趙長(zhǎng)江，都?jí)粝?，宋巨奇，徐尚緣?賀 琳，徐晶宇，楊克軍，李佐同

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北平原農(nóng)業(yè)綠色低碳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 大慶 163319； 3.黑龍江省秸稈資源化利用工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319；4.黑龍江省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)栽培技術(shù) 與作物種質(zhì)改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 大慶 163319)

NRL(NPH3/RPT2-Like)是植物所特有一類的蛋白家族，一般包含3個(gè)典型結(jié)構(gòu)域：N端的BTB結(jié)構(gòu)域、C端的螺旋-螺旋結(jié)構(gòu)域和居中NPH3結(jié)構(gòu)域[1]，所有成員都具有NPH3結(jié)構(gòu)域[2]。其中NPH3(NONPHOTOTROPIC HYPOCOTYL3)和 RPT2(ROOT PHOTOTROPISM2)于1999年首先被報(bào)道參與擬南芥(Arabidopsisthaliana)幼苗對(duì)藍(lán)光的向光性調(diào)節(jié)[3]。陸續(xù)有研究指出，NPH3在基于橫向生長(zhǎng)素梯度產(chǎn)生的向光彎曲及葉片定位和伸展調(diào)控中發(fā)揮決定作用，RPT2作為向光反應(yīng)轉(zhuǎn)換器通過改變NPH3的定位和磷酸化狀態(tài)來調(diào)節(jié)向光反應(yīng)[4-5]。NRL家族成員可與向光素(Phototropin)藍(lán)光受體協(xié)調(diào)實(shí)現(xiàn)對(duì)植物向光性、葉綠體積累運(yùn)動(dòng)、葉片定位和伸展等生物學(xué)功能的調(diào)控[6-7]。根據(jù)NRL家族成員在向光素介導(dǎo)光調(diào)控生理活動(dòng)的參與程度，可將其分為兩類：NRL依賴和NRL獨(dú)立的光信號(hào)途徑[6]。其中，向光性、葉綠體積累、葉柄定位和葉片伸展是NRL依賴的，而葉綠體回避運(yùn)動(dòng)和氣孔開放是NRL獨(dú)立的。上述研究表明，NRL家族蛋白作為向光素受體信號(hào)通路的重要組分，其作用功能應(yīng)該具有多樣性，或是具有明確分工。

通過對(duì)擬南芥NRL家族蛋白功能的研究發(fā)現(xiàn)，該家族成員除參與的藍(lán)光生理調(diào)控外，還在植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控、植物抗病性方面發(fā)揮重要作用[6]。其中，生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控主要涉及花粉萌發(fā)、花粉管生長(zhǎng)[8]、葉脈結(jié)構(gòu)圖案形成[9]以及根重力應(yīng)答[10]等。不同寄主植物中該家族成員免疫表現(xiàn)不同，例如AtNRL31與鈣信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄因子AtSR1(SIGNAL RESPONSIVE1)互作導(dǎo)致其泛素化降解參與寄主防衛(wèi)反應(yīng)調(diào)控，其中nrl31突變體擬南芥對(duì)丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)敏感[11]。同時(shí)，馬鈴薯(Solanumtuberosum)StNRL1作為致病疫霉菌(Phytophthorainfestans)致病效應(yīng)子的靶標(biāo)蛋白，該基因誘導(dǎo)沉默煙草降低了病菌定植及其引起的細(xì)胞死亡，增強(qiáng)了寄主的抗病性[12]。當(dāng)然，NRL基因抗病表現(xiàn)的不同可能與植物或是植物-病原物特異系統(tǒng)不同有關(guān)，或是與借助光反應(yīng)調(diào)節(jié)不同有關(guān)，仍有待深入研究。

