張露 趙芳 楊萬舉 項(xiàng)奕

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市中心醫(yī)院眼科，湖北 武漢 430030)

糖尿病白內(nèi)障的發(fā)生與晶狀體上皮細(xì)胞損傷有關(guān)，高血糖條件下，晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生氧化損傷和細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致晶狀體上皮細(xì)胞功能缺失〔1,2〕。蝦青素是一種萜烯類化合物，屬于類胡蘿卜素，蝦青素在自然界內(nèi)廣泛分布，有清除氧自由基、抗衰老、提高免疫力、抗腫瘤等作用〔3〕。蝦青素有保護(hù)視力的作用，其可改善視網(wǎng)膜損傷，蝦青素預(yù)處理減少視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞氧化損傷〔4〕。研究表明，蝦青素能保護(hù)晶狀體上皮細(xì)胞損傷，其可抑制紫外線誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞凋亡〔5〕。蝦青素處理后，高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞氧化損傷和細(xì)胞凋亡水平均下降〔6〕?，F(xiàn)階段對(duì)蝦青素在高糖條件下晶狀體上皮細(xì)胞損傷中的作用還不明確。本研究探討蝦青素預(yù)處理對(duì)糖尿病晶狀體上皮細(xì)胞損傷的作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 蝦青素購自北京索萊寶科技有限公司；Notch1抗體、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體、Notch1受體胞內(nèi)結(jié)合域(NICD)1抗體購自美國(guó)Invitrogen；丙二醛(MDA)含量檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)含量檢測(cè)試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；Bcl-2抗體、發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子(Hes)1抗體購自碧云天生物技術(shù)有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)含量檢測(cè)試劑盒購自上海超研生物科技有限公司；過氧化氫酶(CAT)含量檢測(cè)試劑盒購自上海古朵生物科技有限公司；人晶狀體上皮細(xì)胞系(SRA01/04)購自通派(上海)生物科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)分組 晶狀體上皮細(xì)胞用含有100 μg/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素的DMEM培養(yǎng)，培養(yǎng)液中添加10%的胎牛血清，培養(yǎng)條件為：37℃，5% CO2培養(yǎng)箱。晶狀體上皮細(xì)胞共分成5組：(1)對(duì)照組：正常培養(yǎng)；(2)HG組：在實(shí)驗(yàn)0 h時(shí)以30 mmol/L〔2〕的葡萄糖細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)；(3)實(shí)驗(yàn)-L組：在實(shí)驗(yàn)開始前24 h，以4 μg/L的蝦青素細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)預(yù)處理，然后在實(shí)驗(yàn)0 h時(shí)，添加30 mmol/L的葡萄糖繼續(xù)培養(yǎng)；(4)實(shí)驗(yàn)-M組：在實(shí)驗(yàn)開始前24 h，以8 μg/L的蝦青素細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)預(yù)處理，然后在實(shí)驗(yàn)0 h時(shí)，添加30 mmol/L的葡萄糖繼續(xù)培養(yǎng)；(5)實(shí)驗(yàn)-H組：在實(shí)驗(yàn)開始前24 h，以16 μg/L的蝦青素細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)預(yù)處理，然后在實(shí)驗(yàn)0 h時(shí)，添加30 mmol/L的葡萄糖繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3CCK-8測(cè)定細(xì)胞增殖 晶狀體上皮細(xì)胞分別按照每孔中添加3 000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板內(nèi)，然后按照各組分組方法處理培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱內(nèi)取出，添加CCK-8溶液各10 μl，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm的A值，A值越大，細(xì)胞增殖活性越強(qiáng)。

1.4流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定凋亡 收集各組培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)添加磷酸鹽緩沖液(PBS)，1 000 r/min離心10 min，將上清溶液棄掉，在細(xì)胞內(nèi)分別添加300 μl的結(jié)合緩沖液，充分混合以后，分別添加10 μl的碘化丙啶(PI)和5 μl的Annexin V-FITC溶液，置于避光條件下結(jié)合15 min，以流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡變化。

