徐子媛 張九娜 孟燦燦 程燕 郭永澤 李校天

1河北工程大學臨床醫(yī)學院（河北邯鄲 056000）；2河北工程大學附屬醫(yī)院（河北邯鄲 056000）

代謝相關(guān)脂肪性肝病（metabolic associated fatty liver disease，MAFLD）曾經(jīng)被稱為非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）［1］，是全球各地肝病相關(guān)死亡的重要原因［2］。近年來隨著生活方式和飲食習慣的改變，該病的發(fā)病率持續(xù)升高［3］，全球患病率為25.54%［4］，已經(jīng)成為了全球普遍關(guān)注的醫(yī)學和社會問題。從“一次打擊”學說到“多次打擊”學說，MAFLD 的發(fā)病機制尚未完全闡明，目前普遍接受的是“多次打擊”學說［5］，它的核心因素包括脂質(zhì)代謝紊亂、胰島素的抵抗和氧化應激反應［6］。隨著研究的深入，先天免疫的活化在MAFLD 進展中的作用被證實，Toll 樣受體途徑是其中關(guān)鍵的一環(huán)［7］，TLR4 信號通路可以誘導炎癥、介導氧化應激，在MAFLD 的發(fā)病機制中起到了關(guān)鍵性作用。除干預飲食及生活方式外，目前臨床尚無MAFLD 的國際批準治療藥。故本實驗通過研究鼠李糖乳桿菌及姜黃素對MAFLD 模型形成過程中TLR4 信號通路的影響，探討MAFLD形成的調(diào)節(jié)控制因素及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物SPF 級SD 雄性大鼠40 只，8～12 周齡，體重（160±20）g，由濟南彭越實驗動物繁育公司提供。分籠飼養(yǎng)于溫度及濕度適宜的情況下，不限制飲食和水，動物處置過程嚴格遵守河北工程大學醫(yī)學院生物醫(yī)學倫理委員會的規(guī)定。

1.1.2 藥品與試劑鼠李糖乳桿菌凍干粉購于鄭州百益寶生物技術(shù)銷售部，姜黃素羧甲基纖維素鈉購于大連美倫生物技術(shù)有限公司。所有藥物均置于4℃冰箱冷藏，每日灌胃前新鮮配制。脂多糖（LPS）、白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒，均購于杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。Toll 樣受體4（TLR4）、核因子-κBp65（NF-κBp65）、MyD88 和β-Actin 內(nèi)參抗體，均購于美國Santa 公司。

1.1.3 儀器全自動生化儀，美國貝克曼有限公司產(chǎn)品；酶標儀，賽伯樂儀器有限公司產(chǎn)品；蛋白電泳儀，美國伯樂公司產(chǎn)品；

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠分組40 只SD 雄性大鼠適應性喂養(yǎng)一周后隨機分為5 組：正常對照組（MCS）、模型對照組（MCD）、鼠李糖乳桿菌干預組（LGG）、姜黃素干預組（CUR）、鼠李糖乳桿菌聯(lián)合姜黃素干預組（LGG+CUR），每組8 只。

1.2.2 大鼠MAFLD 模型建立及干預模型對照組大鼠飼以蛋氨酸膽堿缺乏（methionine-cholinedeficient diet，MCD）飼料，該模型主要用于NAFLD治療藥物的篩選［8］，正常對照組大鼠飼以蛋氨酸膽堿充足（methionine-choline-suffficient diet，MCS）飼料。各干預組在MCD 飲食的基礎上，LGG 組每日以鼠李糖乳桿菌2.0×1010CFU/100 g/d 劑量溶液灌胃一次，CUR 組每日以姜黃素200 mg/（kg·d）劑量溶液灌胃一次，LGG+CUR 組每日以鼠李糖乳桿菌2.0 × 1010CFU/100（g·d）劑量溶液聯(lián)合姜黃素200 mg/（kg·d）劑量溶液灌胃一次。正常對照組和模型對照組每日同等量的蒸餾水灌胃。溶液為鼠李糖乳桿菌凍干粉、姜黃素和無菌蒸餾水現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.3 標本收集、處理和肝指數(shù)計算連續(xù)喂養(yǎng)4 周，每日觀察大鼠的進食、活動、生長、毛色等情況。造模結(jié)束后，次日清晨稱重，用100 g/L（10%）水合氯醛溶液0.5 mL/100 g 腹腔注射麻醉后，門靜脈取血，以4 000 r/min 離心5 min。血清分裝于1.5 mL 的離心管中，置于超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?；同時取出新鮮完整肝臟，去除肝臟包膜，迅速稱肝濕重，計算肝指數(shù)。另切取肝左葉的肝組織數(shù)塊，置于4%多聚甲醛液，做上標記，其余置于超低溫冰箱中保存，用于RT-PCR、Western-blot 等檢測。肝指數(shù)=肝濕重（g）/體重（g）×100%。