目前，NRL基因家族在擬南芥[6]、水稻(Oryzasativa)[13]和番茄(Lycopersiconesculentum)[14]等模式植物中被鑒定出來，但高光效作物玉米NRL基因家族的研究尚未見報(bào)道。玉米(Zeamays)作為世界上種植最多的谷物作物，其籽粒和秸稈都具有良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[15]。對(duì)玉米NRL家族基因研究具有重要的理論和實(shí)踐意義。本研究采用生物信息學(xué)方法在玉米全基因組水平鑒定NRL家族成員并對(duì)其進(jìn)化關(guān)系和組織表達(dá)進(jìn)行分析，同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)其逆境表達(dá)進(jìn)行分析，旨在為揭示玉米NRL基因功能提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用玉米自交系B73為試驗(yàn)材料，用10%次氯酸鈉對(duì)精選的種子消毒30 min，用蒸餾水清洗至無味，然后浸泡6～8 h，將種子放在22 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)24 h催芽，挑選萌發(fā)1.5 cm左右根的種子置于漂浮泡沫板孔洞中，使用1/2 Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)，并在人工氣候室(22 ℃，16 h光/8 h暗)中對(duì)培養(yǎng)至兩葉一心期的玉米幼苗進(jìn)行處理。其中，200 mmol/L NaCl和20% PEG6000通過營養(yǎng)液添加實(shí)現(xiàn)，35 ℃高溫通過光照培養(yǎng)箱調(diào)溫實(shí)現(xiàn)，通過牙簽嵌入法實(shí)現(xiàn)立枯絲核菌AG1-IA(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，鄭愛萍教授惠贈(zèng))接種處理。上述處理均于處理48 h取樣，液氮速凍后存放于-80 ℃冰箱。每個(gè)處理3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 基因家族成員鑒定

從phytozome(https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)中下載玉米fasta和gff3文件，使用TBtools[16]對(duì)fasta和gff3文件分別進(jìn)行轉(zhuǎn)化，生成cds文件和pep文件。使用擬南芥和水稻的NRL家族基因[6，13]與玉米蛋白序列在TBtools上進(jìn)行比對(duì)，用NCBI(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)、SMART[17](http：//smart.embl-heidelberg.de/)以及Pfam[18-19]進(jìn)行結(jié)構(gòu)域的確認(rèn)，去除預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)域長(zhǎng)度小于1/2個(gè)NPH3結(jié)構(gòu)域或 BTB 結(jié)構(gòu)域長(zhǎng)度的基因。

1.3 蛋白相關(guān)分析

利用在線工具ExPASy(https：//web.expasy.org)分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，利用WoLF PSORT(https：//wolfpsort.hgc.jp/)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。分別從Tair(https：//www.arabidopsis.org/)和RGAP(http：//rice.plantbiology.msu.edu/)下載已知擬南芥和水稻的蛋白序列，從phytozome中下載高粱的蛋白序列，從茄科基因組庫(https：//solgenomics.net/)中下載番茄的蛋白序列，用于構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。使用MEGAX軟件[20]最大似然法(Maximum likelihood)建樹，選擇最適模型(JTT+G+I+F)，Bootstrap 設(shè)置為1 000。

使用MEME(https：//meme-suite.org/meme/tools/meme)分析蛋白保守Motif，供試參數(shù)分別為：最大Motif 數(shù)設(shè)置為10，位點(diǎn)分布選擇任何重復(fù)數(shù)分布，最佳Motif寬度設(shè)置為≥6 和≤50，并使用TBtools[16]繪制玉米基因結(jié)構(gòu)和保守基序圖。采用SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/interactive)預(yù)測(cè)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.4 基因相關(guān)分析

利用TBtools[16]繪制基因在染色體上的分布圖，使用MCScanX軟件[21]對(duì)基因復(fù)制事件進(jìn)行分析，使用Circle Gene View繪制出串聯(lián)重復(fù)基因圖，并利用Ka/Ks Calculator 功能計(jì)算基因的 Ka/Ks 值。使用TBtools軟件分析基因內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)，同時(shí)取編碼區(qū)上游2 000 bp的序列作為基因啟動(dòng)子，并提交PlantCARE(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)鑒定順式作用元件，分析統(tǒng)計(jì)順式作用元件類型、數(shù)量和分布。

1.5 全生育期組織表達(dá)譜及共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

從GEO數(shù)據(jù)庫中下載GSE50191轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜數(shù)據(jù)，選取23個(gè)組織部位的表達(dá)數(shù)據(jù)，使用TBtools[16]的HeatMap功能進(jìn)行熱圖繪制。使用OneStep WGCNA工具進(jìn)行加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，對(duì)樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，保留含有8個(gè)及以上樣本且FPKM值>1的基因數(shù)據(jù)，計(jì)算合適的加權(quán)系數(shù)β值，構(gòu)建無尺度網(wǎng)絡(luò)與劃分相關(guān)模塊。使用Pannzer 2(http：//ekhidna2.biocenter.helsinki.fi/sanspanz/)對(duì)玉米基因組進(jìn)行GO注釋，使用TBtools對(duì)關(guān)鍵模塊進(jìn)行GO富集分析，以玉米基因組為參考數(shù)據(jù)庫，并使用Enrichment Bar Plot對(duì)GO富集結(jié)果可視化。

