張曉寒，陳彥良，馬 欣，張珊珊，韋善君

(中央民族大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081)

結(jié)縷草屬(Zoysia)植物是C4類暖季型禾本科草，約有10 個(gè)種，具有發(fā)達(dá)的匍匐莖和地下根莖，是建植草坪草的良好材料[1-2]。目前，在全球廣泛種植的有日本結(jié)縷草(Z.japonicaSteud.)、溝葉結(jié)縷草(Zoysiamatrella)、細(xì)葉結(jié)縷草(Z.tenuifolia)、中華結(jié)縷草(Z.sinicaHance)以及它們之間的雜交種，它們形成的草坪耐高溫[3]、干旱[4]、高鹽[5]和重金屬[6-7]脅迫，耐踐踏[8]，養(yǎng)護(hù)成本低。在我國(guó)結(jié)縷草地理分布廣泛，種質(zhì)資源豐富。其中，山東半島和遼東半島有大面積的野生結(jié)縷草資源，是我國(guó)結(jié)縷草種子生產(chǎn)的重要基地[9-10]。在我國(guó)草坪草業(yè)界，結(jié)縷草一直占據(jù)著重要的地位，首要原因?yàn)榻Y(jié)縷草是我國(guó)唯一出口種子的草種，其次是我國(guó)適合種植結(jié)縷草的面積廣泛。溝葉結(jié)縷草及其衍生種地上莖密集，葉較硬且直立，匍匐莖發(fā)達(dá)，形成的草坪色澤翠綠，質(zhì)地厚且有彈性，在長(zhǎng)江流域及以南區(qū)域的公園、廣場(chǎng)草坪建植和公路兩側(cè)綠化中廣泛采用[8，11]。日本結(jié)縷草和中華結(jié)縷草耐踐踏能力強(qiáng)，在建植運(yùn)動(dòng)場(chǎng)草坪上有優(yōu)勢(shì)，在我國(guó)南北均有種植。然而，多年以來在我國(guó)廣泛種植的結(jié)縷草品種還是以進(jìn)口的為主[12]。優(yōu)質(zhì)品種是草坪業(yè)發(fā)展的核心，隨著我國(guó)對(duì)草業(yè)發(fā)展的重視，近20 a來具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的品種不斷推出，例如，2018年分別由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)和江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所培育的廣綠和蘇植5號(hào)通過了全國(guó)草品種審定委員會(huì)審定。自有產(chǎn)權(quán)優(yōu)質(zhì)品種的推出將進(jìn)一步促進(jìn)我國(guó)結(jié)縷草產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。

優(yōu)質(zhì)的草坪草不僅草坪質(zhì)地優(yōu)美，而且還需要有較強(qiáng)的適應(yīng)逆境的能力，所以提高抗逆性一直是結(jié)縷草育種中的一項(xiàng)重要內(nèi)容[13-15]。研究結(jié)縷草響應(yīng)逆境脅迫的特征及抗逆的分子機(jī)理，對(duì)培育高抗逆品種有指導(dǎo)價(jià)值。日本結(jié)縷草基因組大小約334 Mb，預(yù)計(jì)有59 271個(gè)編碼蛋白的基因[16]。在組學(xué)方面，Xuan 等[17]采用雙向電泳技術(shù)研究了低溫脅迫下日本結(jié)縷草和溝葉結(jié)縷草匍匐莖中的差異表達(dá)蛋白，Wei 等[18]和Long 等[19]先后報(bào)道了日本結(jié)縷草和溝葉結(jié)縷草在低溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄和生理調(diào)節(jié)，Wang 等[20]從轉(zhuǎn)錄組水平研究了大穗結(jié)縷草在鹽迫下的調(diào)節(jié)，Wang 等[21]從生理和轉(zhuǎn)錄組水平對(duì)日本結(jié)縷草鹽敏感和耐鹽的2個(gè)株系進(jìn)行了比較研究，這些結(jié)果為研究結(jié)縷草逆境響應(yīng)基因的功能提供了豐富的信息。在基因功能研究方面，已經(jīng)報(bào)道的逆境響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子有DREB2[22]、DREB1[23-24]、鋅指蛋白[25]、ICE[26-27]、NAC[28]，功能基因有液泡膜質(zhì)子-焦磷酸酶基因[29]、LEA基因[30-31]、GRP(Glycine-rich RNA-binding proteins)基因[32]、銅鋅超氧化物歧化酶基因[33]及其分子伴侶基因[34]。由于結(jié)縷草的種質(zhì)馴化歷程短，諸多原始遺傳性狀得以保留，研究結(jié)縷草抗逆的分子機(jī)制還有利于挖掘新基因資源用于其他植物的育種。

