阮 涌，陳祥，田貴剛，安冬偉，鄒啟順

（1.貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550025；2.貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550025；3.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025；4.銅仁市萬(wàn)山區(qū)動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，貴州銅仁 554200；5.務(wù)川自治縣宏牧羊業(yè)有限公司，貴州務(wù)川 564300）

繁殖性狀是衡量家畜生產(chǎn)性能的重要指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分子標(biāo)記技術(shù)篩選優(yōu)勢(shì)基因型，從而加快育種速度。脂肪酸結(jié)合蛋白5（Fatty Acid Binding Protein 5，）是脂肪酸蛋白基因家族中的重要成員之一，基因的敲低將導(dǎo)致細(xì)胞甘油三酯積累，膽固醇水平降低，ApoB100 蛋白和脂蛋白樣顆粒分泌減少。在基因敲除小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，該基因的缺失將導(dǎo)致皮脂腺萎縮，皮脂體積增加和成分改變。在家畜研究領(lǐng)域中，發(fā)現(xiàn)該基因在犏牛睪丸中的表達(dá)量極顯著大于牦牛，提示雄性不育犏牛睪丸組織在脂肪酸氧化供能水平上高于成年牦牛，在綿羊脂肪組織中的表達(dá)量顯著高于其他組織且差異顯著（<0.05）。在人類腫瘤研究領(lǐng)域，發(fā)現(xiàn)該基因與口腔鱗狀細(xì)胞癌、膠質(zhì)細(xì)胞瘤、前列腺癌、肝癌、宮頸癌等多種癌癥密切相關(guān)。

盡管基因在家畜脂肪沉積、人類癌癥等方面研究較多，但尚未見與山羊繁殖性狀相關(guān)的探索。F代波雜山羊是以F代波雜山羊（87.5%貴州白山羊血緣）為母本、以波爾山羊?yàn)楦副倦s交形成的后代，本實(shí)驗(yàn)以F代波雜山羊?yàn)檠芯繉?duì)象，通過(guò)血液采集、DNA 提取、PCR 擴(kuò)增和測(cè)序等方法獲得基因的多態(tài)性位點(diǎn)，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件與F代波雜山羊繁殖性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，從而篩選優(yōu)異基因，為基因在山羊分子育種等方面的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 選取務(wù)川自治縣宏牧羊業(yè)有限公司統(tǒng)一飼養(yǎng)條件下具有產(chǎn)羔記錄、初生窩重和斷奶窩重的107只F代波雜山羊，經(jīng)頸靜脈采血5 mL 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 DNA 提取 采用OMEGA（Blood DNA Mini Kit）試劑盒提取血液DNA，采用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA 濃度和純度，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量。

1.3 引物設(shè)計(jì)及PCR 擴(kuò)增 根據(jù)NCBI 中公布的山羊基因（NC-030821.1）序列，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物（表1）。PCR 反應(yīng)體系（30 μL）：2×Taq PCR StarMix 15 μL、上下游引物各1.5 μL（10 mmol/L）、DNA 模板1.5 μL（10 ng）、ddHO 10.5 μL。PCR 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性10 s，55～65℃退火20 s，72℃延伸30 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4℃保存。

表1 FABP5 基因擴(kuò)增引物及相關(guān)信息

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 運(yùn)用Excel 計(jì)算不同基因型的基因頻率、基因型頻率、遺傳純合度（Ho）、雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）、多態(tài)信息含量（PIC），卡方（）檢驗(yàn)分析基因型是否處于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)。利用SPSS 軟件中單因素ANOVA 檢驗(yàn)對(duì)不同基因型的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 PCR 產(chǎn)物電泳圖 利用表1 合成引物與DNA 混池進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并將產(chǎn)物放至1.0% 瓊脂糖凝膠電泳45 min，送至北京擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序（圖1）。

圖1 FABP5 基因PCR 擴(kuò)增電泳結(jié)果

2.2 測(cè)序結(jié)果分析 使用DNAStar 軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)FABP5-1 區(qū)域509 位置存在A-C 突變位點(diǎn)；FABP5-2，3 區(qū)域3831、4422、4428 位置分別存在G-A、A-C、A-C 突變位點(diǎn)，通過(guò)比對(duì)NCBI 中序列發(fā)現(xiàn)509位置突變屬于內(nèi)含子突變，3831、4422、4428 位置屬于外顯子突變（圖2）。

圖2 FABP5 基因突變位點(diǎn)