1.6 RNA提取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR

稱取0.1 g玉米葉片，液氮研磨后用TRIzol試劑(Invitrogen)提取總RNA。使用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)使用NanoDrop one(Thermo ScientificTM)測(cè)定RNA濃度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 FSK-101(TOYOBO)對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用Talent qPCR PreMix(SYBR Green)(天根)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。使用β-Actin作為內(nèi)參基因，擴(kuò)增基因引物序列信息見表1，基因引物由Invitrogen公司合成。使用CFX96熒光定量PCR儀(Bio-Rad)進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次，表達(dá)數(shù)據(jù)使用2-ΔΔCt方法[22]進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 qRT-PCR引物序列信息Tab.1 Primers for qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米NRL家族成員鑒定

經(jīng)Pfam和Smart結(jié)構(gòu)域鑒定，在玉米全基因組水平上共鑒定31個(gè)ZmNRL基因(表2)，不均勻地分布在9條染色體上，根據(jù)在染色體上的位置依次命名為ZmNRL1～ZmNRL31。其中，2號(hào)染色體分布最多，有7個(gè)基因。玉米NRL家族基因的CDS序列長(zhǎng)度在1 395～2 250 bp，編碼的氨基酸序列長(zhǎng)度在 464～749個(gè)，蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量在48.64～80.02 ku，理論等電點(diǎn)在4.97～10.04。其中12個(gè)玉米NRL蛋白理論等電點(diǎn)小于7，為酸性蛋白。玉米NRL蛋白被預(yù)測(cè)具有葉綠體、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)等亞細(xì)胞定位。

表2 ZmNRL編碼蛋白序列理化性質(zhì)分析Tab.2 Physiochemical property of ZmNRLs gene and their coding protein

2.2 玉米NRL家族成員進(jìn)化及物種間共線性分析

對(duì)包含玉米在內(nèi)的5個(gè)物種144個(gè)NRL基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析(圖1)，包括擬南芥33個(gè)、番茄27個(gè)、水稻27個(gè)和高粱26個(gè)基因。蛋白進(jìn)化分析可將NRL家族成員劃分為4組(Ⅰ～Ⅳ)，分別有23，29，30，62個(gè)成員。其中Ⅰ組4個(gè)(ZmNRL7、ZmNRL13、ZmNRL25、ZmNRL26)成員，Ⅱ組6個(gè)(ZmNRL4、ZmNRL6、 ZmNRL8、ZmNRL16、ZmNRL18、ZmNRL22)成員，Ⅲ組5個(gè)(ZmNRL1、ZmNRL11、ZmNRL28、ZmNRL30、ZmNRL31)成員，Ⅳ組16個(gè)(ZmNRL10、ZmNRL14、ZmNRL15、ZmNRL20、ZmNRL2、ZmNRL3、ZmNRL5、ZmNRL9、ZmNRL12、ZmNRL17、ZmNRL19、ZmNRL21、ZmNRL23、ZmNRL24、ZmNRL27、ZmNRL29)成員。在各個(gè)組中可以發(fā)現(xiàn)單子葉植物多聚合在同一個(gè)分支，而雙子葉植物常聚合在一起；而且4個(gè)亞組中都同時(shí)包含有單子葉植物和雙子葉植物，推斷在單子葉與雙子葉植物分離之前，就出現(xiàn)了NRL基因的共同祖先。

31個(gè)玉米NRL基因不均勻地分布在其9條染色體上(圖2)。玉米種內(nèi)有4對(duì)片段重復(fù)基因和1對(duì)串聯(lián)重復(fù)基因。4對(duì)重復(fù)基因分別為ZmNRL5—ZmNRL19、ZmNRL9—ZmNRL21、ZmNRL13—ZmNRL25和ZmNRL17—ZmNRL21，而且它們的Ka/Ks值均小于1，說明它們受到純化選擇；串聯(lián)基因?yàn)閆mNRL30—ZmNRL31。玉米與高粱、玉米與擬南芥之間分別存在36，5對(duì)共線性基因，而擬南芥與高粱之間也存在9對(duì)共線性基因。

Ⅰ～Ⅳ代表基因所屬亞族；玉米、高粱和水稻分別用圓形、菱形和正方形來表示；擬南芥和番茄分別用倒三角形和三角形表示。 Ⅰ—Ⅳ represents the gene subgroup；Zea mays，Sorghum bicolor，and Oryza sativa are represented by circles，diamonds， and squares；Arabidopsis thaliana and Lycopersicon esculentum are represented by inverted triangles and triangles.

