，克隆得到PAL、C4H、4CL、CAD和EGS等甲基丁香酚合成相關(guān)酶基因[11，21]，但催化最后一步反應(yīng)的丁香酚O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因尚未分離得到。為此，本研究擬篩選、克隆北細(xì)辛AhOMT1，進(jìn)行生物信息學(xué)分析及原核表達(dá)分析，以期為體外酶活分析、基因功能研究及其代謝工程應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

北細(xì)辛樣本采自黑龍江省森林植物園藥用植物園，保存于-80 ℃。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成 參照Trans Zolup Plus RNA Kit說明書提取北細(xì)辛總RNA，以微量分光光度計測定其濃度和純度，并用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質(zhì)量，使用海基生物RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書得到cDNA。

1.2.2 北細(xì)辛OMT基因的篩選與克隆 以羅勒ObEOMT序列為參考，對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行本地Blast，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中基因表達(dá)信息及結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析進(jìn)行篩選，將Contig_163作為OMT候選基因并命名為AhOMT1。以Contig_163為參考序列，使用 Primer Premire 5.0(Premier Biosoft)設(shè)計2對特異性引物(AhOMT1-1/2)，巢式PCR擴(kuò)增出AhOMT1完整的ORF，引物序列如表1所示。

表1 PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for PCR

以cDNA為模板，利用全式金TopTaqDNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性25 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 個循環(huán)；72 ℃，5 min。反應(yīng)產(chǎn)物稀釋100倍后用于第2輪PCR反應(yīng)模板，反應(yīng)程序同上。目的片段經(jīng)回收純化后連接至pEASY-T3 Vector，轉(zhuǎn)化至DH5α，經(jīng)菌液PCR鑒定后，挑取陽性菌株送至庫美生物公司進(jìn)行測序。

1.2.3 AhOMT1蛋白的生物信息學(xué)分析 采用ExPASyProtParam tool(http：//web.expasy.org/protparam/)分析基因編碼蛋白的理化性質(zhì)；InterProScan(http：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)分析基因編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)；SOPMA SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)；SWISS-MODEL(https：//www.swissmodel.expasy.org/)預(yù)測蛋白的三維結(jié)構(gòu)；TMHMM(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)和SignalP 5.0 Server(http：//www.cbs.dtu.dk/servic-es /SignalP/)分析其跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽。利用DNAMAN軟件對測序結(jié)果進(jìn)行比對以及AhOMT1蛋白序列與其他O-甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白序列的多重比對；使用MEGA 6.0軟件對AhOMT1蛋白序列與其他物種的O-甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白序列構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.4 AhOMT1原核表達(dá)載體構(gòu)建、蛋白表達(dá)條件優(yōu)化及純化

1.2.4.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 利用Primer Premier 5.0設(shè)計引物在AhOMT1基因上下游引物5′端加入同源臂，引物序列如表1所示，使用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件同2.2。將擴(kuò)增的目的片段與經(jīng)過BamH Ⅰ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行單酶切的pET-32b載體通過同源重組酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E..coliDH5α，進(jìn)行菌液 PCR 和測序驗證，保存陽性菌種并按照擎科試劑盒提取質(zhì)粒。

1.2.4.2 AhOMT1原核表達(dá)條件的優(yōu)化 將構(gòu)建好的原核表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，將陽性菌落接種至4 mL LB液體培養(yǎng)基中(Amp：100 μg/mL)，37 ℃，200 r/min，過夜培養(yǎng)。次日以1∶50 比例轉(zhuǎn)入50 mL LB液體培養(yǎng)基中相同條件培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.4～0.6。加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，16 ℃，110 r/min培養(yǎng)16 h。菌液4 ℃離心，5 000 r/min，15 min，棄上清。2.5 mL細(xì)菌裂解液重懸菌體，冰上超聲破碎，功率225 W，超聲時間2 s，間隔時間5 s，破碎至菌液澄清，吸取全菌液備用。4 ℃破碎菌液，12 000 r/min離心5 min，分離上清與包涵體，吸取上清備用。2.5 mL細(xì)菌裂解液重懸沉淀，吸取重懸的沉淀備用。將5×Sample Buffer分別加入全菌液、上清與沉淀中，吹打混勻，沸水浴7 min，轉(zhuǎn)至冰上，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

