王鳳艷，王翔宇，賀小云，劉秋月，馬琳，儲(chǔ)明星，狄冉

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

作為一種重要的家養(yǎng)動(dòng)物，綿羊?yàn)槿祟愄峁┝藘?yōu)質(zhì)肉、毛、皮、奶等必需品，在畜牧業(yè)發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。然而，目前我國(guó)綿羊產(chǎn)業(yè)存在發(fā)展不平衡、生產(chǎn)效率低下的問(wèn)題，因此，提高綿羊的繁殖效率和肉用生產(chǎn)性能勢(shì)在必行。綿羊產(chǎn)羔數(shù)作為一個(gè)低遺傳力性狀，受到遺傳和環(huán)境等多種因素的共同控制，其中遺傳因素尤其重要。利用傳統(tǒng)的育種技術(shù)提高綿羊的繁殖效率不僅耗時(shí)長(zhǎng)，效果也不明顯，而通過(guò)標(biāo)記輔助選擇可以加快遺傳進(jìn)展。目前，鑒定到的綿羊多羔主效基因包括和等，其中基因是中國(guó)綿羊多羔主效基因，和是歐洲綿羊多羔主效基因。

本團(tuán)隊(duì)前期對(duì)國(guó)內(nèi)單羔綿羊品種和多羔綿羊品種進(jìn)行了全基因組重測(cè)序，篩選到了與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的候選基因——基因（JAZF Zinc Finger 1）及其多態(tài)位點(diǎn)（Oar_v3.1 中4 號(hào)染色體68263669 bp 位點(diǎn)），該位點(diǎn)的值為0.63?；蚴且环N新型的轉(zhuǎn)錄輔助因子，具有抑制乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)糖脂代謝、促進(jìn)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成的作用，對(duì)脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪素的表達(dá)也有一定的調(diào)節(jié)作用。研究表明，敲除會(huì)使人類精原干細(xì)胞周圍蛋白A2 的合成減少，這對(duì)男性不育癥的分子治療提供了新的見(jiàn)解。此外，研究發(fā)現(xiàn)，基因?qū)ε５漠a(chǎn)奶量、繁殖、體型、毛色等性狀產(chǎn)生一定的影響。但目前未見(jiàn)基因與綿羊多羔性狀有關(guān)的報(bào)道。

小尾寒羊具有性早熟、常年發(fā)情、多羔等優(yōu)異繁殖性狀，其適應(yīng)性強(qiáng)，常被用來(lái)作為母本雜交改良其他品種。之前研究報(bào)道，與野生型相比，攜帶突變的小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)隨突變拷貝數(shù)的增加而增加。然而，在小尾寒羊群體中發(fā)現(xiàn)不攜帶突變的個(gè)體仍然有產(chǎn)多羔的現(xiàn)象，這說(shuō)明在小尾寒羊中很可能存在其他多羔主效基因或突變，進(jìn)一步挖掘其他的多羔基因及其突變，分析基因間的協(xié)同效應(yīng)，將有助于發(fā)現(xiàn)新的分子標(biāo)記。本研究首先分析了基因和基因在小尾寒羊中的多態(tài)性以及對(duì)小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的影響，接著分析了上述2 個(gè)基因?qū)π∥埠蚨喔岬膮f(xié)同效應(yīng)，以期為綿羊多羔性狀的遺傳標(biāo)記開(kāi)發(fā)提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 于山東省鄆城縣誠(chéng)聯(lián)小尾寒羊種羊場(chǎng)選擇飼養(yǎng)管理?xiàng)l件一致、3 歲、健康、經(jīng)產(chǎn)的小尾寒羊母羊362 只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 樣品的采集與DNA 的提取 對(duì)362 只小尾寒羊頸靜脈采血3 mL，采集后的血液樣品用EDTA 進(jìn)行抗凝處理，并于-20℃冰箱儲(chǔ)存。使用天根血液基因組提取試劑盒（天根生物科技有限公司，北京）進(jìn)行血液DNA 的提取，對(duì)提取的DNA 樣品用Nano Drop 2000進(jìn)行濃度檢測(cè)，1.5% 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，選擇合格的樣品進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)分析。

