王鳳艷，王翔宇，賀小云，劉秋月，馬琳，儲明星，狄冉

（中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農業(yè)農村部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193）

作為一種重要的家養(yǎng)動物，綿羊為人類提供了優(yōu)質肉、毛、皮、奶等必需品，在畜牧業(yè)發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。然而，目前我國綿羊產業(yè)存在發(fā)展不平衡、生產效率低下的問題，因此，提高綿羊的繁殖效率和肉用生產性能勢在必行。綿羊產羔數(shù)作為一個低遺傳力性狀，受到遺傳和環(huán)境等多種因素的共同控制，其中遺傳因素尤其重要。利用傳統(tǒng)的育種技術提高綿羊的繁殖效率不僅耗時長，效果也不明顯，而通過標記輔助選擇可以加快遺傳進展。目前，鑒定到的綿羊多羔主效基因包括和等，其中基因是中國綿羊多羔主效基因，和是歐洲綿羊多羔主效基因。

本團隊前期對國內單羔綿羊品種和多羔綿羊品種進行了全基因組重測序，篩選到了與產羔數(shù)相關的候選基因——基因（JAZF Zinc Finger 1）及其多態(tài)位點（Oar_v3.1 中4 號染色體68263669 bp 位點），該位點的值為0.63?；蚴且环N新型的轉錄輔助因子，具有抑制乳頭狀甲狀腺癌細胞增殖、促進細胞凋亡、調節(jié)糖脂代謝、促進心肌微血管內皮細胞增殖和血管生成的作用，對脂肪細胞內脂肪素的表達也有一定的調節(jié)作用。研究表明，敲除會使人類精原干細胞周圍蛋白A2 的合成減少，這對男性不育癥的分子治療提供了新的見解。此外，研究發(fā)現(xiàn)，基因對牛的產奶量、繁殖、體型、毛色等性狀產生一定的影響。但目前未見基因與綿羊多羔性狀有關的報道。

小尾寒羊具有性早熟、常年發(fā)情、多羔等優(yōu)異繁殖性狀，其適應性強，常被用來作為母本雜交改良其他品種。之前研究報道，與野生型相比，攜帶突變的小尾寒羊產羔數(shù)隨突變拷貝數(shù)的增加而增加。然而，在小尾寒羊群體中發(fā)現(xiàn)不攜帶突變的個體仍然有產多羔的現(xiàn)象，這說明在小尾寒羊中很可能存在其他多羔主效基因或突變，進一步挖掘其他的多羔基因及其突變，分析基因間的協(xié)同效應，將有助于發(fā)現(xiàn)新的分子標記。本研究首先分析了基因和基因在小尾寒羊中的多態(tài)性以及對小尾寒羊產羔數(shù)的影響，接著分析了上述2 個基因對小尾寒羊多羔的協(xié)同效應，以期為綿羊多羔性狀的遺傳標記開發(fā)提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 于山東省鄆城縣誠聯(lián)小尾寒羊種羊場選擇飼養(yǎng)管理條件一致、3 歲、健康、經(jīng)產的小尾寒羊母羊362 只進行實驗。

1.2 樣品的采集與DNA 的提取 對362 只小尾寒羊頸靜脈采血3 mL，采集后的血液樣品用EDTA 進行抗凝處理，并于-20℃冰箱儲存。使用天根血液基因組提取試劑盒（天根生物科技有限公司，北京）進行血液DNA 的提取，對提取的DNA 樣品用Nano Drop 2000進行濃度檢測，1.5% 瓊脂糖凝膠電泳進行質量評估，選擇合格的樣品進行后續(xù)的實驗分析。

1.3 基因分型 采用Sequenom MassARRAYSNP 分型技術對綿羊4 號染色體基因68263669 bp（Oar_v3.1）位點進行分型。PCR 擴增及延伸引物序列如表1所示，所有引物由蘇州泓迅生物科技有限公司合成。采用TaqMan 探針分型技術對綿羊6 號染色體位點分型，探針及引物序列如表2 所示。熒光定量反應體系為：ddHO 1.1 μL，2×Master Mix 3.0 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.3 μL，2 種探針引物（10 μmol/L）各0.15 μL。熒光定量PCR 反應條件為：95℃10 min（孵育），95℃30 s（解鏈），60℃1 min（延長），共40個循環(huán)。

表1 Sequenom MassARRAY?SNP 分型引物序列信息

表2 FecB-TaqMan 探針及引物序列信息

1.4 數(shù)據(jù)分析 使用Microsoft Excel 2019 軟件計算小尾寒羊基因68263669 bp（Oar_v3.1）位點和突變位點的基因型頻率、等位基因頻率、雜合度（He）、多態(tài)信息含量（PIC）、有效等位基因數(shù)量（Ne）等參數(shù)，并用卡方檢驗檢測這2 個位點在該群體中的Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)。>0.05 時認為處于Hardy-Weinberg 平衡。采用最小二乘法分析基因68263669 bp 位點和突變位點的基因型與產羔數(shù)的關聯(lián)性，其線性模型為y=+G+G+GG+e。該模型中y 代表產羔數(shù)的表型值；表示群體均值；G表示基因68263669 bp 位點的基因型效應；G表示突變位點的基因型效應；GG代表基因68263669 bp 位點和突變位點之間的協(xié)同效應；e表示隨機誤差。數(shù)據(jù)分析由SPSS 20.0 完成，所有結果用“平均值±標準誤”表示。

