滕偉 范龍坤 龐超 韓海莉

顱骨缺損是神經外科常見疾病之一，發(fā)病部位位于頭顱骨，一般小于3 cm 的顱骨缺損或位于枕肌、顳肌下的顱骨缺損臨床均無明顯表現，較大的顱骨缺損患者一般表現為頭疼、頭暈、惡心、肢體肌力減退等癥狀，多由開放性外傷、穿通傷、粉碎性擴創(chuàng)術等手術減壓、顱骨切除病損等原因造成[1]。隨著顱骨缺損患者數量的逐年增加，對于缺損顱骨修復的需求也在不斷提高。現階段治療顱骨缺損多通過替代材料修復缺損位置[2]，Ⅰ型膠原蛋白有機/羥基磷灰石無機復合物是臨床常用的修復材料，雖然具有取材方便、骨傳導性和骨誘導性較好的優(yōu)點，但也存在一定的免疫排斥等隱患[3]，因此，仍需尋求具有良好生物相容性、降解性、可塑性的理想顱骨缺損修復材料。胎盤生長因子（placental growth factor，PLGF）最早是在1991 年由胎盤cDNA 文庫中分離純化得到[4]，可結合血管內皮細胞、滋養(yǎng)層細胞中的酪氨酸酶受體，參與調節(jié)血管生長和滋養(yǎng)層細胞自分泌過程[5]。研究發(fā)現，PLGF 不僅與胎盤功能有關，表達于胎盤組織、心臟、肝臟、肺等組織中，還參與調節(jié)了軟骨成骨形成及骨折修復過程[6]。然而，目前尚不清楚PLGF 是否對于顱骨缺損修復也存在較好地促進作用。基于此，本次研究以含PLGF 膠原/羥基磷灰石支架作為顱骨缺損修復材料，觀察其修復效果及對新骨形成的影響，現將具體內容報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 清潔級SD 大鼠15 只，購自武漢大學動物實驗中心，3 月齡，體重為（450±50）g；4%水合氯醛購自上海信裕生物科技有限公司；膠原/羥基磷灰石復合材料購自北京奧精醫(yī)藥科技有限公司；PLGF 重組蛋白購自上海澤葉生物科技有限公司；4%多聚甲醛購自天津坤華化工有限公司；蘇木精、伊紅染液購自美國sigma 公司；乙醇、氨水購自廣州化學試劑廠；Trizol 試劑購自日本TaKaRa公司。

1.2 儀器與設備 微型CT 掃描儀購自荷蘭皇家飛利浦公司，型號：Brilliance 64；微機控制電子萬能試驗機購自美國MTS-SANS 公司，型號：CTM4000，位移分辨率0.03 μm；倒置相差顯微鏡及配套照相系統(tǒng)購自日本Olympus 公司，型號：CKX53；臺式高速冷凍離心機購自德國Eraeus 公司，型號：Allegra 64R；RNA 逆轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司，型號：10T；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）SYBR?Premix Ex Taq?試劑盒購自日本TaKaRa 公司，型號：11141ES10。

1.3 動物分組及模型構建 采用4%水合氯醛按照0.8 mL/100 g 腹腔注射麻醉大鼠，待麻醉生效后，將大鼠以俯臥位固定于超凈操作臺上，常規(guī)消毒備皮后，沿顱骨中線做2 mm 切口，縱向切開皮膚，分離皮膚、軟組織、骨膜，采用骨膜剝離器暴露頂骨，生理鹽水沖洗后以矢狀縫作為中線，環(huán)鉆在矢狀縫處做直徑為 7 mm 全層顱骨臨界性缺損，左右兩側間隔3～4 mm，整個操作過程中應避免損傷硬腦膜。顯微鏡下觀察到大鼠顱骨缺損處硬腦膜完整，呈較為規(guī)則的圓形，可見血管，無明顯骨片殘留，術后2 h 大鼠蘇醒且活動逐漸恢復，傷口無明顯出血及感染則視為造模成功[7]。15 只大鼠隨機分為A 組（空白對照組）、B 組（膠原/羥基磷灰石組）、C 組（含PLGF 的膠原/羥基磷灰石組），每組5 只。A 組大鼠顱骨缺損處不做任何處理，B 組大鼠顱骨缺損區(qū)植入8 mm×1.5 mm 的膠原/羥基磷灰石支架，C 組大鼠顱骨缺損處植入8 mm×1.5 mm 含有PLGF 的膠原/羥基磷灰石支架（由5 μg/mL PLGF 的微粒摻入膠原/羥基磷灰石支架后冷凍干燥所制成）。