1.5檢測(cè)細(xì)胞中MDA、SOD、GSH-Px、CAT水平 收集各組培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞，以MDA含量檢測(cè)試劑盒、SOD含量檢測(cè)試劑盒、GSH-Px含量檢測(cè)試劑盒、CAT含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定MDA、SOD、GSH-Px、CAT水平，步驟同試劑盒說明書。

1.6Western印跡檢測(cè)Bax、Bcl-2、Notch1、NICD1、Hes1蛋白表達(dá) 收集各組培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞，用含苯甲基磺酰氟(PMSF)的放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，蛋白濃度檢測(cè)按照常規(guī)二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定。在蛋白樣品內(nèi)添加2×上樣緩沖液，充分混合，放在100℃中反應(yīng)5 min。本次實(shí)驗(yàn)采用10%的分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，每個(gè)孔內(nèi)蛋白樣品的上樣量為40 μg，首先以90 V的電壓在濃縮膠中電泳，然后以100 V的電壓在分離膠中電泳，電泳結(jié)束以后，取出凝膠，在4℃條件下，以60 V的電壓進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束以后，將NC膜取出，放在含有5%脫脂奶粉的TBST溶液中，室溫結(jié)合2 h，然后將NC膜放在含有稀釋后的一抗溶液中，在4℃環(huán)境中過夜，最后將NC膜放在含有1∶2 000稀釋的二抗溶液中，在室溫中結(jié)合2 h。電化學(xué)(ECL)發(fā)光法顯色，內(nèi)參為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，分析目的蛋白表達(dá)變化。Bax、Bcl-2、Notch1、NICD1、Hes1一抗分別按照1∶600、1∶600、1∶800、1∶1 000、1∶1 000稀釋。

1.7Notch信號(hào)激活劑對(duì)蝦青素影響細(xì)胞增殖、凋亡和MDA、SOD、GSH-Px、CAT水平作用 晶狀體上皮細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)開始前24 h，以8 μg/L的蝦青素和500 μg/L的Notch信號(hào)激活劑Jagged1細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)預(yù)處理，然后在實(shí)驗(yàn)0 h時(shí)，添加30 mmol/L的葡萄糖繼續(xù)培養(yǎng)，記為實(shí)驗(yàn)-M+Jagged1組，以實(shí)驗(yàn)-M組作為參照，分析細(xì)胞增殖(CCK-8法步驟同1.3)、凋亡(流式細(xì)胞術(shù)步驟同1.4)和Bax、Bcl-2、Notch1、NICD1、Hes1蛋白表達(dá)(Western印跡步驟同1.6)及MDA、SOD、GSH-Px、CAT水平(步驟同1.5)。

1.8造模及分組 按照參考文獻(xiàn)〔1〕造模方法制備白內(nèi)障小鼠模型， 蝦青素組小鼠在造模的同時(shí)給予蝦青素灌胃，灌胃劑量為0.24 g/kg，每天灌胃1次，直到造模結(jié)束。取小鼠晶狀體組織，檢測(cè)晶狀體混濁程度。晶狀體混濁程度評(píng)分標(biāo)注參照文獻(xiàn)〔1〕。對(duì)照組和蝦青素組每組9只小鼠。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1蝦青素預(yù)處理對(duì)高糖作用下晶狀體上皮細(xì)胞增殖影響 0、4、8、16 μg/L蝦青素處理后的晶狀體上皮細(xì)胞增殖活性(0.66±0.05、0.63±0.05、0.64±0.07、0.62±0.06)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與對(duì)照組晶狀體上皮細(xì)胞增殖活性(0.67±0.05)比較，HG組(0.25±0.03)顯著下降(P<0.05)；與HG組比較，實(shí)驗(yàn)-L、實(shí)驗(yàn)-M、實(shí)驗(yàn)-H組晶狀體上皮細(xì)胞增殖活性(0.35±0.04、0.49±0.05、0.62±0.06)依次升高(P<0.05)。表明蝦青素預(yù)處理提高高糖作用下晶狀體上皮細(xì)胞增殖活性。

2.2蝦青素預(yù)處理對(duì)高糖作用下晶狀體上皮細(xì)胞凋亡影響 與對(duì)照組比較，HG組晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率顯著升高，細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)；與HG組比較，實(shí)驗(yàn)-L、實(shí)驗(yàn)-M、實(shí)驗(yàn)-H組晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率逐漸降低，細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)水平逐漸降低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平逐漸升高(P<0.05)。見圖1、圖2、表1，表明蝦青素預(yù)處理抑制高糖作用下晶狀體上皮細(xì)胞凋亡。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡

