滕偉 范龍坤 龐超 韓海莉

顱骨缺損是神經(jīng)外科常見疾病之一，發(fā)病部位位于頭顱骨，一般小于3 cm 的顱骨缺損或位于枕肌、顳肌下的顱骨缺損臨床均無明顯表現(xiàn)，較大的顱骨缺損患者一般表現(xiàn)為頭疼、頭暈、惡心、肢體肌力減退等癥狀，多由開放性外傷、穿通傷、粉碎性擴(kuò)創(chuàng)術(shù)等手術(shù)減壓、顱骨切除病損等原因造成[1]。隨著顱骨缺損患者數(shù)量的逐年增加，對(duì)于缺損顱骨修復(fù)的需求也在不斷提高?，F(xiàn)階段治療顱骨缺損多通過替代材料修復(fù)缺損位置[2]，Ⅰ型膠原蛋白有機(jī)/羥基磷灰石無機(jī)復(fù)合物是臨床常用的修復(fù)材料，雖然具有取材方便、骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性較好的優(yōu)點(diǎn)，但也存在一定的免疫排斥等隱患[3]，因此，仍需尋求具有良好生物相容性、降解性、可塑性的理想顱骨缺損修復(fù)材料。胎盤生長因子（placental growth factor，PLGF）最早是在1991 年由胎盤cDNA 文庫中分離純化得到[4]，可結(jié)合血管內(nèi)皮細(xì)胞、滋養(yǎng)層細(xì)胞中的酪氨酸酶受體，參與調(diào)節(jié)血管生長和滋養(yǎng)層細(xì)胞自分泌過程[5]。研究發(fā)現(xiàn)，PLGF 不僅與胎盤功能有關(guān)，表達(dá)于胎盤組織、心臟、肝臟、肺等組織中，還參與調(diào)節(jié)了軟骨成骨形成及骨折修復(fù)過程[6]。然而，目前尚不清楚PLGF 是否對(duì)于顱骨缺損修復(fù)也存在較好地促進(jìn)作用。基于此，本次研究以含PLGF 膠原/羥基磷灰石支架作為顱骨缺損修復(fù)材料，觀察其修復(fù)效果及對(duì)新骨形成的影響，現(xiàn)將具體內(nèi)容報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 清潔級(jí)SD 大鼠15 只，購自武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，3 月齡，體重為（450±50）g；4%水合氯醛購自上海信裕生物科技有限公司；膠原/羥基磷灰石復(fù)合材料購自北京奧精醫(yī)藥科技有限公司；PLGF 重組蛋白購自上海澤葉生物科技有限公司；4%多聚甲醛購自天津坤華化工有限公司；蘇木精、伊紅染液購自美國sigma 公司；乙醇、氨水購自廣州化學(xué)試劑廠；Trizol 試劑購自日本TaKaRa公司。

1.2 儀器與設(shè)備 微型CT 掃描儀購自荷蘭皇家飛利浦公司，型號(hào)：Brilliance 64；微機(jī)控制電子萬能試驗(yàn)機(jī)購自美國MTS-SANS 公司，型號(hào)：CTM4000，位移分辨率0.03 μm；倒置相差顯微鏡及配套照相系統(tǒng)購自日本Olympus 公司，型號(hào)：CKX53；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購自德國Eraeus 公司，型號(hào)：Allegra 64R；RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司，型號(hào)：10T；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）SYBR?Premix Ex Taq?試劑盒購自日本TaKaRa 公司，型號(hào)：11141ES10。