2.3 玉米NRL基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守基序分析

玉米NRL家族基因結(jié)構(gòu)具有一定的保守性，屬于同一個(gè)進(jìn)化分支的成員大多具有相似的基因結(jié)構(gòu)(圖3-A)。第Ⅰ和Ⅱ組多數(shù)成員(除ZmNRL10和ZmNRL20外)含有4個(gè)外顯子；第Ⅲ和Ⅳ組分別含有2～3和3～5個(gè)外顯子。除處在同一進(jìn)化分支5個(gè)(ZmNRL7、ZmNRL13、ZmNRL14、ZmNRL15和ZmNRL25)成員有保守基序的缺失外，多數(shù)玉米NRL家族成員擁有10個(gè)保守基序(圖3-B)。其中，保守基序4、2、7、9和5組成BTB結(jié)構(gòu)域，而保守基序10、6、8、3、1則對(duì)應(yīng)的是NPH3結(jié)構(gòu)域，并對(duì)所有成員都具有的NPH3結(jié)構(gòu)域的5個(gè)保守基序進(jìn)行展示(圖3-C)。而且，處于同一進(jìn)化分支上的NRL蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)相似。

圖中Chr和chr以及數(shù)字1～5分別表示玉米、高粱和擬南芥的染色體；紅色線條為玉米物種內(nèi)的片段重復(fù)基因?qū)?；灰色線條為玉米和高粱的片段重復(fù)基因?qū)Γ凰{(lán)色線條為玉米和擬南芥物種間的片段重復(fù)基因?qū)?；綠色線條為擬南芥和高粱物種間的片段重復(fù)基因?qū)?；玉米物種內(nèi)的串聯(lián)重復(fù)基因用紅色菱形來標(biāo)識(shí)。

2.4 玉米NRL全生育期表達(dá)分析及共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

玉米NRL基因(ZmNRL10除外)組織表達(dá)模式大致可以分為4類，分別為生育期高表達(dá)、中高表達(dá)、中低表達(dá)和低表達(dá)(圖4)。其中ZmNRL2、ZmNRL4、ZmNRL24和ZmNRL29在多數(shù)組織部位中高表達(dá)。而且多數(shù)基因在葉片生長(zhǎng)、葉片氣孔以及葉片對(duì)稱等組織部位表達(dá)較高，說明玉米NRL基因可能參與葉片的生長(zhǎng)發(fā)育等過程。進(jìn)而，對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育組織部位相關(guān)10個(gè)樣本18 000個(gè)基因用于加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建(圖5)，共得到12個(gè)模塊，其中MEturquoise模塊基因數(shù)目最多，為9 118個(gè)，占總基因數(shù)的1/2以上。

通過質(zhì)量性狀與模塊關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)(圖6)，18個(gè)玉米NRL基因可能參與共表達(dá)調(diào)控，其中MEbrown模塊中的NRL基因數(shù)目多達(dá)6個(gè)，分別為ZmNRL4、ZmNRL6、ZmNRL13、ZmNRL16、ZmNRL23和ZmNRL25，且該模塊與葉片生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性值為0.83。選擇含NRL基因數(shù)目最多且與葉片生長(zhǎng)相關(guān)的關(guān)鍵模塊MEbrown模塊進(jìn)行后續(xù)功能富集分析(圖7)，圖中只顯示富集程度最多的前30個(gè)GO term。主要涉及質(zhì)體生物發(fā)生和組裝(GO：0009657)、葉綠體生物發(fā)生和組裝(GO：0009658)等生物過程，在葉綠體、質(zhì)體等細(xì)胞中發(fā)揮核糖體RNA結(jié)合(GO：0019843)分子功能參與對(duì)葉片生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控。

A中數(shù)字代表內(nèi)含子的數(shù)量，下方比例尺表示基因堿基數(shù)；B下方比例尺表示蛋白長(zhǎng)度，CDS為編碼區(qū)，UTR為非編碼區(qū)。 The number in A represents intron number，and the lower scale represents gene bases the number；the lower scale of B represents the length of the protein，CDS is the coding region，and UTR is the non-coding region.

