婁滿 高春燕 王宏業(yè)

(哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院 1老年病一科，河北 衡水 053000;2中醫(yī)科)

高血壓與心血管不良事件的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。一份流行病學(xué)報(bào)告顯示，2010年全世界31.1%(13.9億人)的成年人患有高血壓。高血壓增加了相關(guān)器官損害的風(fēng)險(xiǎn)，如高血壓性心臟病(HHD)、高血壓性腦病和腎硬化〔1〕。根據(jù)弗雷明翰心臟研究，收縮壓增加20 mmHg導(dǎo)致56%的心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)增加〔2〕。此外,高血壓引起以心肌纖維化為特征的心臟重塑，導(dǎo)致心力衰竭進(jìn)展〔3〕。

MicroRNAs(miRs)是一種小的(約22個(gè)核苷酸長(zhǎng))非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控基因表達(dá)〔4〕。研究表明，由細(xì)胞釋放的miRs在外體(直徑40～100 nm的小膜囊泡)中可被吸收并調(diào)節(jié)鄰近器官和組織中的受體細(xì)胞反應(yīng)〔5〕。在人類和動(dòng)物中已經(jīng)證實(shí)了幾種miR的失調(diào)參與高血壓，但是選擇哪種miR作為高血壓靶點(diǎn)是重要研究挑戰(zhàn)〔6〕。

內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)是NOS的一種同功酶，可合成納米量的一氧化氮(NO)；其他NOS同功酶包括神經(jīng)元型(n)NOS、誘導(dǎo)型(i)NOS和細(xì)菌型(b)NOS〔7〕。eNOS磷酸化通過(guò)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)-γ-eNOS、氧化應(yīng)激和烏苷酸結(jié)合蛋白(Rho)激酶途徑、血管生成素相關(guān)生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的缺氧局灶黏附激酶(FAK)磷酸化或磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(PKB，Akt)信號(hào)途徑調(diào)節(jié)NO合成〔7〕。NO是由L-精氨酸通過(guò)eNOS磷酸化形成的，在調(diào)節(jié)血壓方面起重要作用〔8〕。合成的NO刺激平滑肌細(xì)胞(SMC)中NO的受體可溶性鳥苷環(huán)化酶(sGC)，從而將鳥苷三磷酸(GTP)轉(zhuǎn)化為環(huán)鳥苷一磷酸(cGMP)〔9〕。sGC的激活通過(guò)NO-cGMP信號(hào)導(dǎo)致血管舒張。PI3K/Akt/eNOS信號(hào)途徑對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞NO生成的內(nèi)皮功能影響是眾所周知的〔8〕。然而，目前還沒有研究報(bào)道m(xù)iR-615-5p通過(guò)eNOS磷酸化對(duì)NO合成的影響。本研究探討miR-615-5p在高血壓患者血清中表達(dá)及其潛在的調(diào)控機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取100例原發(fā)性高血壓患者為高血壓組，入選標(biāo)準(zhǔn)：收縮壓≥140 mmHg和(或)舒張壓≥90 mmHg，最近4 w未服用降壓藥。另外選取收縮壓<140 mmHg和舒張壓<90 mmHg的患者(骨質(zhì)疏松18例、前列腺增生10例、慢性腸炎15例、胃食管反流12例、甲狀腺結(jié)節(jié)23例、輕度貧血8例、胃炎胃潰瘍14例)100例為正常組。排除標(biāo)準(zhǔn)：繼發(fā)性高血壓，肝、腎等功能損傷者；合并患有糖尿病、婦科病、腫瘤、腦血管疾病、嚴(yán)重感染者；半年內(nèi)有重大手術(shù)或者重大創(chuàng)傷者；冠心病者(對(duì)左冠狀動(dòng)脈主干、前降支、回旋支及右冠狀動(dòng)脈狹窄程度進(jìn)行評(píng)價(jià)，以任何冠脈狹窄≥50%為診斷標(biāo)準(zhǔn))?；颊呔炇鹬橥鈺⒔?jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 血管內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1，在37℃、5%CO2環(huán)境下被培養(yǎng)，在添加2%胎牛血清(FBS)的DMEM中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)采用活性條件下的第三代至第六代細(xì)胞。miR-615-5p、simiR-615-5p和Negative質(zhì)粒用Lipofectamine3000 轉(zhuǎn)染細(xì)胞。48 h后用于實(shí)驗(yàn)。