1.3 動(dòng)物分組及模型構(gòu)建 采用4%水合氯醛按照0.8 mL/100 g 腹腔注射麻醉大鼠，待麻醉生效后，將大鼠以俯臥位固定于超凈操作臺(tái)上，常規(guī)消毒備皮后，沿顱骨中線做2 mm 切口，縱向切開皮膚，分離皮膚、軟組織、骨膜，采用骨膜剝離器暴露頂骨，生理鹽水沖洗后以矢狀縫作為中線，環(huán)鉆在矢狀縫處做直徑為 7 mm 全層顱骨臨界性缺損，左右兩側(cè)間隔3～4 mm，整個(gè)操作過程中應(yīng)避免損傷硬腦膜。顯微鏡下觀察到大鼠顱骨缺損處硬腦膜完整，呈較為規(guī)則的圓形，可見血管，無明顯骨片殘留，術(shù)后2 h 大鼠蘇醒且活動(dòng)逐漸恢復(fù)，傷口無明顯出血及感染則視為造模成功[7]。15 只大鼠隨機(jī)分為A 組（空白對(duì)照組）、B 組（膠原/羥基磷灰石組）、C 組（含PLGF 的膠原/羥基磷灰石組），每組5 只。A 組大鼠顱骨缺損處不做任何處理，B 組大鼠顱骨缺損區(qū)植入8 mm×1.5 mm 的膠原/羥基磷灰石支架，C 組大鼠顱骨缺損處植入8 mm×1.5 mm 含有PLGF 的膠原/羥基磷灰石支架（由5 μg/mL PLGF 的微粒摻入膠原/羥基磷灰石支架后冷凍干燥所制成）。

1.4 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1 Micro CT 掃描 造模后8 周對(duì)各組大鼠實(shí)施頸椎脫臼處死，取大鼠顱骨損傷部位，4%多聚甲醛固定24 h，采用Micro CT 掃描儀進(jìn)行掃描，設(shè)置參數(shù)為：電壓50 kV，電流145 mA，層厚為20 μm，掃描時(shí)間3.4 s。對(duì)掃描獲得的圖像輸入工作站進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化重建，獲得骨體積（bone volume，BV）、骨礦物質(zhì)密度（bone mineral density，BMD）和骨體積/組織體積（bone volume/ tissue volume，BV/TV）等骨組織形態(tài)計(jì)量指標(biāo)結(jié)果。

1.4.2 生物力學(xué)測試 取經(jīng)多聚甲醛固定后的各組大鼠顱骨損傷部位，采用微機(jī)控制電子萬能試驗(yàn)機(jī)對(duì)骨組織進(jìn)行生物力學(xué)測試，首先將各組顱骨損傷標(biāo)本固定于底托上，將壓桿垂直對(duì)準(zhǔn)骨損傷部位，按照0.5 mm/min 加載速度對(duì)其進(jìn)行逐漸加壓，記錄最大負(fù)載力值。

1.4.3 蘇木素-伊紅染色 取經(jīng)多聚甲醛固定后的各組大鼠顱骨損傷部位經(jīng)石蠟包埋后制成組織切片，將組織切片與二甲苯共同孵育后，以100%乙醇溶液清洗10 min，90%乙醇溶液洗10 min，75%乙醇溶液洗10 min 脫蠟，水化10 min 后將切片置于蘇木精染色液中浸泡10 min，吸取浮色后以0.1%鹽酸分化3 s，氨水返藍(lán)10 min 后浸入伊紅染液中處理10 s，洗去浮色后梯度乙醇、二甲苯脫水透明，中性樹膠封片，倒置相差顯微鏡下觀察病理損傷情況。

1.4.4 qRT-PCR 檢測成骨相關(guān)基因的mRNA 相對(duì)表達(dá)水平 參照文獻(xiàn)[8]采用qRT-PCR 法檢測各組大鼠成骨相關(guān)基因Ⅰ型膠原（type Ⅰ collagen，COLⅠ）、骨橋蛋白（osteopontin，OP）、骨鈣素（osteocalcin，OC）、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt related transcription factor 2，Runx2）的mRNA 相對(duì)表達(dá)水平。具體操作如下：取各組大鼠缺損周圍顱骨，去除周圍結(jié)締組織在液氮中以研缽研磨成粉，轉(zhuǎn)移至含有1 mL Trizol 試劑的離心管中，輕搖離心管使其充分裂解，4 ℃下高速離心15 min 后留取上清液提取骨組織內(nèi)的總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用C（t）值相對(duì)定量法以GAPDH 作為標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參對(duì)照，得到目的基因的相對(duì)表達(dá)量，目的基因引物上下游見表1，設(shè)置反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s（變性），60 ℃ 30 s（退火），72 ℃15 s（延伸），擴(kuò)增循環(huán)40 次；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s（溶解曲線）。

