佘遠萍 李新

(1桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院，廣西 桂林 541001；2武漢大學人民醫(yī)院)

卵巢癌早期多無明顯癥狀，多數(shù)患者就診時已發(fā)生腹腔內(nèi)廣泛轉(zhuǎn)移，不滿足手術(shù)治療的適應(yīng)證或行手術(shù)治療獲益甚微〔1〕。既往臨床多采用化療治療腹腔內(nèi)廣泛轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者，但因卵巢癌以腹腔種植及局部蔓延為特征，行常規(guī)化療治療的效果仍不理想，無法殺滅微小癌灶〔2，3〕。腹腔熱化療(IPHC)作為腫瘤綜合治療的新手段，可更為有效地殺滅腹腔內(nèi)癌細胞，延長患者生存時間〔4〕。但卵巢癌患者預(yù)后不良風險仍較高，目前有關(guān)卵巢癌患者行IPHC治療的預(yù)后已有較多研究報道，但對于預(yù)后預(yù)測因子的研究報道尚且較少，不利于進一步改善卵巢癌患者治療措施，降低患者預(yù)后不良風險。持續(xù)探討卵巢癌患者預(yù)后不良的預(yù)測因子尤為必要。研究指出，血清人附睪蛋白(HE)4被證實與上皮性卵巢癌復發(fā)密切相關(guān)〔5〕。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)被證實與腫瘤負荷有關(guān)〔6〕。推測兩者均可能與卵巢癌患者IPHC預(yù)后不良發(fā)生密切相關(guān)，但目前尚無相關(guān)研究報道。本研究進一步建立卵巢癌大鼠模型，對卵巢癌大鼠進行IPHC治療，并分析血清HE4、VEGF水平預(yù)測卵巢癌大鼠IPHC預(yù)后的效能。

1 材料與方法

1.1實驗動物 經(jīng)動物實驗倫理審核并批準后，選取清潔級健康雌性SD大鼠(由動物實驗中心購買)45只，于恒溫(室溫維持22～25℃)動物房內(nèi)飼養(yǎng)，自由飲水及進食顆粒飼料，每隔12 h進行光照及黑暗交替處理；大鼠周齡5～13 w，平均(8.15±1.06)w；體重 0.13～0.30 kg，平均(0.23±0.03)kg。

1.2設(shè)備與儀器 順鉑20 ml購自江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司；胎牛血清；RPMI1640培養(yǎng)液；二氧化碳培養(yǎng)箱；免疫組化試劑盒；大鼠酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒；試劑盒、抗體、培養(yǎng)液及溶液等均購自Santa Cruz公司。北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司Fischer344大鼠低分化上皮性卵巢癌細胞株NuTu-19；飛利浦5500型彩色多普勒超聲顯像儀；北京真空電子技術(shù)總公司MH-1型微波熱療儀。

1.3細胞培養(yǎng) 于RPMI1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)中接種NuTu-19卵巢細胞株，于5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為37℃，培養(yǎng)24 h。

1.4建模及分組 成年雌性SD大鼠45只，進行常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，對大鼠進行編號，并行掛牌標記。隨機抽取15只作為空白對照組，剩余30只建立為卵巢癌模型，將培養(yǎng)的生長期NuTu-19細胞用胰酶消化液調(diào)整細胞計數(shù)為5×106/只，注射到30只大鼠腹腔中，繼續(xù)飼養(yǎng)3 w，于飼養(yǎng)期間定期記錄大鼠腹圍、體重等指標。將大鼠隨機分為模型組(15只)和IPHC組(15只)。

1.5IPHC治療 于建模后飼養(yǎng)3 w，對IPHC組實施IPHC治療，每次IPHC治療前，先緩慢抽取腹水，抽取量保持在6～8 ml，用生理鹽水將水溶型順鉑調(diào)配至濃度為0.83 μg/ml的溶液，向IPHC組腹腔灌注20 ml，灌注速度3～4 ml/min，用微波熱療儀在距離大鼠腹部10 cm處進行輻射，維持腹腔內(nèi)溫度在43℃，功率為25 W，共輻射30 min。模型組行腹腔灌注20 ml生理鹽水?？瞻讓φ战M不行任何干預(yù)，飼養(yǎng)3 w。模型組和IPHC組均干預(yù)1次/w，共干預(yù)3 w。