圖例表示標(biāo)準(zhǔn)化的FPKM值，紅色表示高表達(dá)水平，藍(lán)色表示低表達(dá)水平。 The legend shows the standardized FPKM value， the red shows the high expression level， and the blue shows the low expression level.

2.5 玉米NRL基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

對(duì)玉米NRL基因啟動(dòng)子區(qū)域的上游 2 000 bp的順式作用元件進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，基因啟動(dòng)子主要存在22種已知功能的元件序列，涉及植物激素、脅迫、光響應(yīng)和生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的響應(yīng)元件(圖8-A)。其中茉莉酸甲酯響應(yīng)元件(CGTCA-motif)、脫落酸響應(yīng)元件(ABRE)、光響應(yīng)元件(G-box、Sp1)、抗氧化反應(yīng)元件(ARE)的數(shù)量較多，分別為142，115，112，60，54個(gè)。ZmNRL25啟動(dòng)子元件數(shù)量最多，有41個(gè)，ZmNRL7的元件數(shù)量最少，僅有12個(gè)。結(jié)果表明，該家族基因除參與光調(diào)控外，可能受茉莉酸和脫落酸等激素調(diào)控，甚至與抗氧化等逆境調(diào)控密切相關(guān)。啟動(dòng)子順式作用元件分析，推測(cè)家族基因可能與脫落酸介導(dǎo)的高溫、鹽和干旱等非生物脅迫以及茉莉酸介導(dǎo)的立枯絲核菌接種的生物脅迫密切相關(guān)。

2.6 玉米NRL基因逆境表達(dá)分析

權(quán)衡系統(tǒng)進(jìn)化、組織表達(dá)和作用元件情況，選定同為第Ⅳ組組織中低表達(dá)的ZmNRL5和ZmNRL12，以及與ZmNRL5重復(fù)的組織中高表達(dá)ZmNRL19和第Ⅰ組中ZmNRL7(元件數(shù)量最少和組織中高表達(dá))

圖5 WGCNA聚類樹狀圖Fig.5 WGCNA clustering dendrogram

圖6 WGCNA模塊-特征關(guān)系圖Fig.6 WGCNA module-feature relationship diagram

圖7 MEbrown模塊GO富集分析Fig.7 GO enrichment analysis of the MEbrown module

等4個(gè)代表基因進(jìn)行逆境表達(dá)分析(圖8-B)。供試4個(gè)基因中，高溫處理下ZmNRL5、ZmNRL12和ZmNRL19上調(diào)表達(dá)， 同時(shí)ZmNRL12在鹽脅迫下也表現(xiàn)出上調(diào)趨勢(shì)。其余供試基因在鹽、干旱和立枯絲核菌接種均表現(xiàn)為下調(diào)。其中，干旱脅迫下供試基因全部下調(diào)表達(dá)，鹽脅迫下ZmNRL5、ZmNRL7和ZmNRL19下調(diào)表達(dá)，立枯絲核菌接種的生物脅迫下ZmNRL5、ZmNRL12和ZmNRL19下調(diào)近5倍，可能與病原物對(duì)葉片光合或葉綠體影響比較大有關(guān)。

A為順式作用元件分布圖；B為4種脅迫(高溫、NaCl、PEG干旱、AG1-IA立枯絲核菌)下基因表達(dá)譜。 圖中小寫字母表示基因在0.05水平差異顯著。 A is the distribution map of cis-acting elements；B is the gene expression profile under 4 stresses(high temperature， NaCl，PEG drought， Rhizoctonia solani AG1-IA).Lowercase letters present the significant difference at 0.05 level.