表1 目的基因引物上下游

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（）表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠影像學(xué)觀察 造模后8 周A 組大鼠顱骨缺損區(qū)域仍呈圓形，邊緣清晰，且未見明顯新骨形成；B 組大鼠顱骨缺損區(qū)域小于A 組，邊緣較為模糊，可觀察到少量新骨形成；C 組大鼠顱骨缺損程度明顯小于A、B 組，缺損基本愈合，可觀察到大量新骨形成，見圖1。

圖1 各組大鼠影像學(xué)觀察

2.2 各組大鼠病理損傷情況觀察 A 組僅有少量成骨細(xì)胞活躍，骨缺損區(qū)域與宿主骨間的連接由纖維結(jié)締組織完成；B 組較A 組有少量新生骨樣組織形成，與骨缺損區(qū)域與宿主骨間的連接較為緊密；C組新生骨組織較A、B 兩組顯著增多，新生骨組織與宿主骨融合程度極高。C 組大鼠組織病理損傷程度顯著輕于A、B 兩組。

2.3 各組大鼠骨組織形態(tài)對(duì)比 B 組BV、BMD、BV/TV 等骨組織形態(tài)計(jì)量指標(biāo)均優(yōu)于A 組，C 組BV、BMD、BV/TV 等骨組織形態(tài)計(jì)量指標(biāo)均優(yōu)于A組、B 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠骨組織形態(tài)對(duì)比（）

表2 各組大鼠骨組織形態(tài)對(duì)比（）

*與A 組比較，P＜0.05；#與B 組比較，P＜0.05。

2.4 各組大鼠生物力學(xué)指標(biāo)對(duì)比 A 組、B 組、C組新生骨組織最大負(fù)載力值分別為（25.62±3.72）、（54.31±4.68）、（80.27±2.93）N，C 組新生骨組織最大負(fù)載力值較A 組、B 組明顯偏高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5 各組大鼠成骨相關(guān)基因mRNA 相對(duì)表達(dá)水平比較 B 組大鼠COLⅠ、OP、OC、Runx2 等成骨相關(guān)基因的mRNA 相對(duì)表達(dá)水平均顯著高于A 組，C 組大鼠COLⅠ、OP、OC、Runx2 等成骨相關(guān)基因的mRNA 相對(duì)表達(dá)水平均顯著高于A 組、B 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠成骨相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較[/GAPDH，（）]

表3 各組大鼠成骨相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較[/GAPDH，（）]

*與A 組比較，P＜0.05；#與B 組比較，P＜0.05。

3 討論

顱骨缺損是骨科臨床常見多發(fā)疾病之一，多由炎癥、外傷、腫瘤切除和先天性畸形等因素造成，臨床治愈難度較大，治療方案復(fù)雜且周期較長，對(duì)于患者日常生活產(chǎn)生極大影響[9]?，F(xiàn)價(jià)段常用的顱骨缺損修復(fù)材料有自體骨和異體骨，兩者各有優(yōu)劣，帶有血供的自體骨植入雖然是目前修復(fù)顱骨缺損的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但也存在供骨量有限，易對(duì)患者造成供區(qū)損傷或繼發(fā)畸形等不良后果[10]。而異體骨雖然取材較為便利，不受患者自身局限，但因存在排異反應(yīng)及傳播疾病等安全隱患導(dǎo)致其廣泛應(yīng)用受到制約[11]。隨著近些年來醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和分子生物學(xué)、骨組織工程學(xué)等學(xué)科的飛速進(jìn)步，人工骨組織再生替代材料支架有望取代傳統(tǒng)移植方案，改善顱骨缺損修復(fù)，促進(jìn)骨愈合。