圖2 Western印跡檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

表1 蝦青素預(yù)處理后高糖作用下晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率和Bax、Bcl-2蛋白水平

2.3蝦青素預(yù)處理對(duì)高糖作用下晶狀體上皮細(xì)胞中MDA、SOD、GSH-Px、CAT水平影響 與對(duì)照組比較，HG組晶狀體上皮細(xì)胞MDA水平顯著升高，SOD、GSH-Px、CAT水平顯著下降(P<0.05)；與HG組比較，實(shí)驗(yàn)-L、實(shí)驗(yàn)-M、實(shí)驗(yàn)-H組晶狀體上皮細(xì)胞MDA水平逐漸降低，SOD、GSH-Px、CAT水平逐漸升高(P<0.05)。見表2。表明蝦青素預(yù)處理抑制高糖作用下晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷。

2.4蝦青素預(yù)處理對(duì)高糖作用下晶狀體上皮細(xì)胞中Notch信號(hào)通路影響 與對(duì)照組比較，HG組晶狀體上皮細(xì)胞Notch1、NICD1、Hes1水平顯著升高(P<0.05)；與HG組比較，實(shí)驗(yàn)-L、實(shí)驗(yàn)-M、實(shí)驗(yàn)-H組晶狀體上皮細(xì)胞Notch1、NICD1、Hes1水平逐漸降低(P<0.05)。見表2、圖3，表明蝦青素預(yù)處理抑制高糖作用下晶狀體上皮細(xì)胞中Notch信號(hào)通路激活。

表2 蝦青素預(yù)處理后高糖作用下晶狀體上皮細(xì)胞中MDA、SOD、GSH-Px、CAT、Notch1、NICD1、Hes1水平

圖3 Western印跡檢測(cè)蝦青素處理后高糖作用下晶狀體上皮細(xì)胞中Notch1、NICD1、Hes1蛋白表達(dá)

2.5Notch信號(hào)通路激活劑對(duì)蝦青素預(yù)處理影響高糖作用下晶狀體上皮細(xì)胞中Notch信號(hào)通路作用 與實(shí)驗(yàn)-M組比較，實(shí)驗(yàn)-M+Jagged1組晶狀體上皮細(xì)胞Notch1、NICD1、Hes1水平顯著升高(P<0.05)。見圖4，表3。

圖4 Western印跡檢測(cè)Notch1、NICD1、Hes1蛋白表達(dá)

表3 Notch信號(hào)激活劑和蝦青素預(yù)處理后高糖作用下晶狀體上皮細(xì)胞中Notch1、NICD1、Hes1蛋白水平

2.6Notch信號(hào)通路激活劑對(duì)蝦青素預(yù)處理影響高糖作用下晶狀體上皮細(xì)胞增殖、凋亡和MDA、SOD、GSH-Px、CAT作用 與實(shí)驗(yàn)-M組比較，實(shí)驗(yàn)-M+Jagged1組晶狀體上皮細(xì)胞增殖活性顯著降低，凋亡率顯著升高，Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，MDA水平顯著升高，SOD、GSH-Px、CAT水平顯著下降(P<0.05)。見圖5、表4。

圖5 檢測(cè)Notch信號(hào)激活劑對(duì)蝦青素預(yù)處理影響高糖作用下晶狀體上皮細(xì)胞凋亡和Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

表4 Notch信號(hào)激活劑和蝦青素預(yù)處理后高糖作用下晶狀體上皮細(xì)胞增殖活性、凋亡率和Bax、Bcl-2蛋白水平及MDA、SOD、GSH-Px、CAT水平

2.7蝦青素對(duì)糖尿病白內(nèi)障小鼠晶狀體混濁程度的影響 對(duì)照組晶狀體混濁程度Ⅰ度9例，Ⅱ、Ⅲ度均0例，蝦青素組Ⅰ度6例，Ⅱ度3例，Ⅲ度均0例。兩組糖尿病白內(nèi)障小鼠晶狀體混濁程度嚴(yán)重，且蝦青素組晶狀體混濁程度較對(duì)照組明顯減弱。