COR(Cold regulated)基因是早期發(fā)現(xiàn)的一些在低溫誘導(dǎo)下表達(dá)量顯著上調(diào)的基因，例如擬南芥中的COR78/RD29A、COR47、COR15a和COR6.6，小麥中的脫水素(Dehydrin)和晚期胚胎發(fā)育蛋白。后來的研究發(fā)現(xiàn)，COR基因的表達(dá)通常也受干旱和ABA等因素誘導(dǎo)。COR蛋白的共性是富含親水性氨基酸，能夠維持生物大分子及膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，具有增強(qiáng)細(xì)胞抗凍、抗脫水功能[35]。

本研究報(bào)道溝葉結(jié)縷草的一個(gè)低溫脅迫響應(yīng)基因ZmCOR410，分析了其表達(dá)產(chǎn)物的生物信息學(xué)特征，檢測(cè)了其在低溫脅迫下的表達(dá)情況，并在擬南芥植株和酵母細(xì)胞中評(píng)價(jià)了其抗逆功能，旨在為認(rèn)識(shí)結(jié)縷草抗逆機(jī)制積累資料。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為溝葉結(jié)縷草馬尼拉，采自浙江大學(xué)華家池校區(qū)校園草坪。擬南芥為哥倫比亞生態(tài)型。植物表達(dá)載體pZP212和農(nóng)桿菌Gv3101菌株為中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院生化與分子實(shí)驗(yàn)室保存材料，酵母表達(dá)載體pYES-Dest52和酵母G19菌株由中國(guó)科學(xué)院(江蘇省)植物園劉建秀研究員惠贈(zèng)。

1.2 ZmCOR410基因的克隆及生物學(xué)信息學(xué)分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)引物P1(ATGGAGGACGAGAGGAACAAAGC)和P2(ATGGAGGACGAGAGGAACAAAGC)。以 4 ℃處理 72 h 的 cDNA 為模板，用P1和P2PCR擴(kuò)增ZmCOR410基因的編碼區(qū)(CDS)。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為(20 μL)： 2×PrimeSTAR Max DNA Polymerase 10 μL，P1和P2各 0.25 μL(10 μmol/L)， cDNA 模板 1 μL， ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)?：(98 ℃ 10 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s)× 32 循環(huán)。將PCR產(chǎn)物送到上海生工測(cè)序檢測(cè)確定擴(kuò)增產(chǎn)物的序列。利用GENSCAN(http：//genes.mit.edu/GENSCAN.html)預(yù)測(cè)所編碼的氨基酸序列；采用Protparam(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；通過TMHMM(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進(jìn)行蛋白跨膜區(qū)分析；蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)通過SOPMA(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測(cè)；系統(tǒng)發(fā)育樹采用軟件MEGA 7.0(NJ法，Bootstrap=1 000)構(gòu)建。

1.3 ZmCOR410基因表達(dá)對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)

溝葉結(jié)縷草種植于培養(yǎng)室內(nèi)，培養(yǎng)基質(zhì)為珍珠巖∶蛭石∶營(yíng)養(yǎng)土=1∶1∶2，培養(yǎng)室溫度為28 ℃/22 ℃(L/D)，定期修剪。以修剪后6周齡植株為試材，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱中進(jìn)行4 ℃低溫處理，分別于2，6，12，24，72 h后取植株頂端第1～2片展開葉，同時(shí)取培養(yǎng)室內(nèi)植株葉為對(duì)照，液氮中速凍后置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。用植物總RNA提取試劑盒(TaKaRa)提取總RNA。選用經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop2000檢驗(yàn)合格的RNA樣品，以O(shè)ligo dT為引物，用反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體操作按說明書進(jìn)行。以cDNA為模板，以actin1(NCBI accession No.：GU290545)為內(nèi)標(biāo)基因，采用qRT-PCR法檢測(cè)各處理中ZmCOR410的表達(dá)量。內(nèi)標(biāo)基因引物為Pactin-F(GATATGCACTTCCCCATGCT)和Pactin-R(CGAGCTTCTCCTTGATGTCC)，ZmCOR410基因的引物為5′—3′(GAAGCACGAGGTCAAGAAGG)和(TCTCGTCGATCACCTCCTCT)。反應(yīng)總體系12 μL，其中cDNA 1 μL，SYBR Premix 6 μL，基因上、下游引物各0.24 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，56 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 擬南芥中評(píng)價(jià)ZmCOR410基因抗逆功能