過去幾十年里，具有永久性、可降解性、合成性的生物材料被認(rèn)為具有促進(jìn)骨缺損修復(fù)作用，這些生物材料因具有較好的骨誘導(dǎo)性、傳導(dǎo)性、整合性及生物相容性，現(xiàn)已成為骨組織工程的理想材料[12]。膠原是骨組織關(guān)鍵組成成分，因抗原性較小而對(duì)于干細(xì)胞黏附、增殖和分化有較好的促進(jìn)作用[13]，羥基磷灰石作為天然骨礦物質(zhì)的一種，具有良好的骨傳導(dǎo)性[14]。膠原/羥基磷灰石支架結(jié)合了膠原和羥基磷灰石的優(yōu)良特性，不僅有利于干細(xì)胞的生長發(fā)育，還提高了支架的骨傳導(dǎo)性和生物力學(xué)性能[15]。本次研究采用膠原/羥基磷灰石作為基礎(chǔ)支架，將PLGF 的微粒摻入其中制備含PLGF 的膠原/羥基磷灰石支架，探究該支架作用于顱骨缺損大鼠模型的作用及其對(duì)新骨形成的影響。

PLGF 作為血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）家族的重要成員，位于14q24q31 染色體中，堿基序列與VEGF 具有高度同源性，可通過特異性結(jié)合受體VEGFR1 并誘導(dǎo)其磷酸化，激活酪氨酸酶途徑將信號(hào)傳遞至胞漿中，進(jìn)而發(fā)揮其獨(dú)特的生物學(xué)特性[16]。PLGF 除了可作為妊娠相關(guān)疾病的特異性標(biāo)志物，還被發(fā)現(xiàn)在病理狀態(tài)下特異性表達(dá)于新生血管中，發(fā)揮優(yōu)良的促血管生成作用[17]。本次研究發(fā)現(xiàn)，含PLGF 的膠原/羥基磷灰石支架可加速顱骨缺損大鼠骨愈合，減輕模型大鼠的病理損傷，改善BV、BMD、BV/TV等骨組織形態(tài)計(jì)量指標(biāo)，提高新生骨組織最大負(fù)載力值，上調(diào)COLⅠ、OP、OC、Runx2 等成骨相關(guān)基因的mRNA 相對(duì)表達(dá)，促進(jìn)新骨形成，表明含有PLGF 的膠原/羥基磷灰石支架可改善顱骨缺損模型大鼠的病理損傷，加速骨組織修復(fù)和新生?？紤]原因有以下幾點(diǎn)：（1）PLGF 可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化和遷移，促進(jìn)單核、內(nèi)皮細(xì)胞的游走，增加血管內(nèi)皮通透性，進(jìn)而促進(jìn)植入支架的血管化和骨化等骨損傷修復(fù)的基本環(huán)節(jié)的進(jìn)展[18]，發(fā)揮加速骨愈合和骨形成的作用；（2）外源性PLGF 可通過抑制炎性血管增生發(fā)揮抗炎的作用，趨化炎癥細(xì)胞，清除壞死組織[19]，幫助維持植入支架形態(tài)結(jié)合，為新骨形成提供有利幫助；（3）PLGF 可恢復(fù)局部缺血組織的缺血重建，誘導(dǎo)小鼠缺損骨周圍組織產(chǎn)生持續(xù)存在的血管，從而為支架提供充足的供血、供氧及營養(yǎng)物質(zhì)[20]，進(jìn)而加速骨愈合和骨形成過程。

綜上所述，本次研究通過制備含PLGF 的膠原/羥基磷灰石支架并將其作用于顱骨缺損大鼠模型，證實(shí)了其對(duì)于模型大鼠顱骨缺損有較好的修復(fù)作用，且可誘導(dǎo)新骨形成，表明PLGF 的膠原/羥基磷灰石支架在活體中擁有較好的骨缺損再生能力，在顱骨缺損修復(fù)的臨床應(yīng)用中擁有廣闊前景。然而，本次研究也存在一定的不足之處，如未進(jìn)一步了解含PLGF 的膠原/羥基磷灰石支架促進(jìn)骨缺損再生的具體調(diào)控機(jī)制，下一步將會(huì)進(jìn)行詳細(xì)深入地探索。