3 討 論

糖尿病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，糖尿病患者病程較長(zhǎng)，長(zhǎng)期的高血糖可誘導(dǎo)多種并發(fā)癥發(fā)生，糖尿病白內(nèi)障是糖尿病引起常見的眼部疾病〔7〕。晶狀體上皮細(xì)胞是糖尿病白內(nèi)障的重要靶細(xì)胞，其在高糖刺激下發(fā)生氧化損傷和細(xì)胞凋亡，這也是目前發(fā)現(xiàn)的糖尿病白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制之一〔8〕。正常情況下，存在于機(jī)體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)和氧化系統(tǒng)處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，而當(dāng)抗氧化酶活性下降，而機(jī)體內(nèi)氧自由基不斷產(chǎn)生時(shí)，細(xì)胞內(nèi)過量的氧自由基可誘導(dǎo)脂質(zhì)發(fā)生過氧化，造成細(xì)胞損傷〔9〕。SOD、GSH-Px、CAT是存在于機(jī)體內(nèi)的抗氧化酶，其活性下降可誘導(dǎo)氧化損傷〔10〕。MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其表達(dá)水平異常升高是氧化損傷的標(biāo)志之一〔11〕。研究表明，細(xì)胞內(nèi)過量的氧自由基可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞損傷發(fā)生〔12〕。Bcl-2蛋白家族是與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切的調(diào)控因子，其含有多個(gè)成員，分別在細(xì)胞凋亡進(jìn)展中發(fā)揮促進(jìn)和抑制作用，Bax是Bcl-2蛋白家族中的促凋亡蛋白，Bcl-2是Bcl-2蛋白家族中的抑凋亡蛋白〔13〕。本研究結(jié)果提示高糖誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞損傷，說明構(gòu)建了晶狀體上皮細(xì)胞損傷模型。

蝦青素是一種從藻類、真菌、蝦蟹外殼中提取出來的紅色類胡蘿卜素，其有降低血壓、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、延緩衰老、保護(hù)視力、增加免疫力等功效〔14〕。研究發(fā)現(xiàn)，蝦青素能抑制紫外線誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞損傷〔5〕。蝦青素還能改善糖尿病大鼠血管內(nèi)皮功能障礙，減少血管氧化損傷〔15〕。蝦青素預(yù)處理后的糖尿病腎小管上皮細(xì)胞凋亡水平下降〔6〕。蝦青素能預(yù)防糖尿病白內(nèi)障發(fā)生〔16〕。本研究結(jié)果提示蝦青素預(yù)處理能通過抑制細(xì)胞凋亡和氧化損傷發(fā)揮抗糖尿病白內(nèi)障作用。

Notch是一個(gè)高度保守的信號(hào)通路，由跨細(xì)胞膜配體、受體及下游信號(hào)等組成，Notch1是Notch信號(hào)的受體之一，Hes1是Notch的下游效應(yīng)因子，NICD1是Notch信號(hào)活化后的形式〔17,18〕。Notch信號(hào)有調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡及氧化應(yīng)激等作用〔19,20〕。研究顯示，Notch與糖尿病并發(fā)癥有關(guān)，在糖尿病腎病發(fā)生過程中，人們發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)病理性激活，影響腎纖維化、足細(xì)胞損傷發(fā)生〔21～23〕。研究表明，Notch在高糖誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞中過度激活，并且抑制Notch信號(hào)可減少高糖誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞損傷〔24〕。本研究結(jié)果說明蝦青素作用機(jī)制可能與Notch信號(hào)有關(guān)。激活Notch信號(hào)可逆轉(zhuǎn)蝦青素預(yù)處理對(duì)高糖條件下晶狀體上皮細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的抑制作用，充分證實(shí)蝦青素作用機(jī)制與Notch信號(hào)有關(guān)。

綜上，蝦青素預(yù)處理能改善高糖誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞損傷，減少細(xì)胞凋亡和氧化損傷，機(jī)制與抑制Notch信號(hào)有關(guān)，蝦青素可能是預(yù)防和治療糖尿病白內(nèi)障的途徑之一。