2.3基因SNPs 基因型頻率分析 由表2 可知，A509C 突變位點(diǎn)中優(yōu)勢(shì)基因型為AC 型，等位基因頻率中A>C；G3831A 突變位點(diǎn)中優(yōu)勢(shì)基因型為GA 型，等位基因頻率中A>G；A4422C 突變位點(diǎn)中優(yōu)勢(shì)基因型為AC 型，等位基因頻率中C>A；A4428C 突變位點(diǎn)中AA 型為優(yōu)勢(shì)基因型，等位基因頻率中A>C。檢驗(yàn)表明，A509C、G3831A、A4422C 和A4428C 突變位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)（>0.05）?；虻耐蛔兾稽c(diǎn)中純合度（Ho）高于或等于雜合度（He），其中多態(tài)信息含量（PIC）均處于中度多態(tài)水平。

表2 FABP5 基因SNPs 突變位點(diǎn)群體遺傳信息

2.4基因SNPs 與繁殖性狀關(guān)聯(lián)性分析 由表3可知，A509C、A4422C 和A4428C 位點(diǎn)在產(chǎn)羔數(shù)上無(wú)顯著差異，G3831A 位點(diǎn)在產(chǎn)羔數(shù)上存在顯著差異，且優(yōu)勢(shì)基因型為AA 型。A509C、G3831A、A4422C 和A4428C 位點(diǎn)在出生窩重和斷奶窩重上無(wú)顯著差異。

表3 FABP5 與F3 代波雜山羊繁殖性能的影響（平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤）

3 討 論

1992 年，Madsen 等首次在牛皮癬表皮中發(fā)現(xiàn)FABP5 蛋白，并確認(rèn)其與牛皮癬相關(guān)。1997 年，Masouyé 等研究發(fā)現(xiàn)基因可在胎盤、心臟、骨骼肌、小腸、肺和腎髓質(zhì)的微血管系統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)。Fang 等在口腔癌細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)上調(diào)基因表達(dá)而增加細(xì)胞增殖和侵襲。Zhang 等研究發(fā)現(xiàn)FABP5 蛋白介導(dǎo)的IFN-信號(hào)傳導(dǎo)可以進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤效應(yīng)細(xì)胞，特別是自然殺傷細(xì)胞向腫瘤基質(zhì)的募集，以發(fā)揮抗腫瘤活性。此外，與乳腺腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)，抑制劑作為新型抗癌靶向藥物已引起關(guān)注。在畜禽研究領(lǐng)域，王卓對(duì)基因與秦川牛部分肉用性狀相關(guān)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該基因突變位點(diǎn)與肉質(zhì)性狀無(wú)顯著相關(guān)性。于佳慧在京海黃雞基因多態(tài)性研究中發(fā)現(xiàn)，該基因的多態(tài)性對(duì)京海黃雞脛圍、體重和屠宰性能影響較大。Estell 等發(fā)現(xiàn)該基因與豬脂肪沉積密切相關(guān)，與Ojeda 等研究結(jié)果一致。因此，基因不僅與多種癌癥密切相關(guān)，且在畜禽分子育種研究領(lǐng)域也有較多報(bào)道，但未見與山羊繁殖性狀相關(guān)研究。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)直接測(cè)序法發(fā)現(xiàn)，基因至少存在4 個(gè)突變位點(diǎn)，且均處于中度多態(tài)水平，檢測(cè)結(jié)果表明4 個(gè)突變位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)，但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，只有基因的G3831A 突變位點(diǎn)與F代波雜山羊的產(chǎn)羔數(shù)存在顯著相關(guān)性。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多與山羊繁殖性狀相關(guān)的基因，如：梁琛等在基因與濟(jì)寧青山羊高繁殖力關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，第9 外顯子突變位點(diǎn)AA 基因型高于AB 和AC基因型。李平等在基因多態(tài)性與山羊繁殖性能相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)，貴州黑山羊GG 基因型產(chǎn)羔數(shù)顯著高于CC 基因型和GC 基因型（<0.05），但在努比亞山羊中GC 基因型產(chǎn)羔數(shù)顯著高于CC 基因型和GG基因型（<0.05）；黃勤華等在貴州黑山羊促黃體素基因多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，在138 bp處AB 基因型比AA 基因型平均產(chǎn)仔數(shù)高且差異顯著（<0.01）。綜上所述，基因具有作為F代波雜山羊繁殖性狀候選基因的潛力，能為后期基因分子育種的機(jī)制研究提供數(shù)據(jù)支持。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，基因的4 個(gè)突變位點(diǎn)僅G3831A 位點(diǎn)與產(chǎn)羔數(shù)存在顯著相關(guān)性，其余3 個(gè)位點(diǎn)均不存在顯著差異，因此，基因可作為F代波雜山羊產(chǎn)羔性狀的候選基因。