2 結果與分析

2.1 小尾寒羊基因g.68263669G>A 位點多態(tài)性分析 通過基因分型發(fā)現(xiàn)，基因g.68263669G>A位點在小尾寒羊群體中存在3 種基因型：AA 型（165只）、AG 型（191 只）和GG 型（6 只），如圖1 所示。對小尾寒羊進行群體遺傳學分析，結果如表3 所示：基因g.68263669G>A 位點和突變位點均為中度多態(tài)（0.250.05），但是基因g.68263669G>A 位點處于不平衡狀態(tài)（<0.05）。

表3 小尾寒羊JAZF1 基因g.68263669G>A 位點和FecB 突變位點的群體遺傳分析

圖1 小尾寒羊JAZF1 基因g.68263669G>A 位點分型結果

2.2基因g.68263669G>A 位點和突變位點與小尾寒羊產羔數(shù)的關聯(lián)分析 由表4 可知，對于g.68263669G>A 位點，GG 型個體產羔數(shù)顯著高于AA型和AG 型個體。對于突變位點，產羔數(shù)隨突變拷貝數(shù)的增加而顯著增加。

表4 JAZF1 基因g.68263669G>A 位點和FecB 位點不同基因型小尾寒羊產羔數(shù)的最小二乘均值及標準誤

2.3基因g.68263669G>A 位點與突變對小尾寒羊產羔數(shù)的協(xié)同效應分析 由表5 可知，同時攜帶和g.68263669G>A 純合突變的小尾寒羊母羊（GGGG 型）產羔數(shù)顯著高于單獨攜帶任一突變的母羊產羔數(shù)。

表5 g.68263669G>A 與FecB 位點對小尾寒羊產羔數(shù)的協(xié)同效應

3 討 論

JAZF1 是一種鋅指蛋白，是細胞中代謝應激的主要介質，能增加細胞對凋亡的敏感性。是孤兒核受體TAK1 的共阻遏物，而大多數(shù)孤兒核受體家族成員參與脂質代謝的調節(jié)，因此，可能與糖脂代謝和脂代謝密切相關。目前對基因的研究主要集中在癌癥、糖尿病等疾病上。與（PHD Finger Protein 1）基因的融合還與子宮內膜間質肉瘤的發(fā)生有關，子宮內膜間質肉瘤導致雌激素和孕激素受體陽性率較高，對女性生殖有一定的影響?；蚓幋a包含3 個假定的鋅指基序的27 kd 核蛋白，其在肝臟、脂肪和睪丸等組織中廣泛表達。Ma 等研究表明基因可作為與性腺發(fā)育相關的差異表達的miRNA 和lncRNA 的靶基因。Fu 等研究表明基因沉默會抑制人類精原干細胞（SSC）增殖和DNA 合成，并促進SSC 的凋亡，該基因的敲低導致人類SSC 中細胞周期蛋白A2 的減少，因此對治療男性不育癥具有重要意義。上述研究表明該基因對動物的繁殖具有一定的調控作用。而基因在綿羊繁殖方面的研究鮮有報道。

本文對基因多態(tài)性及其與產羔數(shù)的關聯(lián)進行研究，發(fā)現(xiàn)基因g.68263669G>A 位點與小尾寒羊產羔數(shù)顯著相關，該突變可以顯著提高小尾寒羊的產羔數(shù)（<0.05），是一個有利突變，暗示該突變可能參與了綿羊的繁殖調控，但其具體的作用機制還有待于進一步研究。

突變可引起B(yǎng)MPR1B 信號減弱，導致FSHR和LHR 分泌增加，提高對FSH 和LH 的敏感性，減少顆粒細胞凋亡以增加綿羊排卵率，從而提高綿羊的產羔數(shù)。突變顯著增加了小尾寒羊和湖羊的產羔數(shù)，是導致這2 個品種多羔的關鍵基因。本研究中產羔數(shù)隨突變拷貝數(shù)的增加而顯著增加的結果與上述發(fā)現(xiàn)一致。另外，對同時攜帶和g.68263669G>A突變母羊的產羔數(shù)分析發(fā)現(xiàn)同時攜帶2 個突變的小尾寒羊母羊產羔數(shù)顯著高于單獨攜帶任一突變的母羊產羔數(shù)，表明和g.68263669G>A 突變對小尾寒羊產羔數(shù)存在一定的協(xié)同效應。之前Chu 等研究結果表明，同時攜帶和突變的小尾寒羊母羊產羔數(shù)要顯著高于攜帶一個突變的個體。Hanrahan 等研究發(fā)現(xiàn)同時攜帶和突變的母羊具有更高的排卵率。另外，同時攜帶、以及基因突變的母羊排卵率較高，并且這些基因對排卵數(shù)也顯示出協(xié)同作用。

4 結 論

綿羊基因g.68263669G>A 位點可能是提高綿羊產羔數(shù)的潛在的有效標記。該位點和突變對產羔數(shù)有一定的協(xié)同效應。