王雅文 吳苗 耿素霞 曾令基 王玉連 賴沛龍 杜欣 翁建宇

1華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院（廣州 510006）；2廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）（廣州 510080）

閉塞性細支氣管炎（bronchiolitis obliterans，BO）是異基因造血干細胞移植后的肺部嚴重并發(fā)癥，小氣道纖維疤痕形成是BO 不可逆的病理損傷，5年死亡率高達50%，嚴重影響患者的生活質(zhì)量及壽命?，F(xiàn)有抗炎、抑制受體酪氨酸激酶的抗纖維化治療方式僅能輕微提高纖維化患者的生活質(zhì)量和生存率，因此探索新的治療策略極為迫切［1-3］。肌成纖維細胞（myofibroblast，MFB）是纖維化的“核心效應(yīng)細胞”，是細胞外基質(zhì)的“生產(chǎn)車間”［4］。MFB 分化/轉(zhuǎn)化失調(diào)、去分化紊亂、增殖失控和凋亡逃逸是纖維化發(fā)生發(fā)展的重要機制［5-7］。MFB 的來源多樣性、異質(zhì)性和調(diào)控機制復(fù)雜性導(dǎo)致迄今還未開發(fā)出強有力的抗纖維化藥物，因此對MFB 調(diào)控的研究將成為治療纖維化的新方向。間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）抗纖維化作用被越來越被多地探索和報道，大量臨床前研究顯示MSC 或MSC 來源囊泡具有抗纖維化作用［8-10］。MSC 通過免疫調(diào)節(jié)、抗炎和抑制FB 分化、上皮細胞/內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)分化等機制在纖維化的多個環(huán)節(jié)發(fā)揮抗纖維化作用，但MSC 對MFB 的具體作用仍不清楚。MSC 在抗纖維化的臨床應(yīng)用研究進展緩慢，療效僅部分延緩進展。如何提高MSC 抗纖維化作用一直是研究領(lǐng)域的熱點。

青蒿琥酯（artesunate，ART）可誘導(dǎo)MFB 凋亡，從而發(fā)揮抗纖維化的作用［11-12］。本研究團隊前期工作也證實了青蒿琥酯可通過調(diào)節(jié)BCL2 家族蛋白誘導(dǎo)肺MFB 凋亡［13］。但青蒿琥酯長期使用具有肝毒性、腎毒性等副作用，使其在瘧疾以外疾病的應(yīng)用受限制［14-15］。青蒿琥酯聯(lián)合MSC 是否可以提高抗纖維化作用，克服MSC 療效不穩(wěn)定、減少青蒿琥酯不良反應(yīng)的不足尚未明確。

本研究將觀察人臍帶間充質(zhì)干細胞（hUCMSC）對肺MFB 的具體作用，探索青蒿琥酯聯(lián)合hUCMSC 對MFB 增殖、凋亡、細胞外基質(zhì)合成功能的影響，為青蒿琥酯聯(lián)合MSC治療BO提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料α-MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶（Gibco公司），TGFβ1（PeroTech 公司），青蒿琥酯（Sigma公司），CCK8 試劑盒、凋亡試劑盒（廣州松鼠生物），逆轉(zhuǎn)錄及PCR 試劑盒（湖南艾科瑞生物），流式抗體（BD），人胚肺成纖維細胞（MRC-5）（美國ATCC 公司），hUCMSC 培養(yǎng)基及誘導(dǎo)分化試劑盒（賽業(yè)）。

1.2 方法

1.2.1 hUC-MSC 制備足月產(chǎn)婦簽署臍帶捐贈知情同意書后，無菌取人臍帶樣本10 cm。分離華通氏膠，剪成1～2 mm3碎塊，加入Ⅱ型膠原酶，消化6 h。于37 ℃培養(yǎng)，每3 天換液，當細胞融合達80%～90%，按1∶3傳代。實驗所用細胞均為P3 代。