1.3 基因分型 采用Sequenom MassARRAYSNP 分型技術(shù)對(duì)綿羊4 號(hào)染色體基因68263669 bp（Oar_v3.1）位點(diǎn)進(jìn)行分型。PCR 擴(kuò)增及延伸引物序列如表1所示，所有引物由蘇州泓迅生物科技有限公司合成。采用TaqMan 探針?lè)中图夹g(shù)對(duì)綿羊6 號(hào)染色體位點(diǎn)分型，探針及引物序列如表2 所示。熒光定量反應(yīng)體系為：ddHO 1.1 μL，2×Master Mix 3.0 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.3 μL，2 種探針引物（10 μmol/L）各0.15 μL。熒光定量PCR 反應(yīng)條件為：95℃10 min（孵育），95℃30 s（解鏈），60℃1 min（延長(zhǎng)），共40個(gè)循環(huán)。

表1 Sequenom MassARRAY?SNP 分型引物序列信息

表2 FecB-TaqMan 探針及引物序列信息

1.4 數(shù)據(jù)分析 使用Microsoft Excel 2019 軟件計(jì)算小尾寒羊基因68263669 bp（Oar_v3.1）位點(diǎn)和突變位點(diǎn)的基因型頻率、等位基因頻率、雜合度（He）、多態(tài)信息含量（PIC）、有效等位基因數(shù)量（Ne）等參數(shù)，并用卡方檢驗(yàn)檢測(cè)這2 個(gè)位點(diǎn)在該群體中的Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)。>0.05 時(shí)認(rèn)為處于Hardy-Weinberg 平衡。采用最小二乘法分析基因68263669 bp 位點(diǎn)和突變位點(diǎn)的基因型與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)性，其線性模型為y=+G+G+GG+e。該模型中y 代表產(chǎn)羔數(shù)的表型值；表示群體均值；G表示基因68263669 bp 位點(diǎn)的基因型效應(yīng)；G表示突變位點(diǎn)的基因型效應(yīng)；GG代表基因68263669 bp 位點(diǎn)和突變位點(diǎn)之間的協(xié)同效應(yīng)；e表示隨機(jī)誤差。數(shù)據(jù)分析由SPSS 20.0 完成，所有結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 小尾寒羊基因g.68263669G>A 位點(diǎn)多態(tài)性分析 通過(guò)基因分型發(fā)現(xiàn)，基因g.68263669G>A位點(diǎn)在小尾寒羊群體中存在3 種基因型：AA 型（165只）、AG 型（191 只）和GG 型（6 只），如圖1 所示。對(duì)小尾寒羊進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析，結(jié)果如表3 所示：基因g.68263669G>A 位點(diǎn)和突變位點(diǎn)均為中度多態(tài)（0.250.05），但是基因g.68263669G>A 位點(diǎn)處于不平衡狀態(tài)（<0.05）。

表3 小尾寒羊JAZF1 基因g.68263669G>A 位點(diǎn)和FecB 突變位點(diǎn)的群體遺傳分析

圖1 小尾寒羊JAZF1 基因g.68263669G>A 位點(diǎn)分型結(jié)果

2.2基因g.68263669G>A 位點(diǎn)和突變位點(diǎn)與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析 由表4 可知，對(duì)于g.68263669G>A 位點(diǎn)，GG 型個(gè)體產(chǎn)羔數(shù)顯著高于AA型和AG 型個(gè)體。對(duì)于突變位點(diǎn)，產(chǎn)羔數(shù)隨突變拷貝數(shù)的增加而顯著增加。

表4 JAZF1 基因g.68263669G>A 位點(diǎn)和FecB 位點(diǎn)不同基因型小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘均值及標(biāo)準(zhǔn)誤