1.3熒光素酶檢測(cè) 將含miR-615-5p結(jié)合位點(diǎn)的Akt序列的3′非翻譯區(qū)(UTR)插入pmiR-RB報(bào)告載體(ribbio)的XhoI和NotI限制位點(diǎn)。使用Lipofectamine3000將熒光素酶報(bào)告載體與miR-615-5p和Negative共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48 h，Synergy H4酶標(biāo)儀(BioTek，Winooski，VT，USA)被用于檢測(cè)熒光素酶活性。

1.4CCK8檢測(cè)和Edu染色 用CCK8檢測(cè)細(xì)胞活力。HMEC-1 細(xì)胞(1×104個(gè)/ml加入96孔板中)使用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染相關(guān)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后，CCK8(終濃度10-5mol/L)被加入細(xì)胞再培養(yǎng)30 min。轉(zhuǎn)染48 h后，50 μmol/L Edu〔0.5% TritonX-100的磷酸鹽緩沖液(PBS)〕孵育30 min，PBS 清洗1次，5 min。用熒光顯微鏡觀察。

1.5定量實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)mRNA表達(dá) RNAiso PLUS(TAKARA-Korea Biomedical Co.)用于分離總RNA，用LeGene Premium Express(TAKARA-Korea Biomedical Co.)合成cDNA。SYBR Green(TAKARA-Korea Biomedical Co.)被用于qRT-PCR，循環(huán)條件如下：95℃下3 min，然后在95℃下孵育30 s，61℃下孵育50 s，72℃下孵育1 min。

1.6Western印跡 HMEC-1 細(xì)胞用RIPA裂解緩沖液裂解，細(xì)胞裂解物在4℃下以13 000 r/min離心20 min后，上清液用作細(xì)胞蛋白樣品。蛋白質(zhì)樣品(50 μg/條帶)經(jīng)10%凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。在室溫下，用5%脫脂干脫脂乳在TBST中封閉1 h。然后，在4℃條件下，用一抗體：p-Akt，p-eNOS和GAPDH孵育過(guò)夜。用TBST沖洗5次，30 min后，用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)結(jié)合的二級(jí)抗體(稀釋液：1∶2 000)室溫60 min，用TBST沖洗5次30 min。用電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑觀察免疫反應(yīng)蛋白-抗體復(fù)合物，并用發(fā)光圖像分析儀(LAS-4000；富士膠片，日本東京)掃描。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SAS9.4軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組一般資料比較 兩組治療前24 h平均收縮壓及24 h平均舒張壓差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余資料差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.2miR-615-5p 在高血壓患者血清中表達(dá) miR-615-5p 在高血壓組血清中的表達(dá)(7.65±1.46)顯著高于正常組(1.00±0.12，P<0.05)。miR-615-5p與右心室收縮壓(RVSP)及右心室肥厚指數(shù)〔RV/(LV+S)〕呈正相關(guān)(r=9.35,P=0.012;r=9.568,P=0.021)，見圖1。

表1 兩組一般資料比較

圖1 miR-615-5p與RVSP及RV/(LV+S)的相關(guān)性

2.3miR-615-5p 調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖 在體外模型中，過(guò)表達(dá)miR-615-5p質(zhì)粒明顯上調(diào)miR-615-5p血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)(P<0.05)，見表2。上調(diào)miR-615-5p明顯抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，明顯增加Edu細(xì)胞比例(均P<0.05)，見表2、圖2。在體外模型中，simiR-615-5p質(zhì)粒明顯下調(diào)miR-615-5p血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)(P<0.05)，見表3。下調(diào)miR-615-5p明顯促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，明顯減少Edu細(xì)胞比例(均P<0.05)，見圖2、表3。

表2 miR-615-5p 調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、caspase-3、caspase-9活性表達(dá)及p-Akt和p-eNOS蛋白表達(dá)

表3 simiR-615-5p調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和caspase-3/9活性表達(dá)及p-Akt和p-eNOS蛋白表達(dá)

2.4miR-615-5p 調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞caspase-3/9活性表達(dá) 在體外模型中，上調(diào)miR-615-5p明顯激活caspase-3/9活性表達(dá)水平；下調(diào)miR-615-5p明顯抑制caspase-3/9活性表達(dá)水平(均P<0.05)，見表2、3。

2.5Akt是miR-615-5p 調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的靶點(diǎn) 與Negative組(1.02±0.05)對(duì)比，miR-615-5p熒光素酶表達(dá)量(0.48±0.03)明顯減少(P<0.05)；Akt 是miR-615-5p 調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的靶點(diǎn)，見圖3A。上調(diào)miR-615-5p明顯抑制p-Akt和p-eNOS蛋白表達(dá)量(P<0.05)，見表2，圖3B。下調(diào)miR-615-5p明顯激活p-Akt和p-eNOS蛋白表達(dá)量(P<0.05)，見表3、圖3C。