1.2.2 hUC-MSC 鑒定（1）表面標志物檢測：于流式管中加CD90/HLADR-FITC、CD73/CD34-PE、CD105/CD45-APC 各5 μL，室溫避光孵育30 min，流式上機操作。（2）分化能力檢測：以5 × 104/孔將MSCs 鋪至6 孔板，當細胞融合度達70%時，更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每3 天換液1 次；當細胞融合度達100%時，更換為成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基。約21 d 后，進行油紅O 和茜素紅染色。

1.2.3 肌成纖維細胞制備P4-P7 代MRC-5 以2×104/孔接種于12孔板，各孔中加入10 ng/mL TGF-β1誘導(dǎo)48 h，檢測α-SMA 表達水平。

1.2.4 實驗分組（1）FB 組（MRC-5）：FB、FB-丙酮組、ART-FB 組、MSC-FB 組、ART-MSC-FB 組；（2）MFB 組（MRC-5+TGF-β1）：MFB 組、MFB-丙酮組、ART-MFB 組、MSC-MFB 組、ART-MSC-MFB 組；（3）MSC-deMFB 組：MSC-deMFB 組、MSC-deMFBTGFβ1 組、MSC-deMFB-MSC 組、MSC-deMFB-TGFβ 1-MSC。MRC-5 以2 × 104/孔接種于12 孔板，當FB融合達60%左右時，加入TGF-β1誘導(dǎo)48 h后，分別加入100 μmol/L ART、MSC或ART+MSC各24 h。在12 孔板上方放置0.4 μm 的小室，實驗組的小室接種2 × 103/孔的MSC，500 μL/孔，對照組的小室添加相同體積的培養(yǎng)基。

1.2.5 細胞增殖檢測hUC-MSCs 與MFB transwell共培養(yǎng)24 h，PBS洗滌，加10%CCK8培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育1 h，測定450 nm處的OD值。

1.2.6 細胞凋亡的流式檢測按照1.2.4 實驗分組進行分組，于流式管中加入Annexin-V 和PI 各5 μL，避光孵育5 min，流式上機。

1.2.7 qPCR檢測基因mRNA表達采用Trizol 法提取細胞總RNA，按說明書合成cDNA及PCR體系，引物序列見表1。數(shù)據(jù)以2-ΔΔCt計算α-SMA、COL1A1及FN1 的相對表達量。

表1 PCR 引物序列Tab.1 Primer sequences for PCR

1.2.8 WB 檢測基因蛋白表達采用RIPA 法提取細胞總蛋白，進行變性。蛋白上樣量為每孔30 μg，電泳90 min，電轉(zhuǎn)2 h，封閉1 h，TBST 洗三次。一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，上機曝光，檢測α-SMA、COL1A1 及FN1 的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法使用GraphPad Prism 9.0 對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)用均值±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hUCMSCs的鑒定P3代hUCMSCs呈長梭形、多角形（圖1A），可誘導(dǎo)成脂細胞（圖1B）和成骨細胞（圖1C）。hUCMSCs 表型符合國際細胞協(xié)會MSC標準（圖1D）。

圖1 hUCMSCs 的鑒定Fig.1 Identification of hUCMSCs

2.2 hUCMSCs 促進MFB 增殖當hUCMSCs 與MFB transwell 共培養(yǎng)24 h 后，MSC-MFB組細胞形態(tài)與MFB、FB 無明顯差異，細胞生長更密集、呈緊密連接，形似網(wǎng)格狀（圖2A）；CCK8 結(jié)果表明MSCMFB 組較MFB組，OD值增高（P＜0.01，圖2B）。

圖2 MSC 促進肺MFB 增殖Fig.2 MSCs promote proliferation of myofibroblasts

2.3 hUCMSCs 誘導(dǎo)MFB 可逆性去分化當hUCMSCs 與MFB transwell 共培養(yǎng)24 h 后，α-SMA、COL1A1、FN1 的mRNA（圖3A）和蛋白（圖3B）表達水平均較MFB 組明顯降低，提示hUCMSCs 可誘導(dǎo)MFB 去分化（MSC-deMFB）。

