高磊 楊光 馮培 肖震 武家明 于浩

(齊齊哈爾市第一醫(yī)院口腔頜面外科，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

口腔鱗癌是一種常見的頭頸部惡性腫瘤，其發(fā)病率占全身腫瘤的3%，我國口腔鱗癌發(fā)病率逐年增加且已嚴重威脅人類生命安全，手術、放化療等技術水平的提高可明顯改善口腔鱗癌患者生存質量，而口腔鱗癌轉移是治療的關鍵問題，亦是影響患者預后的重要因素，因而探究口腔鱗癌發(fā)病機制對口腔鱗癌轉移的預防及治療均具有重要意義，長鏈非編碼RNA(LncRNA)在腫瘤中異常表達并可發(fā)揮重要調控作用，已有研究表明LncRNA在口腔鱗癌中差異表達，通過調節(jié)癌細胞生物學行為在癌癥進展中發(fā)揮重要作用〔1～4〕。LncRNA OSER1-AS1在肝細胞癌中呈高表達，并可通過調節(jié)miR-372-3p/Rab23軸促進肝細胞癌的發(fā)生〔5〕。靶基因預測顯示OSER1-AS1與miR-149-5p存在結合位點，miR-149-5p在胃癌中表達水平降低〔6〕。因此，本研究主要探討OSER1-AS1/miR-149-5p分子軸在口腔鱗癌發(fā)生及發(fā)展過程中的可能作用機制，為口腔鱗癌治療策略的發(fā)展提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1一般資料 43例從2018年2月至2019年10月在齊齊哈爾市第一醫(yī)院收治的口腔鱗癌患者被納入此次研究〔男32例，女11例，平均年齡(63.29±6.98)歲〕?？谇击[癌患者均經病理確診。收集術中切除的癌旁及口腔鱗癌組織并置于-80℃保存。合并其他惡性腫瘤或者自身免疫性疾病患者被排除。

1.1.2細胞與主要試劑 上海冠導生物人口腔鱗癌細胞HSC-3；美國Gibco公司提供DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶；美國Invitrogen公司提供Trizol試劑與Lipofectamine2000；美國Hyclone公司提供Opti-MEM減血清培養(yǎng)基；美國Thermo Fisher公司提供反轉錄與SYBR熒光定量檢測試劑；廣州銳博生物提供si-NC、si-OSER1-AS1、miR-NC、miR-149-5p mimics、miR-149-5p inhibitor及其陰性對照(NC)；北京索萊寶提供MTT試劑與膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)試劑、基質膠；美國Corning公司提供Transwell小室；北京全式金生物提供RIPA裂解液、BCA蛋白定量檢測試劑盒；美國Santa Cruz公司提供兔抗人B淋巴細胞瘤/白血病(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、鈣黏蛋白E(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(cadherin)抗體；北京中杉金橋生物提供辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗。

1.2方法

1.2.1實驗分組 將1×106個/ml對數生長期的HSC-3細胞接種于6孔板(200 μl/孔)，細胞進行轉染：采用Opti-MEM減血清培養(yǎng)基與si-NC、si-OSER1-AS1、si-OSER1-AS1與NC、si-OSER1-AS1與miR-149-5p inhibitor充分混合，將其置于室溫條件下孵育5 min作為A液，Lipofectamine2000轉染試劑和Opti-MEM減血清培養(yǎng)基充分混合作為B液，將A液與B液充分混合后置于室溫條件下孵育20 min，將混合液加入HSC-3細胞后于培養(yǎng)箱內繼續(xù)孵育6 h，棄上清后更換DMEM完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，分別記為si-NC組、si-OSER1-AS1組、si-OSER1-AS1+NC組、si-OSER1-AS1+miR-149-5p inhibitor組。

1.2.2qRT-PCR 采用Trizol法提取組織及細胞總RNAs。檢測RNA濃度后，根據反轉錄試劑盒說明書操作合成cDNA。應用美國ABI StepOnePlus實時熒光定量PCR儀檢測OSER1-AS1(內參GAPDH)、miR-149-5p(內參U6)相對表達量。

1.2.3MTT檢測細胞存活率 收集各組HSC-3細胞后加入MTT試劑(20 μl/孔)，將其置于培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)4 h后經3 000 r/min離心5 min棄上清，將二甲基亞砜(DMSO)加入其中(150 μl/孔)后室溫孵育1 h，檢測細胞相對吸光度值(OD 490 nm)并計算細胞存活率〔實驗組OD值/對照組OD值×100%〕。

1.2.4平板克隆形成實驗 收集各組HSC-3細胞(1×105個/ml)接種于6孔板(100 μl/孔)，將其置于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)直至出現肉眼可見的細胞克隆團，用多聚甲醛(4%)固定細胞20 min，然后用結晶紫(1%)染色15 min。蒸餾水洗滌后，通過光學顯微鏡對菌落數(>50 個細胞)進行計數和拍照。

