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        鼠李糖乳桿菌及姜黃素通過調(diào)節(jié)TLR4信號通路對代謝相關(guān)脂肪性肝病影響的研究

        2022-09-13 08:53:52徐子媛張九娜孟燦燦程燕郭永澤李校天
        實用醫(yī)學雜志 2022年13期
        關(guān)鍵詞:鼠李糖姜黃桿菌

        徐子媛 張九娜 孟燦燦 程燕 郭永澤 李校天

        1河北工程大學臨床醫(yī)學院(河北邯鄲 056000);2河北工程大學附屬醫(yī)院(河北邯鄲 056000)

        代謝相關(guān)脂肪性肝病(metabolic associated fatty liver disease,MAFLD)曾經(jīng)被稱為非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)[1],是全球各地肝病相關(guān)死亡的重要原因[2]。近年來隨著生活方式和飲食習慣的改變,該病的發(fā)病率持續(xù)升高[3],全球患病率為25.54%[4],已經(jīng)成為了全球普遍關(guān)注的醫(yī)學和社會問題。從“一次打擊”學說到“多次打擊”學說,MAFLD 的發(fā)病機制尚未完全闡明,目前普遍接受的是“多次打擊”學說[5],它的核心因素包括脂質(zhì)代謝紊亂、胰島素的抵抗和氧化應激反應[6]。隨著研究的深入,先天免疫的活化在MAFLD 進展中的作用被證實,Toll 樣受體途徑是其中關(guān)鍵的一環(huán)[7],TLR4 信號通路可以誘導炎癥、介導氧化應激,在MAFLD 的發(fā)病機制中起到了關(guān)鍵性作用。除干預飲食及生活方式外,目前臨床尚無MAFLD 的國際批準治療藥。故本實驗通過研究鼠李糖乳桿菌及姜黃素對MAFLD 模型形成過程中TLR4 信號通路的影響,探討MAFLD形成的調(diào)節(jié)控制因素及其機制。

        1 材料與方法

        1.1 實驗材料

        1.1.1 實驗動物SPF 級SD 雄性大鼠40 只,8~12 周齡,體重(160±20)g,由濟南彭越實驗動物繁育公司提供。分籠飼養(yǎng)于溫度及濕度適宜的情況下,不限制飲食和水,動物處置過程嚴格遵守河北工程大學醫(yī)學院生物醫(yī)學倫理委員會的規(guī)定。

        1.1.2 藥品與試劑鼠李糖乳桿菌凍干粉購于鄭州百益寶生物技術(shù)銷售部,姜黃素羧甲基纖維素鈉購于大連美倫生物技術(shù)有限公司。所有藥物均置于4℃冰箱冷藏,每日灌胃前新鮮配制。脂多糖(LPS)、白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA 試劑盒,均購于杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。Toll 樣受體4(TLR4)、核因子-κBp65(NF-κBp65)、MyD88 和β-Actin 內(nèi)參抗體,均購于美國Santa 公司。

        1.1.3 儀器全自動生化儀,美國貝克曼有限公司產(chǎn)品;酶標儀,賽伯樂儀器有限公司產(chǎn)品;蛋白電泳儀,美國伯樂公司產(chǎn)品;

        1.2 實驗方法

        1.2.1 大鼠分組40 只SD 雄性大鼠適應性喂養(yǎng)一周后隨機分為5 組:正常對照組(MCS)、模型對照組(MCD)、鼠李糖乳桿菌干預組(LGG)、姜黃素干預組(CUR)、鼠李糖乳桿菌聯(lián)合姜黃素干預組(LGG+CUR),每組8 只。

        1.2.2 大鼠MAFLD 模型建立及干預模型對照組大鼠飼以蛋氨酸膽堿缺乏(methionine-cholinedeficient diet,MCD)飼料,該模型主要用于NAFLD治療藥物的篩選[8],正常對照組大鼠飼以蛋氨酸膽堿充足(methionine-choline-suffficient diet,MCS)飼料。各干預組在MCD 飲食的基礎上,LGG 組每日以鼠李糖乳桿菌2.0×1010CFU/100 g/d 劑量溶液灌胃一次,CUR 組每日以姜黃素200 mg/(kg·d)劑量溶液灌胃一次,LGG+CUR 組每日以鼠李糖乳桿菌2.0 × 1010CFU/100(g·d)劑量溶液聯(lián)合姜黃素200 mg/(kg·d)劑量溶液灌胃一次。正常對照組和模型對照組每日同等量的蒸餾水灌胃。溶液為鼠李糖乳桿菌凍干粉、姜黃素和無菌蒸餾水現(xiàn)配現(xiàn)用。