將菌液培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6，按1∶50的比例轉(zhuǎn)入50 mL含有0.2 mmol/L IPTG的LB液體培養(yǎng)基中，分別置于16，28，37 °C繼續(xù)培養(yǎng)4，8，16 h，SDS-PAGE電泳。

①糖尿病急性并發(fā)癥如酮癥酸中毒患者②嚴(yán)重的心肺肝腎功能異常③合并泌尿系、呼吸道等嚴(yán)重感染者④妊娠、哺乳婦女⑤繼發(fā)糖尿病患者⑥1型糖尿病患者。

1.2.4.3 融合蛋白的純化 采用康為世紀(jì)的His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒，對16 °C條件下誘導(dǎo)16 h的重組蛋白進(jìn)行純化，操作步驟詳見試劑盒說明書，純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

2 結(jié)果與分析

2.1 北細(xì)辛OMT基因的篩選

基于本實驗室前期得到的北細(xì)辛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，以羅勒EOMT1基因序列作為探針，在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行本地Blast搜索，篩選出21條相似序列。進(jìn)一步通過保守結(jié)構(gòu)域分析(圖1)，發(fā)現(xiàn)具有完整ORF且包含OMT保守結(jié)構(gòu)域的僅有3條Contig，即Contig_163、Contig_1153和Contig_3987。結(jié)合本地數(shù)據(jù)庫相關(guān)信息分析得出(表2)，擬選擇各部分表達(dá)水平(在根中表達(dá)量較高)與甲基丁香酚在北細(xì)辛中的分布趨勢一致的Contig_ 163作為候選基因

圖1 篩選基因的保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.1 Analysis of conserved domains of screening genes

。

表2 篩選到的OMT基因表達(dá)Tab.2 Expression of screened OMT gene

2.2 AhOMT1基因的克隆

以AhOMT1基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)檢測，擴(kuò)增產(chǎn)物在1 000 bp處有單一亮帶，與預(yù)計大小一致(圖2)。對其進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物連接T3載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。陽性克隆菌液PCR驗證結(jié)果如圖2所示，菌液樣本均在1 000 bp左右有單一亮帶。測序結(jié)果顯示，得到的AhOMT1的ORF序列長度為1 089 bp，與轉(zhuǎn)錄組中Contig_163的CDS序列完全相同。

M. Marker；1—3.菌液PCR產(chǎn)物。 M. Marker；1—3. Bacterial liquid PCR product.

2.3 AhOMT1蛋白的生物信息學(xué)分析

2.3.1 AhOMT1蛋白理化性質(zhì)、功能域預(yù)測和亞細(xì)胞定位預(yù)測AhOMT1基因編碼區(qū)含1 089個堿基，編碼362個氨基酸，分子式為C1822H2849N463O530S16，預(yù)測分子質(zhì)量是40.23 ku，等電點為5.34。該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為37.89，是穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)96.13，親水性平均系數(shù)為-0.002，推測為親水性蛋白。亞細(xì)胞預(yù)測結(jié)果顯示，AhOMT1定位于細(xì)胞質(zhì)。

AhOMT1蛋白包含蛋白質(zhì)二聚化結(jié)構(gòu)域(氨基酸位置在第30—78位，IPR012967/PF08100)以及O-甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域(氨基酸位置在第134—344位，IPR001077/PF00891)，屬于第一類O-甲基轉(zhuǎn)移酶(圖3)。

圖3 AhOMT1蛋白結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 AhOMT1 protein domain analysis