1.2.5流式細胞術 將各組HSC-3細胞重懸于100 μl結合緩沖液(1×)中，根據凋亡檢測試劑盒說明書用Annexin V-FITC(10 μl)和PI(5 μl)染色。通過流式細胞術對樣品進行分析。

1.2.6Transwell 將各組HSC-3細胞懸液(2×104細胞/200 μl無血清培養(yǎng)基)添加到Transwell 室上室中〔基質膠涂層(40 μl/孔)用于侵襲檢測和未涂層用于遷移檢測〕,并將500 μl添加有10%胎牛血清的培養(yǎng)基添加到下隔室中。24 h后，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，通過膜的細胞用4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色，然后顯微鏡觀察計數。

1.2.7雙熒光素酶報告實驗 構建野生型(WT)或突變型(MUT)熒光素酶報告載體(WT/MUT-OSER1-AS1)。參照Lipofectamine2000轉染試劑說明書分別將miR-NC、miR-149-5p mimics與WT-OSER1-AS1、MUT-OSER1-AS1共轉染入HSC-3細胞。48 h后，檢測熒光素酶活性。

1.2.8Western印跡檢測蛋白表達 采用500 μl RIPA裂解液提取各組HSC-3細胞的總蛋白。BCA法檢測蛋白濃度后，30 μg蛋白樣品被10%的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離，并轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入稀釋比1∶1 000的一抗稀釋液孵育24 h(4℃條件下)，隨后加入稀釋比為1∶5 000的二抗稀釋液孵育1 h(37℃)。TBST洗滌后，采用電化學發(fā)光(ECL)試劑盒檢測蛋白信號隨后應用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS21.0軟件進行獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1OSER1-AS1和miR-149-5p在口腔鱗狀細胞癌細胞中的表達 相較于癌旁組織，OSER1-AS1在口腔鱗癌組織中顯著升高(P<0.05)，而miR-149-5p的表達水平降低(P<0.05)，見表1。

2.2干擾OSER1-AS1對HSC-3增殖的影響 轉染si-OSER1-AS1后細胞活力顯著降低(P<0.05)且克隆形成數顯著減少(P<0.05)，而si-NC轉染不影響細胞增殖(P>0.05)。此外OSER1-AS1敲除導致miR-149-5p的表達水平顯著升高(P<0.05)，見圖1、表2。

表1 OSER1-AS1和miR-149-5p的表達

表2 干擾OSER1-AS1對HSC-3細胞存活率、克隆形成及凋亡的影響

圖1 干擾OSER1-AS1對HSC-3克隆形成的影響

2.3干擾OSER1-AS1對HSC-3凋亡的影響 如表2、圖2、圖3所示，與si-NC組比較，si-OSER1-AS1轉染誘導細胞凋亡顯著增加(P<0.05)，并伴隨著Bax蛋白顯著升高，Bcl-2蛋白顯著降低(均P<0.001)。

2.4干擾OSER1-AS1對HSC-3遷移、侵襲及EMT的影響 相較于si-NC轉染，si-OSER1-AS1轉染顯著抑制細胞遷移及侵襲(P<0.05)，si-OSER1-AS1組細胞E-cadherin蛋白含量顯著升高(P<0.05)，N-cadherin蛋白含量顯著降低(P<0.05)，見圖4、圖5、表3。

1，2：si-NC組，si-OSER1-AS1組；圖3～5同圖2 干擾OSER1-AS1對HSC-3凋亡

圖3 凋亡蛋白表達

圖4 干擾OSER1-AS1對HSC-3遷移、侵襲(結晶紫染色，×200)

圖5 Western印跡檢測E-cadherin、N-cadherin蛋白表達

表3 OSER1-AS1下調對HSC-3遷移、侵襲及EMT的影響

2.5OSER1-AS1和miR-149-5p靶向關系的驗證 圖6顯示miR-149-5p在OSER1-AS1的結合位點。 miR-149-5過表達明顯降低野生型OSER1-AS1報告載體的熒光素酶活性(P<0.05)，但不影響突變型(P>0.05)，見表4。

圖6 OSER1-AS1靶向miR-149-5p

表4 雙熒光素么報告實驗

2.6抑制miR-149-5p對干擾OSER1-AS1處理的HSC-3增殖、凋亡的影響 與si-OSER1-AS1+NC組比較，si-OSER1-AS1+miR-149-5p inhibitor組細胞存活率顯著升高(P<0.05)，克隆形成數顯著增多(P<0.05)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，Bax蛋白水平顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平顯著升高(P<0.05)，見圖7～9、表5。

1,2:si-OSER1-AS1+NC組,si-OSER1-AS1+miR-149-5p inhibitor組；下圖同圖7 抑制miR-149-5p對干擾OSER1-AS1處理的HSC-3凋亡的影響