        1.2.3 標本收集、處理和肝指數(shù)計算連續(xù)喂養(yǎng)4 周,每日觀察大鼠的進食、活動、生長、毛色等情況。造模結(jié)束后,次日清晨稱重,用100 g/L(10%)水合氯醛溶液0.5 mL/100 g 腹腔注射麻醉后,門靜脈取血,以4 000 r/min 離心5 min。血清分裝于1.5 mL 的離心管中,置于超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?;同時取出新鮮完整肝臟,去除肝臟包膜,迅速稱肝濕重,計算肝指數(shù)。另切取肝左葉的肝組織數(shù)塊,置于4%多聚甲醛液,做上標記,其余置于超低溫冰箱中保存,用于RT-PCR、Western-blot 等檢測。肝指數(shù)=肝濕重(g)/體重(g)×100%。

        1.2.4 HE 染色法觀察肝組織病理形態(tài)將切片放入二甲苯(Ⅰ、Ⅱ溶液,各20 min),再放入無水乙醇(Ⅰ、Ⅱ溶液,5 min),入75%酒精中5 min,自來水沖洗。隨后入蘇木素染液染5 min,自來水沖洗,分化液分化,自來水沖洗,返藍,流動水洗。入85%、95%的酒精,各5 min。入伊紅染液5 min。依次放入無水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和二甲苯Ⅰ、Ⅱ中,各5 min,進行脫水透明。采用中性樹膠封片后,光學顯微鏡觀察,采集圖像。

        1.2.5 全自動生化分析儀測血清轉(zhuǎn)氨酶及肝臟脂肪含量用全自動生化分析儀測大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)、肝甘油三酯(liver triglycerides,TG)、肝膽固醇(liver cholesterol,TC)水平。

        1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附法測血清炎性因子用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)法測定血清中脂多糖(LPS)、白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量,按照試劑盒提供的說明書嚴格進行。

        1.2.7 RT-PCR 法測TLR4、NF-κBp65 和MyD88基因的表達量取大鼠肝組織100 mg,Trizol 法提取組織RNA,具體步驟按照試劑盒說明書操作,NanoDrop?ND-2000 儀器檢測提取RNA 的濃度及質(zhì)量,利用Prime-Script?RT Enzyme Mix 試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,加入擴增反應體系運用實時熒光定量PCR 法擴增,40 個循環(huán)反應結(jié)束后用2-ΔΔCt法進行相對定量分析,檢測基因mRNA 相對表達水平。以為β-Actin為內(nèi)參,引物序列見下表。

        1.2.8 蛋白質(zhì)印跡法測TLR4、NF-κBp65和MyD88蛋白的表達量取大鼠肝組織100 mg,提取細胞總蛋白,各取60 μg 進行凝膠電泳,半干轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉、一抗封閉和二抗封閉后,用增強化學發(fā)光法曝光,顯影、定影和沖洗晾干后,掃描儀掃描蛋白條帶。以β-Actin 為內(nèi)參,以所測蛋白的灰度值/β-actin 的灰度值的比值為所測蛋白的相對表達量。

        表1 引物序列表Tab.1 Primer sequence list

        1.3 統(tǒng)計學處理采用統(tǒng)計學軟件SPSS 26.0 進行數(shù)據(jù)分析與整理,測量數(shù)據(jù)以(±s)表示。5 組間比較采用單因素ANOVA 分析,5 組間兩兩比較時采用t檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié)果

        2.1 一般情況所有大鼠實驗過程中均沒有死亡,MCS組大鼠飲食良好,靈敏好動,毛發(fā)光潔;MCD組大鼠飲食減退,體重下降,反應遲鈍,毛發(fā)灰暗;LGG組、CUR組、LGG+CUR組大鼠一般情況較MCD組有所改善,LGG+CUR組一般情況接近MCS 組。

        2.2 肝指數(shù)比較MCD 組大鼠較MCS 組肝指數(shù)明顯升高,兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);各干預組與MCD 組比較,肝指數(shù)均不同程度降低,聯(lián)合組降低最顯著,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01),提示鼠李糖乳桿菌、姜黃素均可改善MAFLD 模型大鼠的肝指數(shù),兩者聯(lián)合效果更佳。見表2。

        表2 5 組大鼠肝指數(shù)的比較Tab.2 Comparison of the liver index in 5 groups of rats x±s

        2.3 肝組織病理學變化比較正常對照組大鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)完整,細胞核分布均勻,且肝細胞大小一致;模型組大鼠出現(xiàn)明顯的彌漫性的肝細胞脂肪變性,細胞核大小不一;各干預組與模型組比較,均有不同程度的脂肪細胞浸潤,且脂肪變性程度和脂肪空泡數(shù)量均呈不同程度減少,見圖1。

        圖1 顯微鏡下大鼠肝組織病理學變化比較(×200)Fig.1 Comparison of the pathological changes of liver tissue under microscope(×200)