3 結(jié)論與討論

本研究通過生物信息學(xué)手段結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，在玉米基因組水平鑒定出31個(gè)NRL基因，研究表明，該家族基因不僅具有明顯的組織表達(dá)特異性，而且可參與生物和非生物逆境應(yīng)答。本研究中，玉米NRL家族基因數(shù)介于擬南芥(33個(gè))[6]和水稻(27個(gè))[13]之間，三者數(shù)量較為接近，表明玉米NRL家族基因相比于前二者沒有發(fā)生較大的擴(kuò)增。而且，種間基因共線性分析發(fā)現(xiàn)，玉米與高粱和擬南芥之間分別存在36，5對(duì)共線性關(guān)系基因，說明同為C4作物的玉米與高粱之間的關(guān)系比擬南芥更近?；驈?fù)制是進(jìn)化的驅(qū)動(dòng)力之一，染色體片段復(fù)制和串聯(lián)復(fù)制事件可以擴(kuò)大基因組中基因家族成員的數(shù)量，這些復(fù)制促進(jìn)了新基因的形成和功能分化[23-24]。在共線性分析中，玉米種內(nèi)NRL家族基因存在4對(duì)片段重復(fù)基因，復(fù)制基因?qū)χg受到純化選擇，表明復(fù)制是早期發(fā)生的事件。其中，ZmNRL5和ZmNRL19這對(duì)片段重復(fù)基因在蛋白進(jìn)化中二者為同一分支，它們的基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守結(jié)構(gòu)基本相同，但是它們的生育期組織表達(dá)模式不盡相同，可能與復(fù)制時(shí)的片段位置有關(guān)，因?yàn)樗鼈兊膯?dòng)子區(qū)順式作用元件也不同，或是與亞細(xì)胞定位不同有關(guān)；同時(shí)這對(duì)基因在供試的逆境表達(dá)分析中，其表達(dá)模式基本一致，啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件無法解釋這種情況。推測(cè)該類基因在生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控中進(jìn)化基本成熟，逆境應(yīng)答仍處在早期未分化階段；或是基因啟動(dòng)子順式作用元件對(duì)基因表達(dá)模式?jīng)Q定分析超出筆者的分析范疇，當(dāng)然不能排除一對(duì)基因樣本量小代表性不好的原因。

盡管玉米NRL家族基因生育期表達(dá)模式類型不同，但是多數(shù)基因在葉片生長(zhǎng)、葉片氣孔以及葉片對(duì)稱等組織部位表達(dá)較高，說明玉米NRL家族基因可能參與葉片的生長(zhǎng)發(fā)育等過程。例如ZmNRL2、ZmNRL4、ZmNRL24和ZmNRL29為多數(shù)組織部位中高表達(dá)的一類，可能與它們(ZmNRL2、ZmNRL24和ZmNRL29)處于同一個(gè)進(jìn)化分支有關(guān)。這4個(gè)基因預(yù)測(cè)為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核定位，而不是葉綠體定位。同時(shí)，基于生育期組織共表達(dá)數(shù)據(jù)及性狀模塊功能基因富集分析發(fā)現(xiàn)，玉米NRL家族基因參與的葉片生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控主要涉及質(zhì)體和葉綠體生物發(fā)生和組裝等生物學(xué)過程。推測(cè)可能與調(diào)控葉綠體積累、葉柄定位和葉片伸展功能的NRL依賴光信號(hào)途徑密切相關(guān)[6]。

通過對(duì)玉米NRL家族基因啟動(dòng)子順式作用元件進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，光響應(yīng)元件、茉莉酸和脫落酸反應(yīng)元件數(shù)量較多，推測(cè)該家族基因除參與光調(diào)控外，可能受茉莉酸和脫落酸等激素調(diào)控，或是參與兩類激素相關(guān)的生物和非生物逆境調(diào)控。啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件的類型、數(shù)量及分布基因表達(dá)產(chǎn)生不同的調(diào)節(jié)作用[25]。進(jìn)而通過qRT-PCR分析ZmNRL5、ZmNRL7、ZmNRL12和ZmNRL19等4個(gè)基因在不同逆境下的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)高溫處理下僅有1個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，除ZmNRL12外，鹽、干旱和立枯絲核菌接種每個(gè)處理均引起供試3個(gè)基因的下調(diào)表達(dá)，可能與這3種逆境對(duì)葉片光合作用或葉綠體影響比較大有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)的玉米NRL基因參與對(duì)死體營養(yǎng)型病原物的防衛(wèi)反應(yīng)，與擬南芥[11]和馬鈴薯[12]中的研究結(jié)果一致，表明NRL基因不僅可參與對(duì)不同病原物的廣譜抗性反應(yīng)，而且參與對(duì)不同逆境的廣譜抗/耐性調(diào)節(jié)。