為了解hUCMSCs 對MFB 的去分化作用是否可逆，撤除MSC 后，MSC-deMFB 經(jīng)TGF-β1 重新誘導(dǎo)后，α-SMA 及細胞外基質(zhì)的mRNA（圖3C）和蛋白（圖3D）表達水平均增加，并恢復(fù)至MFB 水平。上述結(jié)果提示MSC誘導(dǎo)MFB的去分化作用是可逆的。

圖3 MSCs 誘導(dǎo)MFB 可逆性去分化Fig.3 MSCs induce reversible dedifferentiation of myofibroblasts

2.4 ART 促進MSC-deMFB 凋亡CCK8 結(jié)果 顯示：ART-MSC-MFB 組的細胞活性較ART-MFB 組降低（P＜0.05，圖4）。細胞的總凋亡率見表2。實驗結(jié)果提示：（1）FB 對ART 誘導(dǎo)凋亡作用優(yōu)于MFB（P＜0.01）；（2）ART 對MSC 誘導(dǎo)的去分化MFB（MSC-deMFB）的凋亡作用優(yōu)于ART 單獨作用于MFB（P＜0.05）。

圖4 ART 促進de-MFB 凋亡Fig.4 ART promotes de-MFB apoptosis

表2 細胞總凋亡率Tab.2 Total apoptosis rate±s

表2 細胞總凋亡率Tab.2 Total apoptosis rate±s

組別FB 組ART-FB 組MFB 組MSC-MFB 組ART-MFB 組ART-MSC-MFB 組總凋亡率（%）0.67±0.06 11.23±0.89 0.90±0.07 0.88±0.03 5.98±0.15 8.45±0.27

2.5 ART 協(xié)同hUCMSCs 抑制MFB 的細胞外基質(zhì)合成MSC、ART 均抑制MFB 的α-SMA、COL1A1的mRNA和蛋白表達；當ART聯(lián)合MSC作用時，MFB的α-SMA、COL1A1表達水平進一步降低（P＜0.01）。實驗結(jié)果表明：ART 協(xié)同hUCMSCs 進一步抑制MFB 合成細胞外基質(zhì)。見圖5。

圖5 ART 協(xié)同hUCMSCs 抑制MFB 合成細胞外基質(zhì)Fig.5 ART synergizes with MSCs to inhibit extracellular matrix of the myofibroblasts

3 討論

BO 的病因復(fù)雜、多環(huán)節(jié)失衡（氣道上皮損傷→炎癥/免疫介導(dǎo)→多種細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化→MFB 去分化失調(diào)、增殖失控、凋亡逃逸→纖維瘢痕形成）及周而復(fù)始的病理生理過程，最終發(fā)展為不可逆的細支氣管狹窄、閉塞［16-18］。既往臨床實踐圍繞抗炎、抑制纖維化信號通路活化（尼達尼布、吡非尼酮）的治療方法，治療效果不盡如人意。究其原因，傳統(tǒng)治療策略并不能切斷復(fù)雜病因、不能阻斷來源豐富的各種細胞向MFB 轉(zhuǎn)化、不能抑制MFB 增殖和逆轉(zhuǎn)MFB 凋亡逃逸，而且更無法消退已形成的氣道疤痕［19-20］。

MSC 抗纖維化作用越來越被關(guān)注，既往研究重點集中在成纖維細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞等各種細胞向MFB 轉(zhuǎn)化這一過程的調(diào)控［8，21-22］，而對于纖維化核心細胞——MFB 的關(guān)注較少。