        2.4 血清轉(zhuǎn)氨酶及肝臟脂肪水平比較與MCS組比較,MCD 組大鼠血清ALT、AST、肝組織TG、TC明顯升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01);各干預組與MCD 組比較,血清ALT、AST、肝組織TG、TC 均有不同程度的降低,其中以LGG+CUR組最為明顯,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。該研究結(jié)果提示鼠李糖乳桿菌及姜黃素均可顯著改善MAFLD 模型大鼠肝功能、降低肝臟脂肪沉積,兩者聯(lián)合應用效果更佳。見表3。

        表3 大鼠ALT、AST 和肝臟RG、TC 水平Tab.3 Serum ALT,AST and liver TG levels in rats x±s

        2.5 血清炎性因子水平比較模型組與對照組相比,LPS、IL-6 和TNF-α 均明顯增加,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。鼠李糖乳桿菌組、姜黃素組及鼠李糖乳桿菌聯(lián)合姜黃素組與模型組相比,LPS、IL-6 和TNF-α 均不同程度降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。提示鼠李糖乳桿菌、姜黃素均可降低MAFLD 大鼠炎性因子水平。見表4。

        表4 大鼠LPS、IG-6 和TNF-α 水平Tab.4 Levels of the LPS,IL-6 and TNF-α in rat serue x±s

        2.6 肝組織TLR4、NF-κB 和MyD88 基因的表達比較MCD 組大鼠與MCS 組相比,肝組織TLR4、NF-κB 和MyD88 基因的相對表達均明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);各干預組與MCD 組相比,TLR4、NF-κB 和MyD88 基因的相對表達的表達均不同程度降低,聯(lián)合組降低最明顯,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01);提示鼠李糖乳桿菌、姜黃素均可降低MAFLD 大鼠肝組織TLR4、NF-κB 和MyD88 基因表達水平,且兩者聯(lián)合應用效果更佳。見表5。

        表5 大鼠肝組織MyD88、NF-κB 和TLR4 的相對表達量Tab.5 The relative expression of MyD88、NF-κB and TLR4 genes in rat liver tissue ±s

        表5 大鼠肝組織MyD88、NF-κB 和TLR4 的相對表達量Tab.5 The relative expression of MyD88、NF-κB and TLR4 genes in rat liver tissue ±s

        注:MCD 與MCS 組比較,*P<0.01;干預組與MCD 組比較,#P<0.01;與CUR+LGG 組比較,▲P<0.01

        組別MCS MCD CUR LGG CUR+LGG MyD88 mRNA 0.92±0.12 3.41±0.23*2.38±0.12#▲2.38±0.13#▲1.57±0.14#NF-κB mRNA 1.05±0.07 3.17±0.10*2.19±0.09#▲2.20±0.09#▲1.81±0.06#TLR4 mRNA 1.06±0.09 3.38±0.16*2.37±0.15#▲2.40±0.15#▲1.79±0.10#

        2.7 肝組織TLR4、NF-κB 和MyD88 蛋白的表達比較MCD 組大鼠與MCS 組相比,肝組織TLR4、NF-κB 和MyD88 蛋白的相對表達均明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);各干預組與MCD 組相比,TLR4、NF-κB 和MyD88 蛋白的相對表達的表達均不同程度降低,聯(lián)合組降低最明顯,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01);提示鼠李糖乳桿菌、姜黃素均可降低MAFLD 大鼠肝組織TLR4、NF-κB 和MyD88 蛋白表達水平,且兩者聯(lián)合應用效果更佳。見表6、圖2。

        表6 大鼠肝組織TLR4、NF-κB 和MyD88 的表達量Tab.6 The different expression of MyD88,NF-κB and TLR4 liver tissue ±s

        表6 大鼠肝組織TLR4、NF-κB 和MyD88 的表達量Tab.6 The different expression of MyD88,NF-κB and TLR4 liver tissue ±s

        注:MCD 組與MCS 組比較,*P<0.01;干預組與MCD 組比較,#P<0.01,與CUR+LGG 組比較,▲P<0.01

        組別MCS MCD CUR LGG CUR+LGG MyD88 蛋白0.93±0.09 3.24±0.19*2.64±0.19#▲2.67±0.11#▲1.56±0.18#NF-κBp65 蛋白1.04±0.28 3.05±0.19*2.49±0.17#▲2.48±0.23#▲1.53±0.07#TLR4 蛋白0.82±0.05 2.66±0.09*2.06±0.04#▲1.96±0.09#▲1.37±0.10#

        圖2 大鼠肝組織TLR4、NF-κB 和MyD88 蛋白的表達Fig.2 The different expression of TLR4、NF-κB p65 and MyD88 in liver tissue