1.2.4 HE 染色法觀察肝組織病理形態(tài)將切片放入二甲苯（Ⅰ、Ⅱ溶液，各20 min），再放入無水乙醇（Ⅰ、Ⅱ溶液，5 min），入75%酒精中5 min，自來水沖洗。隨后入蘇木素染液染5 min，自來水沖洗，分化液分化，自來水沖洗，返藍，流動水洗。入85%、95%的酒精，各5 min。入伊紅染液5 min。依次放入無水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和二甲苯Ⅰ、Ⅱ中，各5 min，進行脫水透明。采用中性樹膠封片后，光學顯微鏡觀察，采集圖像。

1.2.5 全自動生化分析儀測血清轉(zhuǎn)氨酶及肝臟脂肪含量用全自動生化分析儀測大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、肝甘油三酯（liver triglycerides，TG）、肝膽固醇（liver cholesterol，TC）水平。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附法測血清炎性因子用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）法測定血清中脂多糖（LPS）、白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的含量，按照試劑盒提供的說明書嚴格進行。

1.2.7 RT-PCR 法測TLR4、NF-κBp65 和MyD88基因的表達量取大鼠肝組織100 mg，Trizol 法提取組織RNA，具體步驟按照試劑盒說明書操作，NanoDrop?ND-2000 儀器檢測提取RNA 的濃度及質(zhì)量，利用Prime-Script?RT Enzyme Mix 試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，加入擴增反應體系運用實時熒光定量PCR 法擴增，40 個循環(huán)反應結(jié)束后用2-ΔΔCt法進行相對定量分析，檢測基因mRNA 相對表達水平。以為β-Actin為內(nèi)參，引物序列見下表。

1.2.8 蛋白質(zhì)印跡法測TLR4、NF-κBp65和MyD88蛋白的表達量取大鼠肝組織100 mg，提取細胞總蛋白，各取60 μg 進行凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉、一抗封閉和二抗封閉后，用增強化學發(fā)光法曝光，顯影、定影和沖洗晾干后，掃描儀掃描蛋白條帶。以β-Actin 為內(nèi)參，以所測蛋白的灰度值/β-actin 的灰度值的比值為所測蛋白的相對表達量。

表1 引物序列表Tab.1 Primer sequence list

1.3 統(tǒng)計學處理采用統(tǒng)計學軟件SPSS 26.0 進行數(shù)據(jù)分析與整理，測量數(shù)據(jù)以（±s）表示。5 組間比較采用單因素ANOVA 分析，5 組間兩兩比較時采用t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況所有大鼠實驗過程中均沒有死亡，MCS組大鼠飲食良好，靈敏好動，毛發(fā)光潔；MCD組大鼠飲食減退，體重下降，反應遲鈍，毛發(fā)灰暗；LGG組、CUR組、LGG+CUR組大鼠一般情況較MCD組有所改善，LGG+CUR組一般情況接近MCS 組。

2.2 肝指數(shù)比較MCD 組大鼠較MCS 組肝指數(shù)明顯升高，兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；各干預組與MCD 組比較，肝指數(shù)均不同程度降低，聯(lián)合組降低最顯著，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示鼠李糖乳桿菌、姜黃素均可改善MAFLD 模型大鼠的肝指數(shù)，兩者聯(lián)合效果更佳。見表2。

表2 5 組大鼠肝指數(shù)的比較Tab.2 Comparison of the liver index in 5 groups of rats x±s

2.3 肝組織病理學變化比較正常對照組大鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)完整，細胞核分布均勻，且肝細胞大小一致；模型組大鼠出現(xiàn)明顯的彌漫性的肝細胞脂肪變性，細胞核大小不一；各干預組與模型組比較，均有不同程度的脂肪細胞浸潤，且脂肪變性程度和脂肪空泡數(shù)量均呈不同程度減少，見圖1。

圖1 顯微鏡下大鼠肝組織病理學變化比較（×200）Fig.1 Comparison of the pathological changes of liver tissue under microscope（×200）