2.6Akt激動(dòng)劑調(diào)控miR-615-5p 調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞 Akt激動(dòng)劑，20 μmol/L Recilisib Sodium明顯激活體外模型中miR-615-5p的p-Akt和p-eNOS蛋白表達(dá)量(P<0.05)，見圖4A、表4。Akt激動(dòng)劑明顯增加血管內(nèi)皮細(xì)胞活性，明顯減少Edu細(xì)胞比例和caspase-3/9活性表達(dá)(均P<0.05)，見圖4B、表4。

圖3 Akt是miR-615-5p 調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的靶點(diǎn)

1～3：Negative組，miR-615-5p組,miR-615-5p+Akt激動(dòng)劑組

圖4 Akt激動(dòng)劑調(diào)控microRNA-615-5p調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞(Edu染色，×400)

表4 Akt激動(dòng)劑調(diào)控miR-615-5p 調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞

3 討 論

原發(fā)性高血壓的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，目前認(rèn)為炎癥、免疫反應(yīng)可能是其發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之 一〔10，11〕。miRs是20～26個(gè)核苷酸長(zhǎng)的單鏈非編碼RNA分子，主要通過(guò)與下游靶點(diǎn)mrna的3′-UTR相互作用參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的抑制。研究表明miRs參與多種關(guān)鍵的生物學(xué)過(guò)程，包括癌癥、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞功能〔12〕。近年來(lái)，miRs與高血壓的發(fā)生、發(fā)展及其病理生理功能的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。Li 等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-615-3p在脾功能亢進(jìn)中顯著上調(diào)。本研究結(jié)果提示，miR-615-5p可能參與高血壓疾病進(jìn)程。

目前，導(dǎo)致高血壓升高的機(jī)制尚無(wú)統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)，典型的理論認(rèn)為與激素、神經(jīng)、血管、胰島素抵抗等機(jī)制有關(guān)〔14〕。血管機(jī)制認(rèn)為，高血壓的發(fā)生、發(fā)展與微血管改變的關(guān)系密切，高血壓的重要病理生理特點(diǎn)是外周血管阻力增高〔15〕。研究顯示血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙會(huì)影響血管的舒張功能，是高血壓發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素〔16〕。考慮到合并冠心病可能影響到研究結(jié)論，本研究未納入合并冠心病患者。Jiang等〔17〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-615-5P的過(guò)度表達(dá)影響了內(nèi)皮細(xì)胞從高血糖和低氧應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，可抑制病理性血管生成，并增加了內(nèi)皮細(xì)胞的生存能力、細(xì)胞遷移和血管形成，并改善血管功能障礙和病理性血管生成及毛細(xì)胞血管變性、通透性和炎癥等。說(shuō)明miR-615-5p可能在高血壓中抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)高血壓的發(fā)展。

eNOS活性降低和NO分泌減少是內(nèi)皮功能紊亂導(dǎo)致血管舒縮功能障礙形成高血壓的關(guān)鍵環(huán)節(jié)〔18〕。NO是調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能的重要體液因子，NO與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子存在相互作用，能使血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子mRNA上調(diào)，有利于修復(fù)受損的內(nèi)皮細(xì)胞，抑制損傷內(nèi)膜增厚，改善血管重構(gòu)〔19，20〕。細(xì)胞中的磷酸化eNOS積極誘導(dǎo)NO生成，從而調(diào)節(jié)血管張力和細(xì)胞增殖〔21〕。此外，PKB(Akt)被認(rèn)為可提高eNOS的磷酸化水平〔22〕。Icli等〔23〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-615-5p通過(guò)靶向調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞中Akt/eNOS信號(hào)，來(lái)調(diào)控血管生成和組織修復(fù)。這些結(jié)果說(shuō)明，miR-615-5p通過(guò)抑制Akt/eNOS信號(hào)，減少內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，促進(jìn)高血壓發(fā)展。

綜上，miR-615-5p在高血壓患者血清中的表達(dá)被上調(diào)。上調(diào)miR-615-5p抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，激活caspase-3/9活性表達(dá)水平，抑制p-Akt和p-eNOS蛋白表達(dá)量。提示miR-615-5p可能是一種潛在的高血壓的治療靶點(diǎn)。