1.6血清HE4、VEGF水平檢測 于飼養(yǎng)3 w及干預(yù)結(jié)束時，檢測大鼠血清HE4、VEGF水平，于大鼠眼眶取血2 ml，1 000 r/min離心20 min，取血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測大鼠血清HE4、VEGF水平。

1.7預(yù)后評估 評估大鼠預(yù)后，于干預(yù)結(jié)束時處死大鼠，剖腹取卵巢，分離瘤體并稱重，計算抑瘤率，抑瘤率=〔(模型組瘤質(zhì)量-IPHC組瘤質(zhì)量)/模型組瘤質(zhì)量〕×100%。將抑瘤率<50%的大鼠5只劃為預(yù)后不良組，將抑瘤率≥50%的大鼠10只劃為預(yù)后良好組。分析血清HE4、VEGF水平預(yù)測卵巢癌大鼠IPHC預(yù)后的效能。

1.8統(tǒng)計學方法 采用SPSS24.0軟件進行SNK-q檢驗、t檢驗、單因素方差分析及回歸分析；繪制受試者工作特征(ROC)曲線，得到曲線下面積(AUC)，檢驗血清HE4、VEGF水平對IPHC預(yù)后不良的預(yù)測效能，AUC<0.50表示無預(yù)測效能，0.50≤AUC<0.70表示預(yù)測效能較低，0.70≤AUC<0.90表示預(yù)測效能中等，AUC≥0.90表示預(yù)測效能高。

2 結(jié) 果

2.1模型驗證結(jié)果及脫出情況 建模3 w后，行彩超檢查，可見大鼠卵巢有惡性腫瘤病灶，穿刺取卵巢組織標本，經(jīng)病理學檢查證實為卵巢癌，建模成功。大鼠研究期間均無病死及意外死亡。

2.2飼養(yǎng)3 w及干預(yù)結(jié)束時3組血清HE4、VEGF水平比較 飼養(yǎng)3 w時，模型組及IPHC組血清HE4、VEGF水平高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；干預(yù)結(jié)束時，3組間血清HE4、VEGF水平由高到低為模型組、IPHC組、空白對照組，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 飼養(yǎng)3 w及干預(yù)結(jié)束時3組血清HE4、VEGF水平比較

2.3預(yù)后不良組與預(yù)后良好組飼養(yǎng)3 w血清HE4、VEGF水平比較 預(yù)后不良組飼養(yǎng)3 w血清HE4、VEGF水平〔(36.71±7.06)pmol/ml、(0.52±0.13)pg/ml〕高于預(yù)后良好組〔(27.77±7.13)pmol/ml、(0.37±0.07)pg/ml〕，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.296、2.991，P=0.039、0.010)。

2.4回歸分析血清HE4、VEGF水平與IPHC預(yù)后的關(guān)系 將大鼠飼養(yǎng)3 w血清HE4、VEGF水平納入作為自變量，將卵巢癌大鼠預(yù)后情況作為因變量(1=預(yù)后不良，0=預(yù)后良好)；經(jīng)回歸分析檢驗結(jié)果顯示，飼養(yǎng)3 w血清HE4、VEGF高水平是IPHC預(yù)后不良發(fā)生的危險因素(OR>1，P<0.05)。見表2。

2.5血清HE4、VEGF水平預(yù)測IPHC預(yù)后的ROC曲線結(jié)果 將大鼠飼養(yǎng)3 w血清HE4、VEGF水平納入作為檢驗變量，將卵巢癌大鼠預(yù)后情況作為狀態(tài)變量(1=預(yù)后不良，0=預(yù)后良好)，繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn)，血清HE4、VEGF水平用于預(yù)測IPHC預(yù)后不良的AUC均>0.80，均有一定預(yù)測價值，見表3，圖1。

表2 回歸分析檢驗血清HE4、VEGF水平與IPHC預(yù)后的關(guān)系

表3 血清HE4、VEGF水平預(yù)測IPHC預(yù)后的ROC曲線結(jié)果

圖1 血清HE4、VEGF水平預(yù)測IPHC預(yù)后的ROC曲線

3 討 論

研究報道，IPHC可經(jīng)腫瘤局部加溫，使腫瘤組織溫度升高，通過熱能殺滅腫瘤細胞，并結(jié)合化療藥物，發(fā)揮協(xié)同作用，改變毛細血管血流灌注，增強藥物的局部療效，進而可殺滅區(qū)域內(nèi)腫瘤細胞，去除微小癌灶，并預(yù)防病灶轉(zhuǎn)移〔7，8〕。相關(guān)研究還報道，行IPHC治療對正常組織的影響較小，治療安全性高，有良好的臨床應(yīng)用前景〔9〕。