2.4 血清轉(zhuǎn)氨酶及肝臟脂肪水平比較與MCS組比較，MCD 組大鼠血清ALT、AST、肝組織TG、TC明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；各干預組與MCD 組比較，血清ALT、AST、肝組織TG、TC 均有不同程度的降低，其中以LGG+CUR組最為明顯，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。該研究結(jié)果提示鼠李糖乳桿菌及姜黃素均可顯著改善MAFLD 模型大鼠肝功能、降低肝臟脂肪沉積，兩者聯(lián)合應用效果更佳。見表3。

表3 大鼠ALT、AST 和肝臟RG、TC 水平Tab.3 Serum ALT，AST and liver TG levels in rats x±s

2.5 血清炎性因子水平比較模型組與對照組相比，LPS、IL-6 和TNF-α 均明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。鼠李糖乳桿菌組、姜黃素組及鼠李糖乳桿菌聯(lián)合姜黃素組與模型組相比，LPS、IL-6 和TNF-α 均不同程度降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。提示鼠李糖乳桿菌、姜黃素均可降低MAFLD 大鼠炎性因子水平。見表4。

表4 大鼠LPS、IG-6 和TNF-α 水平Tab.4 Levels of the LPS，IL-6 and TNF-α in rat serue x±s

2.6 肝組織TLR4、NF-κB 和MyD88 基因的表達比較MCD 組大鼠與MCS 組相比，肝組織TLR4、NF-κB 和MyD88 基因的相對表達均明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；各干預組與MCD 組相比，TLR4、NF-κB 和MyD88 基因的相對表達的表達均不同程度降低，聯(lián)合組降低最明顯，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；提示鼠李糖乳桿菌、姜黃素均可降低MAFLD 大鼠肝組織TLR4、NF-κB 和MyD88 基因表達水平，且兩者聯(lián)合應用效果更佳。見表5。

表5 大鼠肝組織MyD88、NF-κB 和TLR4 的相對表達量Tab.5 The relative expression of MyD88、NF-κB and TLR4 genes in rat liver tissue ±s

表5 大鼠肝組織MyD88、NF-κB 和TLR4 的相對表達量Tab.5 The relative expression of MyD88、NF-κB and TLR4 genes in rat liver tissue ±s

注：MCD 與MCS 組比較，*P＜0.01；干預組與MCD 組比較，#P＜0.01；與CUR+LGG 組比較，▲P＜0.01

組別MCS MCD CUR LGG CUR+LGG MyD88 mRNA 0.92±0.12 3.41±0.23*2.38±0.12#▲2.38±0.13#▲1.57±0.14#NF-κB mRNA 1.05±0.07 3.17±0.10*2.19±0.09#▲2.20±0.09#▲1.81±0.06#TLR4 mRNA 1.06±0.09 3.38±0.16*2.37±0.15#▲2.40±0.15#▲1.79±0.10#

2.7 肝組織TLR4、NF-κB 和MyD88 蛋白的表達比較MCD 組大鼠與MCS 組相比，肝組織TLR4、NF-κB 和MyD88 蛋白的相對表達均明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；各干預組與MCD 組相比，TLR4、NF-κB 和MyD88 蛋白的相對表達的表達均不同程度降低，聯(lián)合組降低最明顯，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；提示鼠李糖乳桿菌、姜黃素均可降低MAFLD 大鼠肝組織TLR4、NF-κB 和MyD88 蛋白表達水平，且兩者聯(lián)合應用效果更佳。見表6、圖2。

表6 大鼠肝組織TLR4、NF-κB 和MyD88 的表達量Tab.6 The different expression of MyD88，NF-κB and TLR4 liver tissue ±s

表6 大鼠肝組織TLR4、NF-κB 和MyD88 的表達量Tab.6 The different expression of MyD88，NF-κB and TLR4 liver tissue ±s

注：MCD 組與MCS 組比較，*P＜0.01；干預組與MCD 組比較，#P＜0.01，與CUR+LGG 組比較，▲P＜0.01

組別MCS MCD CUR LGG CUR+LGG MyD88 蛋白0.93±0.09 3.24±0.19*2.64±0.19#▲2.67±0.11#▲1.56±0.18#NF-κBp65 蛋白1.04±0.28 3.05±0.19*2.49±0.17#▲2.48±0.23#▲1.53±0.07#TLR4 蛋白0.82±0.05 2.66±0.09*2.06±0.04#▲1.96±0.09#▲1.37±0.10#

圖2 大鼠肝組織TLR4、NF-κB 和MyD88 蛋白的表達Fig.2 The different expression of TLR4、NF-κB p65 and MyD88 in liver tissue