將ZmCOR410CDS克隆到植物表達(dá)載體pZP212的XbaⅠ和SacⅠ之間，獲得重組質(zhì)粒pZP212-ZmCOR410。采用凍融法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌Gv3101，通過浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥。擬南芥種子經(jīng)次氯酸鈉溶液(含2%有效氯)表面消毒后，播種到含有50 μg/mL硫酸卡那霉素的MS培養(yǎng)基上，篩選轉(zhuǎn)基因植株，收集轉(zhuǎn)基因植株T3種子用于抗逆評(píng)價(jià)試驗(yàn)。將野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥植株種子播種在MS培養(yǎng)基平板上，10 d后將幼苗移栽至蛭石∶營(yíng)養(yǎng)土=1∶1的基質(zhì)中培養(yǎng)。冷凍處理是將移栽后28 d的苗子轉(zhuǎn)到培養(yǎng)箱中，溫度調(diào)到-6 ℃，2 h后灑冰水以誘導(dǎo)冰核形成，再繼續(xù)冷凍處理12 h，然后將溫度調(diào)到4 ℃化凍12 h。將植株轉(zhuǎn)回到培養(yǎng)室中恢復(fù)生長(zhǎng)，14 d后用葉片傷害指數(shù)來描述葉片的受損情況[36]。首先根據(jù)受損程度將葉片分為5級(jí)：基本無明顯受損(0級(jí))、表面有少量變黃(Ⅰ級(jí))、將近1/2面積焦枯(Ⅱ級(jí))、大部分焦枯(Ⅲ級(jí))、全部焦枯死亡(Ⅳ級(jí))。

①

高溫處理是將移栽后兩周齡的幼苗轉(zhuǎn)入60 ℃培養(yǎng)箱中處理4 h，然后轉(zhuǎn)入溫室內(nèi)恢復(fù)培養(yǎng)，14 d后觀察記錄植株存活率。干旱處理是幼苗移栽7 d后停止?jié)菜钡街仓瓿霈F(xiàn)明顯萎蔫癥狀，復(fù)水7 d后觀察統(tǒng)計(jì)存活情況。以上脅迫處理設(shè)轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株2個(gè)群體，樣本量均為30株以上。采用χ2統(tǒng)計(jì)分析2個(gè)群體植株的存活率差異。

1.5 酵母細(xì)胞中評(píng)價(jià)ZmCOR410基因抗高溫功能

采用Gateway重組技術(shù)將ZmCOR410的CDS克隆到酵母表達(dá)載體pYES-Dest52中，獲得重組載體pYES-ZmCOR410。分別將重組載體和pYES-Dest52轉(zhuǎn)入酵母G19菌株感受態(tài)細(xì)胞中，在亮氨酸缺陷型培養(yǎng)基(SD/Leu-)上篩選轉(zhuǎn)化子。制備酵母細(xì)胞的無菌水懸濁液，參照張杰等[37]試驗(yàn)方法，在50 ℃下處理25，35，45 min，然后轉(zhuǎn)到30 ℃復(fù)蘇10 min。取100 μL菌懸液涂布接種到SD/Leu-培養(yǎng)基平板上，涂布未經(jīng)高溫處理的菌懸液為對(duì)照，30 ℃培養(yǎng)48 h后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，計(jì)算存活率。每個(gè)處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmCOR410基因的克隆

在前期的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中，有一個(gè)注釋為COR410的拼接物，長(zhǎng)1 717 bp，包含一個(gè)完整的閱讀框。在預(yù)測(cè)的閱讀框兩端設(shè)計(jì)引物，以4 ℃低溫處理72 h植株葉片的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果獲得了接近1 000 bp 的特異帶(圖1)。對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行克隆和測(cè)序結(jié)果顯示，該片段長(zhǎng)927 bp，序列與預(yù)測(cè)的閱讀框相符。

在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BlastX分析，結(jié)果表明，該基因氨基酸序列與小麥COR410基因的相似度高，因此命名為ZmCOR410。根據(jù)文獻(xiàn)[16]下載溝葉結(jié)縷草基因組序列，用ZmCOR410的編碼區(qū)(CDS)進(jìn)行查找，獲得其在基因組上的序列。將CDS、轉(zhuǎn)錄組拼接序列以及基因組序列進(jìn)行比對(duì)可知，基因中含有一個(gè)長(zhǎng)101 bp的內(nèi)含子，翻譯起始密碼子往前1 700 bp序列中，正鏈含有2個(gè)ACCGAC序列和1個(gè)GCCGAC序列，反向互補(bǔ)鏈中有1個(gè)GCCGAC序列(圖2)，推測(cè)其轉(zhuǎn)錄受CBF/DREB1轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)。