但多方研究結(jié)果顯示，IPHC可有效控制患者腹腔積液，促使患者達到疾病穩(wěn)定狀態(tài)，延長患者生存時間，但患者遠期無進展生存率仍不理想〔10，11〕。說明卵巢癌患者行IPHC治療仍有一定預(yù)后不良風險，探討相關(guān)預(yù)測因子，可作為臨床治療卵巢癌的新干預(yù)靶點。本研究結(jié)果說明卵巢癌大鼠血清HE4、VEGF水平呈現(xiàn)表達上調(diào)，經(jīng)IPHC干預(yù)后，大鼠血清HE4、VEGF水平降低，可能與卵巢癌病情有關(guān)。經(jīng)回歸分析結(jié)果顯示，飼養(yǎng)3 w血清HE4、VEGF高水平是IPHC預(yù)后不良發(fā)生的危險因素，分析原因，HE4主要在上呼吸道、乳腺上皮、結(jié)腸黏膜中表達，且表達水平較低，正常情況下，卵巢表面黏膜上皮中無HE4表達，而在卵巢癌患者中，卵巢組織HE4基因表達上調(diào)，卵巢表面黏膜上皮可分泌過量HE4，并可釋放到外周血中，造成血清HE4水平升高〔12〕。目前HE4已被作為卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌等婦科腫瘤的腫瘤標志物，但有關(guān)HE4在卵巢癌中的作用尚未明確，分析細胞學研究指出HE4表達上調(diào)時，可編碼及分泌小分子蛋白，調(diào)控腫瘤相關(guān)分子通路，通過上調(diào)ERK/MAPK、PI3K/AKT信號通路，抑制腫瘤凋亡，提高腫瘤細胞耐藥性，進而增強腫瘤惡性生物學行為，促使腫瘤細胞增殖、侵襲，增加轉(zhuǎn)移風險〔13〕。此外，HE4表達上調(diào)時，可結(jié)合配體，通過磷酸化介導細胞信號傳遞，促進腫瘤細胞生長及分裂，并提高微管穩(wěn)定性，可進一步提高腫瘤細胞耐藥性，增加治療難度〔14〕。因此血清HE4表達上調(diào)時，卵巢癌大鼠行IPHC治療后仍有較高預(yù)后不良風險。外周血VEGF在正常情況下也處于較低水平，而在腫瘤患者中，因腫瘤生長到一定體積，其內(nèi)腫瘤細胞距離血管系統(tǒng)較遠，處于缺氧狀態(tài)，可導致VEGF分泌增加，進而釋放到外周血中〔15〕。在VEGF表達上調(diào)后，可通過結(jié)合受體，促使單核細胞、促巨噬細胞及造血干細胞遷移，促進血管通透性增加，并介導淋巴及血管生成，為腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移創(chuàng)造良好條件〔16，17〕。因此血清VEGF表達上調(diào)時，腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移風險高，行IPHC治療的獲益較差，預(yù)后不良風險高。

基于上述分析，推測血清HE4、VEGF水平可用于預(yù)測IPHC預(yù)后不良風險，繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn)，血清HE4、VEGF水平用于預(yù)測IPHC預(yù)后不良有一定預(yù)測價值，證實推測成立。臨床可將血清HE4、VEGF水平作為卵巢癌的新治療靶點，研究新型化療藥物用于卵巢癌治療中；并可對治療前血清HE4、VEGF水平較高的卵巢癌患者，實施瘤體減滅術(shù)治療或放療治療，以進一步提高患者獲益〔18〕。而因本研究未能觀察大鼠免疫水平、炎癥因子水平，結(jié)論尚有局限，未來還應(yīng)增加多項指標觀察，進一步分析IPHC預(yù)后的有效預(yù)測因子，并將所得因子在卵巢癌患者中推廣應(yīng)用。

綜上，卵巢癌大鼠血清HE4、VEGF水平呈現(xiàn)表達上調(diào)，與卵巢癌大鼠IPHC預(yù)后有關(guān)，并可作為預(yù)后預(yù)測指標，臨床可進一步將血清HE4、VEGF水平用于卵巢癌大鼠預(yù)后預(yù)測中，為卵巢癌的針對性治療提供依據(jù)。