2.3基因g.68263669G>A 位點(diǎn)與突變對(duì)小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的協(xié)同效應(yīng)分析 由表5 可知，同時(shí)攜帶和g.68263669G>A 純合突變的小尾寒羊母羊（GGGG 型）產(chǎn)羔數(shù)顯著高于單獨(dú)攜帶任一突變的母羊產(chǎn)羔數(shù)。

表5 g.68263669G>A 與FecB 位點(diǎn)對(duì)小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的協(xié)同效應(yīng)

3 討 論

JAZF1 是一種鋅指蛋白，是細(xì)胞中代謝應(yīng)激的主要介質(zhì)，能增加細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性。是孤兒核受體TAK1 的共阻遏物，而大多數(shù)孤兒核受體家族成員參與脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)，因此，可能與糖脂代謝和脂代謝密切相關(guān)。目前對(duì)基因的研究主要集中在癌癥、糖尿病等疾病上。與（PHD Finger Protein 1）基因的融合還與子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤的發(fā)生有關(guān)，子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤導(dǎo)致雌激素和孕激素受體陽(yáng)性率較高，對(duì)女性生殖有一定的影響?；蚓幋a包含3 個(gè)假定的鋅指基序的27 kd 核蛋白，其在肝臟、脂肪和睪丸等組織中廣泛表達(dá)。Ma 等研究表明基因可作為與性腺發(fā)育相關(guān)的差異表達(dá)的miRNA 和lncRNA 的靶基因。Fu 等研究表明基因沉默會(huì)抑制人類精原干細(xì)胞（SSC）增殖和DNA 合成，并促進(jìn)SSC 的凋亡，該基因的敲低導(dǎo)致人類SSC 中細(xì)胞周期蛋白A2 的減少，因此對(duì)治療男性不育癥具有重要意義。上述研究表明該基因?qū)?dòng)物的繁殖具有一定的調(diào)控作用。而基因在綿羊繁殖方面的研究鮮有報(bào)道。

本文對(duì)基因多態(tài)性及其與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)基因g.68263669G>A 位點(diǎn)與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān)，該突變可以顯著提高小尾寒羊的產(chǎn)羔數(shù)（<0.05），是一個(gè)有利突變，暗示該突變可能參與了綿羊的繁殖調(diào)控，但其具體的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

突變可引起B(yǎng)MPR1B 信號(hào)減弱，導(dǎo)致FSHR和LHR 分泌增加，提高對(duì)FSH 和LH 的敏感性，減少顆粒細(xì)胞凋亡以增加綿羊排卵率，從而提高綿羊的產(chǎn)羔數(shù)。突變顯著增加了小尾寒羊和湖羊的產(chǎn)羔數(shù)，是導(dǎo)致這2 個(gè)品種多羔的關(guān)鍵基因。本研究中產(chǎn)羔數(shù)隨突變拷貝數(shù)的增加而顯著增加的結(jié)果與上述發(fā)現(xiàn)一致。另外，對(duì)同時(shí)攜帶和g.68263669G>A突變母羊的產(chǎn)羔數(shù)分析發(fā)現(xiàn)同時(shí)攜帶2 個(gè)突變的小尾寒羊母羊產(chǎn)羔數(shù)顯著高于單獨(dú)攜帶任一突變的母羊產(chǎn)羔數(shù)，表明和g.68263669G>A 突變對(duì)小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)存在一定的協(xié)同效應(yīng)。之前Chu 等研究結(jié)果表明，同時(shí)攜帶和突變的小尾寒羊母羊產(chǎn)羔數(shù)要顯著高于攜帶一個(gè)突變的個(gè)體。Hanrahan 等研究發(fā)現(xiàn)同時(shí)攜帶和突變的母羊具有更高的排卵率。另外，同時(shí)攜帶、以及基因突變的母羊排卵率較高，并且這些基因?qū)ε怕褦?shù)也顯示出協(xié)同作用。

4 結(jié) 論

綿羊基因g.68263669G>A 位點(diǎn)可能是提高綿羊產(chǎn)羔數(shù)的潛在的有效標(biāo)記。該位點(diǎn)和突變對(duì)產(chǎn)羔數(shù)有一定的協(xié)同效應(yīng)。