圖1 ZmCOR410 編碼區(qū)的PCR擴(kuò)增Fig.1 The amplification of the coding sequence of ZmCOR410 by PCR

白色方塊為外顯子，黑色方塊為內(nèi)含子；(+)和(-)分別代表有義鏈和無義鏈；1為翻譯起始位點(diǎn)。

2.2 ZmCOR410蛋白的結(jié)構(gòu)特征

ZmCOR410基因編碼308個(gè)氨基酸，主要的氨基酸組成為谷氨酸(Glu)14.6%、賴氨酸(Lys)13.0%、丙氨酸(Ala)9.1%、絲氨酸(Ser)7.8%和甘氨酸(Gly)6.2%。ZmCOR410蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為33.8 ku，理論等電點(diǎn)為5.69，為偏酸性蛋白質(zhì)。序列中有一個(gè)富含賴氨酸殘基的基序，即K片段，還有一段可以被磷酸化的由多個(gè)絲氨酸殘基組成的S片段，但其中缺少富含甘氨酸的重復(fù)序列，也不存在Y片段(DEYGNP)(圖3)。這些特征都與LEA蛋白家族第Ⅱ亞組相符，該亞組也稱D11蛋白，為脫水素。

親疏水性分析表明，ZmCOR410氨基酸平均親水性指數(shù)(GRAVY)為-1.277(圖4-A)，說明該蛋白為親水性蛋白。利用SOPMA工具進(jìn)行蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，ZmCOR410蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、無規(guī)則卷曲、β-折疊和延伸鏈占比分別為34.09%，55.84%，5.19%，4.87%(圖4-B)，表明組成蛋白質(zhì)分子的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)元件是α-螺旋和無規(guī)則卷曲，這樣有助于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[38]。利用TMHMM工具進(jìn)行蛋白質(zhì)跨膜區(qū)分析結(jié)果表明，所有氨基酸均位于細(xì)胞膜外，不含有跨膜區(qū)，說明ZmCOR410屬于非跨膜類蛋白(圖5)。ZmCOR410的上述一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)均符合酸性脫水素的特征[38]。

方框內(nèi)為K-片段；下劃線處為S-片段。 The box is K-segment；Underline is S-segment.

2.3 ZmCOR410基因的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

將ZmCOR410的氨基酸序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BlastP分析，選取與其氨基酸序列相似度最高的前30個(gè)同源基因(來自17個(gè)物種)，使用Mega 7.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)并構(gòu)建基因系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，這些基因明顯地分成C4植物和C3植物2個(gè)大支。其中，C3分支主要是由麥類和水稻同源基因2個(gè)小分支構(gòu)成；C4分支由玉米同源基因和其他C4植物同源基因2個(gè)小分支構(gòu)成。結(jié)縷草ZmCOR410與抗高溫干旱能力強(qiáng)的彎葉畫眉草、無芒隱子草的同源基因親緣關(guān)系最近(圖6)。

圖5 ZmCOR410蛋白氨基酸序列跨膜分析Fig.5 Transmembrane analysis of ZmCOR410 protein

圖6 ZmCOR410蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.6 Phylogenetic tree analysis of ZmCOR410 protein

2.4 低溫脅迫下ZmCOR410基因的表達(dá)調(diào)節(jié)

本研究檢測(cè)了4 ℃低溫脅迫下溝葉結(jié)縷草葉組織中ZmCOR410表達(dá)調(diào)節(jié)，結(jié)果表明，在常溫條件下ZmCOR410基因表達(dá)量很低；在4 ℃低溫脅迫下，2 h后其表達(dá)量明顯上升，并隨著脅迫的延長(zhǎng)持續(xù)上升，增量最大的時(shí)間點(diǎn)在脅迫后24 h，直到脅迫后72 h其表達(dá)量持續(xù)上升。說明溝葉結(jié)縷草葉片中ZmCOR410基因的表達(dá)對(duì)低溫脅迫敏感，受低溫脅迫顯著誘導(dǎo)(圖7)。