1.4 觀察指標及評價標準

1.4.1 Micro CT 掃描 造模后8 周對各組大鼠實施頸椎脫臼處死，取大鼠顱骨損傷部位，4%多聚甲醛固定24 h，采用Micro CT 掃描儀進行掃描，設置參數為：電壓50 kV，電流145 mA，層厚為20 μm，掃描時間3.4 s。對掃描獲得的圖像輸入工作站進行標準化重建，獲得骨體積（bone volume，BV）、骨礦物質密度（bone mineral density，BMD）和骨體積/組織體積（bone volume/ tissue volume，BV/TV）等骨組織形態(tài)計量指標結果。

1.4.2 生物力學測試 取經多聚甲醛固定后的各組大鼠顱骨損傷部位，采用微機控制電子萬能試驗機對骨組織進行生物力學測試，首先將各組顱骨損傷標本固定于底托上，將壓桿垂直對準骨損傷部位，按照0.5 mm/min 加載速度對其進行逐漸加壓，記錄最大負載力值。

1.4.3 蘇木素-伊紅染色 取經多聚甲醛固定后的各組大鼠顱骨損傷部位經石蠟包埋后制成組織切片，將組織切片與二甲苯共同孵育后，以100%乙醇溶液清洗10 min，90%乙醇溶液洗10 min，75%乙醇溶液洗10 min 脫蠟，水化10 min 后將切片置于蘇木精染色液中浸泡10 min，吸取浮色后以0.1%鹽酸分化3 s，氨水返藍10 min 后浸入伊紅染液中處理10 s，洗去浮色后梯度乙醇、二甲苯脫水透明，中性樹膠封片，倒置相差顯微鏡下觀察病理損傷情況。

1.4.4 qRT-PCR 檢測成骨相關基因的mRNA 相對表達水平 參照文獻[8]采用qRT-PCR 法檢測各組大鼠成骨相關基因Ⅰ型膠原（type Ⅰ collagen，COLⅠ）、骨橋蛋白（osteopontin，OP）、骨鈣素（osteocalcin，OC）、Runt相關轉錄因子2（Runt related transcription factor 2，Runx2）的mRNA 相對表達水平。具體操作如下：取各組大鼠缺損周圍顱骨，去除周圍結締組織在液氮中以研缽研磨成粉，轉移至含有1 mL Trizol 試劑的離心管中，輕搖離心管使其充分裂解，4 ℃下高速離心15 min 后留取上清液提取骨組織內的總RNA。使用反轉錄試劑盒將mRNA 逆轉錄成cDNA，利用C（t）值相對定量法以GAPDH 作為標準化內參對照，得到目的基因的相對表達量，目的基因引物上下游見表1，設置反應條件：95 ℃ 30 s（變性），60 ℃ 30 s（退火），72 ℃15 s（延伸），擴增循環(huán)40 次；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s（溶解曲線）。

表1 目的基因引物上下游

1.5 統(tǒng)計學處理 數據采用SPSS 22.0 軟件行統(tǒng)計學分析，計量資料以（）表示，兩組間比較用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠影像學觀察 造模后8 周A 組大鼠顱骨缺損區(qū)域仍呈圓形，邊緣清晰，且未見明顯新骨形成；B 組大鼠顱骨缺損區(qū)域小于A 組，邊緣較為模糊，可觀察到少量新骨形成；C 組大鼠顱骨缺損程度明顯小于A、B 組，缺損基本愈合，可觀察到大量新骨形成，見圖1。

圖1 各組大鼠影像學觀察

2.2 各組大鼠病理損傷情況觀察 A 組僅有少量成骨細胞活躍，骨缺損區(qū)域與宿主骨間的連接由纖維結締組織完成；B 組較A 組有少量新生骨樣組織形成，與骨缺損區(qū)域與宿主骨間的連接較為緊密；C組新生骨組織較A、B 兩組顯著增多，新生骨組織與宿主骨融合程度極高。C 組大鼠組織病理損傷程度顯著輕于A、B 兩組。

2.3 各組大鼠骨組織形態(tài)對比 B 組BV、BMD、BV/TV 等骨組織形態(tài)計量指標均優(yōu)于A 組，C 組BV、BMD、BV/TV 等骨組織形態(tài)計量指標均優(yōu)于A組、B 組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠骨組織形態(tài)對比（）

表2 各組大鼠骨組織形態(tài)對比（）

*與A 組比較，P＜0.05；#與B 組比較，P＜0.05。

2.4 各組大鼠生物力學指標對比 A 組、B 組、C組新生骨組織最大負載力值分別為（25.62±3.72）、（54.31±4.68）、（80.27±2.93）N，C 組新生骨組織最大負載力值較A 組、B 組明顯偏高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.5 各組大鼠成骨相關基因mRNA 相對表達水平比較 B 組大鼠COLⅠ、OP、OC、Runx2 等成骨相關基因的mRNA 相對表達水平均顯著高于A 組，C 組大鼠COLⅠ、OP、OC、Runx2 等成骨相關基因的mRNA 相對表達水平均顯著高于A 組、B 組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠成骨相關基因mRNA相對表達水平比較[/GAPDH，（）]