        3 討論

        TLR 是免疫系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)最早的模式識別受體(PRR),在固有免疫應答中識別病原微生物的病原相關(guān)的分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP),激活先天性免疫應答,還引起細胞因子的釋放[9]。TLR 廣泛分布于肝細胞、庫普弗細胞、肝星狀細胞、肝竇內(nèi)皮細胞和膽管內(nèi)皮細胞,其表達與PAMP的刺激有關(guān)[10]。常見的與代謝相關(guān)性脂肪性肝病有關(guān)的TLR 包括TLR2、TLR4、TLR5、TLR9,它們的配體分別是肽聚糖、脂多糖、鞭毛蛋白和細菌DNA[11-13]。TLR 介導的信號主要通過兩種途徑轉(zhuǎn)導,即“蛋白髓樣分化因子(MyD88)依賴性途徑”和“MyD88 非依賴性途徑”[14]。脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性桿菌細胞壁外層的主要成分,也稱內(nèi)毒素,是肝損傷中的一個重要因子,它能激發(fā)機體引起強烈的炎癥反應[15]。TLR4 是LPS的模式識別受體,表達于各種肝臟細胞中,通過MyD88 依賴途徑與LPS 結(jié)合并激活核因子-κB(NF-κB)通路,它的激活導致許多促炎、抗病毒,抗菌因子的產(chǎn)生[7]。實驗[16]發(fā)現(xiàn),TLR4 基因缺陷和肝臟庫普弗細胞失活都能夠使高脂肪飲食誘導的NAFLD 模型小鼠肝臟功能障礙減輕,表明肝臟庫普弗細胞上TLR4 的表達是NAFLD 疾病進程的重要因素。TLR 信號在健康肝臟中被抑制,但是當病原微生物和細菌來源的分子被輸送到肝臟時被激活,產(chǎn)生抗菌和抗病毒細胞因子,如TNF-α、IL-β和干擾素[17],這些細胞因子持續(xù)升高會損傷肝細胞。研究[18]證明在有NASH 的小鼠中,LPS 血清水平與對照小鼠相比有所增加,并且與核因子激活相關(guān),使用TLR4 抑制劑治療導致患有NASH 的小鼠肝炎癥降低。所以,通過對TLR4 轉(zhuǎn)導途徑的合理干預,能夠?qū)AFLD產(chǎn)生改善作用。

        益生菌可以調(diào)節(jié)腸道菌群,增加腸道有益細菌,減少有害細菌[19]。乳酸桿菌GG(LGG)是益生菌常用的菌株[20],因為這些細菌可以通過產(chǎn)生乳酸和其他抗菌物質(zhì)來抑制革蘭氏陰性致病菌的擴張[21]。LGG 已被證明可以激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB,它是先天免疫反應的中心激活劑之一[22]。補充益生菌有望逆轉(zhuǎn)腸道微生物群的表型,從而改善健康狀況[23]。姜黃素(Curcumin)是從姜黃(Curcuma longa)根莖中分離出來的一種天然多酚類化合物[24]。它有許多生物活性,包括抗氧化、抗病毒、抗炎和抗菌[25]。實驗[26]證明,姜黃素通過各種細胞信號通路對氧化應激相關(guān)肝病表現(xiàn)出預防和治療作用。

        本實驗采用蛋氨酸膽堿缺乏飲食建造MAFLD大鼠模型,以姜黃素及鼠李糖乳桿菌進行干預,通過觀察姜黃素、鼠李糖乳桿菌及兩者聯(lián)合對MAFLD大鼠的治療效果,檢測大鼠血清LPS、TNF-α、IL-6 及肝組織TLR4、NF-κBp65、MyD88 表達量,來探討潛在作用機制。蛋氨酸膽堿缺乏飲食促進MAFLD發(fā)生發(fā)展的主要機制為:一為極低密度脂蛋白(VLDL)合成減少和向外周分泌的減少,二為蛋氨酸與膽堿缺乏使抗氧化劑合成減少[14]。在本研究中,經(jīng)姜黃素及鼠李糖乳桿菌干預后,大鼠肝細胞脂肪變均有減輕,各干預組肝細胞結(jié)構(gòu)排列更加整齊,脂滴減少,肝指數(shù)下降,血清轉(zhuǎn)氨酶及炎性因子水平降低,肝甘油三酯及肝組織TLR4、NFκBp65、MyD88 的表達下調(diào)。上述結(jié)果表明,鼠李糖乳桿菌及姜黃素可減輕MAFLD 大鼠肝損傷及脂質(zhì)沉積,可能與調(diào)節(jié)TLR4 信號通路,降低TLR4通路下游的炎性因子的表達有關(guān),有望為MAFLD臨床治療提供一種新的治療選擇。

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