2.5 轉(zhuǎn)化ZmCOR410基因擬南芥植株的抗逆能力

為檢測(cè)ZmCOR410 的抗逆功能，將其CDS克隆到植物表達(dá)載體pZP212的XbaⅠ和SacⅠ的位點(diǎn)之間，使其受PCaM35S啟動(dòng)子和T-nos終止子調(diào)控，得到植物表達(dá)載體(圖8-A)。將該載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌Gv3101菌株中，通過菌懸液醮花絮法轉(zhuǎn)化擬南芥，經(jīng)篩選獲得了4個(gè)穩(wěn)定遺傳外源基因的株系。在正常生長(zhǎng)條件下，轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)發(fā)育無明顯特異之處。

以4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的植株作為一個(gè)群體，以野生型植株為對(duì)照群體，進(jìn)行脅迫處理，比較2個(gè)群體的抗逆能力。經(jīng)-6 ℃冷凍低溫處理后，轉(zhuǎn)基因和野生型植株葉片均受到凍害；復(fù)蘇培養(yǎng)14 d后，野生型群體中大葉片基本死亡，只有幼葉和芽尖有復(fù)蘇生長(zhǎng)；轉(zhuǎn)基因群體中有的大葉片得以復(fù)蘇，幼葉和芽尖復(fù)蘇得更好，復(fù)蘇相同時(shí)間后有更多的新葉長(zhǎng)出(圖8-B)。對(duì)傷害度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株群體和對(duì)照群體葉片傷害指數(shù)分別為58.33，75.00，前者受到的傷害相對(duì)較輕。在干旱脅迫處理中，植株移栽復(fù)蘇后即停止?jié)菜廖钑r(shí)大部分植株已經(jīng)抽苔，復(fù)水后已經(jīng)伸展的葉片和莖均不能恢復(fù)生長(zhǎng)，僅部分腋芽能再生長(zhǎng)出來，轉(zhuǎn)基因群體和對(duì)照群體植株存活率分別為75.00%，58.33%(圖8-C)。在高溫脅迫處理中，植株經(jīng)60 ℃高溫脅迫處理4 h后，大部分葉片焦枯死亡，少數(shù)植株幼葉和芽尖復(fù)蘇生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因群體和對(duì)照群體存活率分別為26.04%，11.46%，二者差異達(dá)顯著水平(P<0.05)(圖8-D)。結(jié)果說明，ZmCOR410超表達(dá)后增強(qiáng)了擬南芥植株對(duì)冷凍低溫、干旱和高溫脅迫的耐受性，其中對(duì)高溫耐受性的增強(qiáng)效果顯著。

不同小寫字母表示各處理時(shí)間存在顯著差異(P<0.05)。圖9同。 Different lowercase letters indicate that there are significant differences between processing times at 0.05 level.

2.6 轉(zhuǎn)化ZmCOR410基因酵母對(duì)高溫的耐受性

為了進(jìn)一步驗(yàn)證ZmCOR410抗高溫功能，pYES-ZmCOR410(圖9-A)并將其轉(zhuǎn)化到酵母G19菌株中。以轉(zhuǎn)化pYES-Dest52空載體的酵母細(xì)胞為對(duì)照，酵母細(xì)胞懸濁液于50 ℃條件下分別處理25，35，45 min后，載有ZmCOR410基因的細(xì)胞存活率分別為63.22%，51.67%，45.32%，對(duì)照組細(xì)胞的相應(yīng)存活率分別為56.08%，36.99%，33.65%(圖9-B)，說明50 ℃處理25 min以上使2種細(xì)胞的存活率均顯著下降。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，脅迫35 min以上時(shí)轉(zhuǎn)化ZmCOR410的細(xì)胞存活率顯著高于對(duì)照細(xì)胞，說明該基因增強(qiáng)了酵母細(xì)胞耐高溫的能力。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。 Different lowercase indicate significant difference(P<0.05).