本研究發(fā)現(xiàn)當MSC 與MFB 共培養(yǎng)后，細胞呈現(xiàn)增殖狀態(tài)，其纖維化相關(guān)基因的表達明顯下調(diào)，恢復(fù)至接近FB 的起始水平，這種現(xiàn)象稱之為“MFB 去分化”。本研究把經(jīng)MSC 誘導(dǎo)的去分化MFB 稱之為“MSC induced dedifferentiation of MFB，MSC-deMFB”（實驗中的MSC-MFB組）以區(qū)分MFB和FB。為了進一步了解MSC 對MFB 的去分化作用是否可逆，本研究對MSC-deMFB 進一步分組實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當撤除MSC 的刺激后，加TGF-β1 再刺激，MSC-deMFB 可恢復(fù)MFB 的特征；而在MSC 持續(xù)作用下，MSC-deMFB 仍然保持去分化特征，盡管再加入TGF-β1 也不能逆轉(zhuǎn)MSC 對MSC-deMFB 的持續(xù)去分化作用。上述結(jié)果解釋了MSC 臨床療效不穩(wěn)定、易復(fù)發(fā)的部分原因：MSC 誘導(dǎo)MFB 去分化作用是可逆的，而且依賴于MSC 的持續(xù)作用；臨床纖維化的病因往往不易去除，如在TGF-β1/SMAD 信號通路持續(xù)活化的環(huán)境下，一旦撤除MSC，增殖的MSC-deMFB 向MFB 逆轉(zhuǎn)（re-deMFB）勢必導(dǎo)致更為劇烈的纖維化效應(yīng)。本研究的發(fā)現(xiàn)為MSC 治療纖維化疾病的臨床研究設(shè)計提供理論依據(jù)?？朔﨧SC 對MFB 增殖和可逆性去分化作用，將是提高其抗纖維化的重要策略。

近年來，研究證實了青蒿琥酯在肺、腎、肝等器官纖維化疾病中的抗纖維化作用［23-25］，其作用機制為：（1）抗炎和免疫調(diào)節(jié)［26］：青蒿琥酯可抑制炎癥細胞的活化及招募，抑制TGF-β、TNF-α 等促炎因子的表達；（2）促進凋亡：青蒿琥酯可通過細胞內(nèi)在性途徑與外在性途徑促進細胞凋亡。本研究前期研究表明青蒿琥酯可通過調(diào)節(jié)BCL-2 家族蛋白的表達進而促進MFB 凋亡［13］，從而發(fā)揮減輕cGVHD 的作用［27］。青蒿琥酯因抗瘧作用被廣泛使用，但即使在安全劑量范圍內(nèi)，也會引起血液系統(tǒng)疾病、聽力障礙、肝臟毒性和心律不齊等不良反應(yīng)［14，28］。青蒿琥酯聯(lián)合MSC 治療纖維化疾病是否能達到協(xié)同作用的目的：即是否可提高抗纖維化的療效，又防止MSC 療效反彈、減少青蒿琥酯的毒副作用。由此，筆者進一步探索了青蒿琥酯對MSC-deMFB 的作用。青蒿琥酯誘導(dǎo)凋亡作用強度依序如下：FB＞MSC-deMFB＞MFB；并可克服MSC對MFB 的增殖作用，增強MSC 抑制MFB 細胞外基質(zhì)合成功能。由此筆者認為：青蒿琥酯可克服MSC誘導(dǎo)的MFB 增殖和可逆性去分化的不利現(xiàn)象，青蒿琥酯協(xié)同MSC 可能是有效安全的抗纖維化治療新策略。

本研究首次揭示MSC 可促進MFB 增殖、誘導(dǎo)MFB 可逆性去分化，并首次證實青蒿琥酯可誘導(dǎo)MSC-deMFB 凋亡、協(xié)同MSC 抑制MFB 的細胞外基質(zhì)合成。為BO 乃至纖維化疾病的治療提供了新的理論和實驗基礎(chǔ)。但本研究也存在一定局限性：因體內(nèi)環(huán)境和體外培養(yǎng)條件不同，須進行體內(nèi)和臨床研究加以驗證；雖有研究認為MSC-EV 和MSC-SF 均有抑制FB 分化和ECM 合成作用，但MSC-EV 的作用更為穩(wěn)定和持久，MSC-EV 中所含的miR21、miR29 參與抗纖維化調(diào)控［29］；MSC 分泌物調(diào)控MFB 去分化的機制尚不清楚，有待進一步實驗研究加以闡明。