表3 各組大鼠成骨相關基因mRNA相對表達水平比較[/GAPDH，（）]

*與A 組比較，P＜0.05；#與B 組比較，P＜0.05。

3 討論

顱骨缺損是骨科臨床常見多發(fā)疾病之一，多由炎癥、外傷、腫瘤切除和先天性畸形等因素造成，臨床治愈難度較大，治療方案復雜且周期較長，對于患者日常生活產生極大影響[9]?，F價段常用的顱骨缺損修復材料有自體骨和異體骨，兩者各有優(yōu)劣，帶有血供的自體骨植入雖然是目前修復顱骨缺損的“金標準”，但也存在供骨量有限，易對患者造成供區(qū)損傷或繼發(fā)畸形等不良后果[10]。而異體骨雖然取材較為便利，不受患者自身局限，但因存在排異反應及傳播疾病等安全隱患導致其廣泛應用受到制約[11]。隨著近些年來醫(yī)學技術的不斷發(fā)展和分子生物學、骨組織工程學等學科的飛速進步，人工骨組織再生替代材料支架有望取代傳統(tǒng)移植方案，改善顱骨缺損修復，促進骨愈合。

過去幾十年里，具有永久性、可降解性、合成性的生物材料被認為具有促進骨缺損修復作用，這些生物材料因具有較好的骨誘導性、傳導性、整合性及生物相容性，現已成為骨組織工程的理想材料[12]。膠原是骨組織關鍵組成成分，因抗原性較小而對于干細胞黏附、增殖和分化有較好的促進作用[13]，羥基磷灰石作為天然骨礦物質的一種，具有良好的骨傳導性[14]。膠原/羥基磷灰石支架結合了膠原和羥基磷灰石的優(yōu)良特性，不僅有利于干細胞的生長發(fā)育，還提高了支架的骨傳導性和生物力學性能[15]。本次研究采用膠原/羥基磷灰石作為基礎支架，將PLGF 的微粒摻入其中制備含PLGF 的膠原/羥基磷灰石支架，探究該支架作用于顱骨缺損大鼠模型的作用及其對新骨形成的影響。

PLGF 作為血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）家族的重要成員，位于14q24q31 染色體中，堿基序列與VEGF 具有高度同源性，可通過特異性結合受體VEGFR1 并誘導其磷酸化，激活酪氨酸酶途徑將信號傳遞至胞漿中，進而發(fā)揮其獨特的生物學特性[16]。PLGF 除了可作為妊娠相關疾病的特異性標志物，還被發(fā)現在病理狀態(tài)下特異性表達于新生血管中，發(fā)揮優(yōu)良的促血管生成作用[17]。本次研究發(fā)現，含PLGF 的膠原/羥基磷灰石支架可加速顱骨缺損大鼠骨愈合，減輕模型大鼠的病理損傷，改善BV、BMD、BV/TV等骨組織形態(tài)計量指標，提高新生骨組織最大負載力值，上調COLⅠ、OP、OC、Runx2 等成骨相關基因的mRNA 相對表達，促進新骨形成，表明含有PLGF 的膠原/羥基磷灰石支架可改善顱骨缺損模型大鼠的病理損傷，加速骨組織修復和新生?？紤]原因有以下幾點：（1）PLGF 可誘導血管內皮細胞增殖、分化和遷移，促進單核、內皮細胞的游走，增加血管內皮通透性，進而促進植入支架的血管化和骨化等骨損傷修復的基本環(huán)節(jié)的進展[18]，發(fā)揮加速骨愈合和骨形成的作用；（2）外源性PLGF 可通過抑制炎性血管增生發(fā)揮抗炎的作用，趨化炎癥細胞，清除壞死組織[19]，幫助維持植入支架形態(tài)結合，為新骨形成提供有利幫助；（3）PLGF 可恢復局部缺血組織的缺血重建，誘導小鼠缺損骨周圍組織產生持續(xù)存在的血管，從而為支架提供充足的供血、供氧及營養(yǎng)物質[20]，進而加速骨愈合和骨形成過程。

綜上所述，本次研究通過制備含PLGF 的膠原/羥基磷灰石支架并將其作用于顱骨缺損大鼠模型，證實了其對于模型大鼠顱骨缺損有較好的修復作用，且可誘導新骨形成，表明PLGF 的膠原/羥基磷灰石支架在活體中擁有較好的骨缺損再生能力，在顱骨缺損修復的臨床應用中擁有廣闊前景。然而，本次研究也存在一定的不足之處，如未進一步了解含PLGF 的膠原/羥基磷灰石支架促進骨缺損再生的具體調控機制，下一步將會進行詳細深入地探索。