圖8 抑制miR-149-5p對干擾OSER1-AS1處理的HSC-3 克隆形成的影響

圖9 Bax、Bcl-2蛋白表達

表5 抑制miR-149-5p對干擾OSER1-AS1處理的HSC-3細胞存活率、克隆形成和凋亡的影響

2.7抑制miR-149-5p對干擾OSER1-AS1處理的HSC-3遷移、侵襲及EMT的影響 相較于si-OSER1-AS1+NC組，細胞遷移及侵襲的數量在si-OSER1-AS1+miR-149-5p inhibitor組顯著增多(P<0.05)，且E-cadherin蛋白含量顯著下降(P<0.05)，N-cadherin蛋白含量顯著升高(P<0.05)，見圖10、圖11、表6。

圖10 E-cadherin、N-cadherin蛋白表達

圖11 抑制miR-149-5p對干擾OSER1-AS1處理的HSC-3遷移、侵襲的影響(結晶紫染色，×200)

表6 抑制miR-149-5p對干擾OSER1-AS1處理的HSC-3遷移、侵襲的影響

3 討 論

有研究表明LncRNA 在口腔鱗癌患者中異常表達，此外，環(huán)狀RNAs(circRNAs )差異表達可能通過充當miRNA競爭性內源RNA在口腔鱗癌的病理進展中起作用。例如，LncRNA LACAT1通過抑制miR-4301促進口腔鱗癌細胞增殖〔7〕。LncRNA HOXA11-AS通過抑制miR-214-3p表達而促進口腔鱗癌細胞增殖〔8〕。LncRNA人母系表達基因(MEG)3的低表達通過靶向miR-21促進口腔鱗癌的發(fā)展〔9〕。LncRNA膀胱癌相關轉錄本(BLACAT)1通過靶向miR-142-5p調節(jié)口腔鱗癌細胞的活力、遷移和侵襲〔10〕。LncRNA核旁斑組裝轉錄本(NEAT)1通過調控miR-365/G蛋白信號轉導調節(jié)因子(RGS)20在口腔鱗癌中促進細胞增殖和侵襲〔11〕。然而關于口腔鱗癌中OSER1-AS1表達，功能及機制的研究仍然較少。

有研究表明，OSER1-AS1通過競爭性結合miR-433-3p而促進Smad2的表達從而促進非小細胞肺癌的發(fā)展〔12〕。本研究結果顯示，口腔鱗癌組織中OSER1-AS1的表達水平高于癌旁組織，干擾OSER1-AS1表達能夠抑制口腔鱗癌細胞增殖及克隆形成能力。Bcl-2屬于抗凋亡蛋白，Bax屬于促凋亡蛋白，Bcl-2/Bax比值降低，即Bax的表達水平升高可通過線粒體凋亡途徑的激活促進細胞凋亡〔13〕。在本次實驗中，OSER1-AS1敲除可通過促進Bax的表達及抑制Bcl-2的表達顯著刺激口腔鱗癌細胞凋亡，提示干擾OSER1-AS1表達可促進口腔鱗癌細胞凋亡。EMT已被證明在腫瘤轉移中至關重要，其標志是 N-cadherin 上調及E-cadherin 的下調〔14〕。隨后本研究發(fā)現，OSER1-AS1下調抑制口腔鱗癌細胞遷移和侵襲能力及EMT過程。

為進一步探究OSER1-AS1在口腔鱗癌發(fā)生及發(fā)展過程中的作用機制，本研究證實OSER1-AS1與miR-149-5p存在靶向調控作用，其可負向調控miR-149-5p的表達。circ_0075341通過上調miR-149-5p的表達而促進宮頸癌的發(fā)展〔15〕。LncRNA前列腺癌相關轉錄本(PCAT)-1通過靶向miR-149-5p調節(jié)結直腸癌細胞增殖、侵襲、遷移和凋亡〔16〕。LncRNA PCAT-1通過調節(jié)miR-149-5p/LRIG2軸促進非小細胞肺癌的進展〔17〕。在甲狀腺髓樣癌中上調miR-149-5可靶向抑制GIT1減弱癌細胞的侵襲和增殖〔18〕。circCTNNA1通過充當miR-149-5p的海綿分子并調節(jié)FOXM1表達而促進結直腸癌的進展〔19〕。LncRNA BLACAT1通過充當miR-149-5p的海綿分子并靶向驅動蛋白家族成員(KIF)2A而促進胃癌的發(fā)生〔20〕。本研究結果顯示，口腔鱗癌組織中miR-149-5p的表達水平低于癌旁組織，抑制miR-149-5p表達明顯削弱OSER1-AS1敲除對口腔鱗癌細胞生長以轉移的抑制作用。

綜上所述，下調口腔鱗癌細胞中OSER1-AS1的表達可通過升高miR-149-5p的表達從而抑制癌細胞生長和轉移，為口腔鱗癌的治療提供潛在靶標。但關于OSER1-AS1/miR-149-5p如何調控下游靶基因表達仍需進一步探究，仍需進行體內實驗進一步驗證OSER1-AS1/miR-149-5p分子軸在口腔鱗癌發(fā)生及發(fā)展過程中的作用機制。