2.3.2 AhOMT1蛋白結(jié)構(gòu)、信號肽和結(jié)構(gòu)域分析 用 SOPMA 在線軟件對AhOMT1蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該蛋白的α螺旋比例為46.69%，延伸鏈比例為13.81%，β折疊比例為6.63%，無規(guī)則卷曲比例為32.87%。由此，該基因編碼的蛋白二級結(jié)構(gòu)為無規(guī)則卷曲型。使用同源建模工具SWISS-MODEL預(yù)測AhOMT1蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型，結(jié)果如圖4所示，以苜蓿(Medicagosativa)的異黃酮-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的晶體三維結(jié)構(gòu)為模板(SMTL ID：1fp2.1.A)，在AhOMT1第10—362位氨基酸殘基建模1，相似性為44.84%，GMQE值為0.73，QMEAN值為-1.75。AhOMT1蛋白底物結(jié)合口袋襯有芳香族和脂肪族氨基酸側(cè)鏈，為底物結(jié)合提供了疏水環(huán)境，與SAM相互作用的氨基酸殘基為Ser-179、Gly-205、Gly-207、Leu-229、Asp-248、Met-249、Lys-262、Asp-267。

利用SignalP 5.0 Server在線軟件，預(yù)測AhOMT1的信號肽平均值為0.000 8，不具有信號肽及切割點，為非分泌蛋白。利用 TMHMM Server v2.0在線軟件對AhOMT1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果顯示其為膜外蛋白，無跨膜區(qū)。

A，B.以MsIOMT為模板的預(yù)測結(jié)構(gòu)； B中藍(lán)色為脂肪族氨基酸殘基。 A，B. Forecast structure using MsIOMT as template；The blue in B is aliphatic aliphatic amino acid residues.

2.3.3 AhOMT1蛋白的同源比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 與其他植物的OMTs進(jìn)行氨基酸序列比對，結(jié)果如圖5所示，在紫花苜蓿異黃酮O-甲基轉(zhuǎn)移酶(MsIOMT)晶體結(jié)構(gòu)的報道中，MsIOMT的His-257負(fù)責(zé)將底物的芳香族羥基去質(zhì)子化，并在底物甲基化過程中引發(fā)對SAM的雙分子親核取代反應(yīng)(Sn2)，Asp-288和Glu-318在空間結(jié)構(gòu)上以及通過氫鍵結(jié)合的方式限制了His-257，從而促進(jìn)了有效的催化作用[22]。這些氨基酸殘基在AhOMT1中是保守的，表明它們也是AhOMT1中的催化殘基。此外，AhOMT1蛋白在O-甲基轉(zhuǎn)移酶家族的保守區(qū)域Box I—Box V也相對保守。

Ah.北細(xì)辛；Ms.紫花苜蓿；Ob.羅勒；Cb.仙女扇；Ej.枇杷；Dc.胡蘿卜；Md.蘋果；*.催化殘基。 Ah.Asarum heterotropoides；Ms.Medicago sativa(FP2A)；Ob.Ocimum basilicum EOMT1(AAL30424)；Cb.Clarkia breweri IEMT1(AAL01533)； Ej.Eriobotrya japonica(BAV54107.1)；Dc.Daucus carota(XP_017238865.1)；Md.Malus domestica(AKN09016.1)；*.Catalytic residue.

AhOMT1編碼的蛋白與不同植物的OMT蛋白進(jìn)化關(guān)系如圖6所示，這些氨基酸序列根據(jù)同源性被分為2類，第1類幾乎為COMT或從COMT進(jìn)化來的酶(如CbIEMT)，第2類為可催化黃酮、異黃酮以及丁香酚等底物的OMT，AhOMT1歸為第2類。