3 討論

TLR 是免疫系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)最早的模式識別受體（PRR），在固有免疫應答中識別病原微生物的病原相關(guān)的分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP），激活先天性免疫應答，還引起細胞因子的釋放［9］。TLR 廣泛分布于肝細胞、庫普弗細胞、肝星狀細胞、肝竇內(nèi)皮細胞和膽管內(nèi)皮細胞，其表達與PAMP的刺激有關(guān)［10］。常見的與代謝相關(guān)性脂肪性肝病有關(guān)的TLR 包括TLR2、TLR4、TLR5、TLR9，它們的配體分別是肽聚糖、脂多糖、鞭毛蛋白和細菌DNA［11-13］。TLR 介導的信號主要通過兩種途徑轉(zhuǎn)導，即“蛋白髓樣分化因子（MyD88）依賴性途徑”和“MyD88 非依賴性途徑”［14］。脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性桿菌細胞壁外層的主要成分，也稱內(nèi)毒素，是肝損傷中的一個重要因子，它能激發(fā)機體引起強烈的炎癥反應［15］。TLR4 是LPS的模式識別受體，表達于各種肝臟細胞中，通過MyD88 依賴途徑與LPS 結(jié)合并激活核因子-κB（NF-κB）通路，它的激活導致許多促炎、抗病毒，抗菌因子的產(chǎn)生［7］。實驗［16］發(fā)現(xiàn)，TLR4 基因缺陷和肝臟庫普弗細胞失活都能夠使高脂肪飲食誘導的NAFLD 模型小鼠肝臟功能障礙減輕，表明肝臟庫普弗細胞上TLR4 的表達是NAFLD 疾病進程的重要因素。TLR 信號在健康肝臟中被抑制，但是當病原微生物和細菌來源的分子被輸送到肝臟時被激活，產(chǎn)生抗菌和抗病毒細胞因子，如TNF-α、IL-β和干擾素［17］，這些細胞因子持續(xù)升高會損傷肝細胞。研究［18］證明在有NASH 的小鼠中，LPS 血清水平與對照小鼠相比有所增加，并且與核因子激活相關(guān)，使用TLR4 抑制劑治療導致患有NASH 的小鼠肝炎癥降低。所以，通過對TLR4 轉(zhuǎn)導途徑的合理干預，能夠?qū)AFLD產(chǎn)生改善作用。

益生菌可以調(diào)節(jié)腸道菌群，增加腸道有益細菌，減少有害細菌［19］。乳酸桿菌GG（LGG）是益生菌常用的菌株［20］，因為這些細菌可以通過產(chǎn)生乳酸和其他抗菌物質(zhì)來抑制革蘭氏陰性致病菌的擴張［21］。LGG 已被證明可以激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，它是先天免疫反應的中心激活劑之一［22］。補充益生菌有望逆轉(zhuǎn)腸道微生物群的表型，從而改善健康狀況［23］。姜黃素（Curcumin）是從姜黃（Curcuma longa）根莖中分離出來的一種天然多酚類化合物［24］。它有許多生物活性，包括抗氧化、抗病毒、抗炎和抗菌［25］。實驗［26］證明，姜黃素通過各種細胞信號通路對氧化應激相關(guān)肝病表現(xiàn)出預防和治療作用。

本實驗采用蛋氨酸膽堿缺乏飲食建造MAFLD大鼠模型，以姜黃素及鼠李糖乳桿菌進行干預，通過觀察姜黃素、鼠李糖乳桿菌及兩者聯(lián)合對MAFLD大鼠的治療效果，檢測大鼠血清LPS、TNF-α、IL-6 及肝組織TLR4、NF-κBp65、MyD88 表達量，來探討潛在作用機制。蛋氨酸膽堿缺乏飲食促進MAFLD發(fā)生發(fā)展的主要機制為：一為極低密度脂蛋白（VLDL）合成減少和向外周分泌的減少，二為蛋氨酸與膽堿缺乏使抗氧化劑合成減少［14］。在本研究中，經(jīng)姜黃素及鼠李糖乳桿菌干預后，大鼠肝細胞脂肪變均有減輕，各干預組肝細胞結(jié)構(gòu)排列更加整齊，脂滴減少，肝指數(shù)下降，血清轉(zhuǎn)氨酶及炎性因子水平降低，肝甘油三酯及肝組織TLR4、NFκBp65、MyD88 的表達下調(diào)。上述結(jié)果表明，鼠李糖乳桿菌及姜黃素可減輕MAFLD 大鼠肝損傷及脂質(zhì)沉積，可能與調(diào)節(jié)TLR4 信號通路，降低TLR4通路下游的炎性因子的表達有關(guān)，有望為MAFLD臨床治療提供一種新的治療選擇。