A. 重組酵母表達(dá)載體；B. 酵母細(xì)胞存活率。 A.The recombinant yeast-expression vector；B.The survival rate of yeast cells.

3 結(jié)論與討論

基于溝葉結(jié)縷草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，本研究克隆獲得了溝葉結(jié)縷草的一個(gè)低溫脅迫響應(yīng)基因ZmCOR410，編碼的蛋白ZmCOR410為一個(gè)酸性脫水素，在擬南芥和酵母細(xì)胞中表達(dá)后表現(xiàn)出一定的抗凍、抗干旱和抗高溫脅迫功能。

COR410是禾本科植物普遍存在的一個(gè)低溫響應(yīng)基因，最早在小麥[39]中被檢測(cè)到，與大麥中的HvDhn8[40]、水稻的OsDhn1[41]和擬南芥的COR47[42]為同源基因，均屬于LEA 蛋白的第Ⅱ組(也稱為脫水蛋白或LEA D11蛋白)。溝葉結(jié)縷草的ZmCOR410蛋白含有308個(gè)氨基酸，氨基酸平均親水性指數(shù)為-1.277，無跨膜結(jié)構(gòu)，二級(jí)結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主，符合脫水蛋白的典型特征。在禾本科植物COR410同源基因系統(tǒng)進(jìn)化樹中，ZmCOR410與彎葉畫眉草和無芒隱子草同源基因的親緣關(guān)系最近。無芒隱子草是多年生超旱生C4植物，為干旱荒漠草原的建群種和優(yōu)勢(shì)種[43]；彎葉畫眉草多生長(zhǎng)于沙質(zhì)坡地、農(nóng)田、路邊荒地等，耐瘠、耐濕熱、抗干旱，適應(yīng)性很強(qiáng)[44]。推測(cè)這些物種中COR410基因的進(jìn)化具有趨同性，為高溫、干旱生境選擇的結(jié)果。

ZmCOR410基因的表達(dá)調(diào)節(jié)對(duì)4 ℃非常敏感，mRNA水平在誘導(dǎo)6 h后即顯著上升，并在72 h內(nèi)呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)。芹菜(ApiumgraveolensL.)中COR47的轉(zhuǎn)錄在低溫誘導(dǎo)72 h內(nèi)也呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)[45]，大麥HvDhn8的轉(zhuǎn)錄受4 ℃低溫誘導(dǎo)并在第4天后基本穩(wěn)定[40]。小麥COR410基因表達(dá)也受冷馴化誘導(dǎo)，第6天和第7天以后mRNA水平下降，但仍然保持在較高水平[38，46]。ZmCOR410轉(zhuǎn)錄對(duì)更長(zhǎng)時(shí)間的低溫脅迫或自然降溫變化的響應(yīng)有待探究。在擬南芥中COR47為典型的DREB1類轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)子，表達(dá)異源DREB1基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥中COR47的mRNA水平顯著高于野生型[45]；水稻的同源基因OsDhn1[41]、小麥同源基因TaCOR410[47]、大麥的同源基因HvDhn8[48]的表達(dá)也受DREB1誘導(dǎo)。溝葉結(jié)縷草中有多個(gè)DREB1基因，低溫脅迫下表達(dá)量顯著上調(diào)[19]，ZmCOR410基因轉(zhuǎn)錄區(qū)上游有4個(gè)A/GCCGAC基序，推測(cè)低溫下ZmCOR410基因的表達(dá)也受DREB1轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)。

對(duì)小麥的研究結(jié)果表明，COR410蛋白具抗凍功能，冷馴化過程中COR410蛋白表達(dá)量與品種抗凍能力強(qiáng)呈正相關(guān)[46]。將小麥COR410基因轉(zhuǎn)入到草莓中，轉(zhuǎn)基因植株葉片半致死溫度比野生型的降低了5 ℃[49]。與此相似，溝葉結(jié)縷草ZmCOR410基因在擬南芥中超表達(dá)后可以減輕冷凍低溫(-6 ℃)對(duì)葉片的傷害。本研究還發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)ZmCOR410基因的擬南芥植株對(duì)高溫和干旱脅迫的耐受性也有所增強(qiáng)，轉(zhuǎn)化ZmCOR410基因的酵母細(xì)胞在高溫脅迫下的存活率也明顯提高。低溫、高溫和干旱脅迫均會(huì)引起細(xì)胞生理性缺水，COR410作為一種酸性脫水素，主要定位在細(xì)胞膜上，可能通過保護(hù)細(xì)胞膜來增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)脅迫的耐受性[50]。小麥[38]和水稻[41]中的COR410同源基因在干旱脅迫下也大幅度上調(diào)表達(dá)，說明它們?cè)诳垢珊得{迫中的重要性。

綜上所述，ZmCOR410是溝葉結(jié)縷草的一個(gè)酸性脫水素基因，其表達(dá)受低溫大幅度誘導(dǎo)，表達(dá)產(chǎn)物可以增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)冷凍低溫、高溫和干旱脅迫的耐受能力。脅迫環(huán)境下該基因的表達(dá)量與種質(zhì)抗逆能力關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。