2.4 pET-23b-AhOMT重組表達(dá)載體的構(gòu)建

將AhOMT1ORF通過同源重組的方法插入經(jīng)BamH Ⅰ單酶切的pET-32b載體，連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，挑取單克隆菌落進(jìn)行PCR檢測，均為陽性克隆(圖7)，經(jīng)測序與酶切電泳檢測，結(jié)果表明，正向測序結(jié)果與AhOMT1序列比對一致，無堿基突變情況，說明目的片段與pET-32b載體連接成功并且插入方向正確。

進(jìn)化樹類型為NJ(Neighbor-joining)樹，Bootstrap 取樣值為1 000；結(jié)點的Bootstrap value評估該分支的可信度。 The evolutionary tree type is NJ(Neighbor-joining)tree，and the bootstrap sampling value is 1 000； The Bootstrap value of the node evaluates the credibility of the branch.

M.DNA Marker；1—4.菌液PCR產(chǎn)物；5.未酶切pET-32b質(zhì)粒；6.單酶切pET-32b質(zhì)粒；7.pET-32b-AhOMT1重組質(zhì)粒。 M. DNA Marker；1—4. Bacterial liquid PCR product；5.pET-32b digested with enzyme； 6.Non-digested pET-32b；7.pET-32b-AhOMT1 recombinant plasmid.

2.5 AhOMT原核表達(dá)條件優(yōu)化和純化

將陽性重組質(zhì)粒pET-32b-AhOMT1轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)，為了使pET-32b-AhOMT1重組質(zhì)粒融合蛋白在上清中表達(dá)量更高，對誘導(dǎo)溫度進(jìn)行了優(yōu)化。對重組載體進(jìn)行不同溫度(37 ℃，4 h；28 ℃，8 h；16 ℃，16 h)的誘導(dǎo)，并由SDS-PAGE檢測蛋白的表達(dá)。AhOMT1與pET-32b載體上的標(biāo)簽蛋白進(jìn)行融合表達(dá)時的分子質(zhì)量約為60 ku。如圖8-A—C所示，pET-32b-AhOMT1重組質(zhì)粒經(jīng)誘導(dǎo)后在55～70 ku有一條明顯的條帶，與預(yù)期大小一致。隨著誘導(dǎo)溫度的降低，菌液上清中的表達(dá)量逐漸增大，因此選擇16 ℃、16 h作為最佳誘導(dǎo)條件。最佳誘導(dǎo)條件得到pET-32b-AhOMT1重組質(zhì)粒融合蛋白，所得上清液以鎳柱進(jìn)行純化，如圖8-D所示，咪唑濃度為100，200，300 mmol/L AhOMT1蛋白被洗脫下來，相比較而言，咪唑濃度為200 mmol/L洗脫蛋白量最大。

3 結(jié)論與討論

北細(xì)辛是我國東北地區(qū)重要的藥用植物，現(xiàn)以根和根莖入藥[23]，含有揮發(fā)油(以甲基丁香酚為主)、細(xì)辛脂素、黃酮類等成分，具有解表散寒[24]、鎮(zhèn)痛消炎[25]等藥理活性，在治療新型冠狀病毒肺炎的通用方劑清肺排毒湯中就含有細(xì)辛這一味中藥[26]，李靜團(tuán)隊對湖北省近萬例病歷進(jìn)行了整理分析，結(jié)果顯示，我國新冠肺炎診療方案持續(xù)推薦和臨床廣泛使用的清肺排毒湯可使得新冠肺炎住院患者的死亡率下降1/2[27]。但近年來北細(xì)辛野生資源急劇減少，人工繁殖又存在生長周期長、有效成分的積累易受環(huán)境條件影響等問題，且大量研究結(jié)果表明，北細(xì)辛的揮發(fā)油量僅在3%左右[9]，作為主要成分的甲基丁香酚含量更低，一定程度上限制了其在臨床上的應(yīng)用。如能解析主要活性成分如甲基丁香酚代謝途徑，獲得合成相關(guān)酶基因，通過代謝工程方式將有望緩解供需矛盾。

A.37 ℃，4 h；B.28 ℃，8 h；C.16 ℃，16 h；D.pET32b-AhOMT1蛋白純化；M.蛋白Marker；1.空載對照誘前總蛋白；2.空載對照誘后總蛋白；3.重組蛋白誘前總蛋白；4.重組蛋白誘后總蛋白；5.重組蛋白誘后上清；6.重組蛋白誘后包涵體；7—11.咪唑濃度分別為100，200，300，400，500 mmol/L洗脫的蛋白。

根據(jù)已知的苯丙素類(甲基丁香酚)生物合成途徑[13]及本地轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[28]，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)吳秀菊課題組已成功分離了北細(xì)辛PAL、C4H等相關(guān)酶基因[21]。以已報道的羅勒EOMT1序列為參考，對本地轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast分析，在北細(xì)辛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選到21條相似序列，進(jìn)一步通過NCBI線上預(yù)測基因功能結(jié)構(gòu)域以及候選基因的相對表達(dá)量 RPKM 分析，AhOMT1在各器官中的表達(dá)水平與甲基丁香酚在北細(xì)辛中的分布相似，因此，以Contig_163的CDS序列為參考序列，設(shè)計特異性引物，在北細(xì)辛中成功克隆得到1個OMT基因，命名為AhOMT1，蛋白結(jié)構(gòu)域分析表明，其為SAM依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶，屬于OMT家族，具二聚化結(jié)構(gòu)域，并且進(jìn)行甲基化反應(yīng)時不依賴金屬離子的一類OMT。通過不同植物OMT蛋白同源比對發(fā)現(xiàn)，AhOMT1與其他具有催化丁香酚或丁香酚結(jié)構(gòu)類似底物的OMT在O-甲基轉(zhuǎn)移酶共識區(qū)相對保守，本研究以紫花苜蓿的IOMT為模板，將AhOMT1進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)建模，發(fā)現(xiàn)預(yù)測結(jié)構(gòu)以二聚體形式存在，活性部位可與SAM相互作用，負(fù)責(zé)穩(wěn)定底物的氨基酸為色氨酸，與CbIEMT一致。

原核表達(dá)常用于體外基因功能驗證，也是研究花香代謝途徑相關(guān)基因酶功能的常用方法。本研究對AhOMT1蛋白親水性進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示，該蛋白為親水性蛋白，這表明該蛋白更大可能是以可溶性蛋白形式存在。一般通過調(diào)節(jié)誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時間的長短和溫度來獲得更多的可溶性蛋白。在不同物種中，具有相同功能的蛋白可能需要不同的誘導(dǎo)條件，如胡蘿卜DcOMT1蛋白的誘導(dǎo)條件為30 ℃，0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)12 h[20]；羅勒ObEOMT1蛋白以0.3 mmol/L的IPTG[22]，室溫過夜誘導(dǎo)；枇杷MjOMT1蛋白則以16 ℃，0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)12 h[16]。本研究在進(jìn)行AhOMT1原核表達(dá)時，設(shè)置了3個溫度，其中16 ℃，0.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)12 h可獲得較大量可溶性蛋白，為最佳誘導(dǎo)條件，使AhOMT1基因體外高效表達(dá)成為可能，也為體外酶活體系建立奠定基礎(chǔ)。使用鎳柱分離純化重組AhOMT1蛋白，得到純化后的AhOMT1蛋白，其中咪唑濃度為200 mmol/L洗脫蛋白量最大。

本研究對北細(xì)辛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行篩選，通過巢式PCR獲得北細(xì)辛AhOMT1CDS序列，成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-32b-AhOMT1，并確定了獲得較大量可溶性蛋白的最佳誘導(dǎo)條件：16 ℃，0.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)12 h，成功分離純化得到單一的AhOMT1 重組蛋白，研究結(jié)果為后續(xù)對AhOMT1基因的功能鑒定提供了理論基礎(chǔ)。