張卓然 王剛 吳桂霞 馬明釗 李明軒 李靜

(新疆醫(yī)科大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；2第一臨床醫(yī)學(xué)院；3新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第六師奇臺醫(yī)院放射科)

隨著我國疾病譜的改變，動脈粥樣硬化(AS)引起的多種重要臟器缺血性疾病已成為不可忽視的公共衛(wèi)生問題，其中僅缺血性心臟病2016年患病率就高達(dá)10.2‰〔1〕。AS病理過程起始自內(nèi)皮損傷，除代謝因素外，血流機(jī)械應(yīng)力是目前備受關(guān)注的導(dǎo)致血管內(nèi)皮受損的重要因素之一。研究發(fā)現(xiàn)，高血流剪切應(yīng)力(>15 dyne/cm2)具有促AS保護(hù)基因表達(dá)的作用，而AS常發(fā)部位多為低剪切應(yīng)力(<4 dyne/cm2)，提示血流剪切應(yīng)力與AS的發(fā)生密切相關(guān)〔2〕。許多研究顯示，黏著斑為血流機(jī)械應(yīng)力致內(nèi)皮損傷這一過程中將力學(xué)信號傳遞至胞內(nèi)相應(yīng)受體的重要機(jī)械感受器之一。

血流剪切應(yīng)力轉(zhuǎn)導(dǎo)的核心是細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)之間的信息交互，由整合素、ECM成分、細(xì)胞骨架成分構(gòu)成的大型細(xì)胞基底面復(fù)合物——黏著斑承擔(dān)著聯(lián)系細(xì)胞與ECM的橋梁作用，但整合素自身不能實(shí)現(xiàn)激酶功能，需依賴黏著斑激酶(FAK)發(fā)揮作用。FAK是黏著斑復(fù)合體合成與分解的關(guān)鍵媒介，黏著斑代謝及相關(guān)分子機(jī)制在AS這一病理過程中的研究仍較為欠缺。本研究以FAK為著眼點(diǎn)，利用ApoE-/-小鼠構(gòu)建AS疾病模型，測定FAK及其活性形式磷酸化(P)-FAK在AS小鼠病灶組織中的表達(dá)水平，并分析其與小鼠血脂四項(xiàng)的相關(guān)性，以探討?zhàn)ぶ咧蠪AK的活化水平對AS發(fā)生發(fā)展的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物與試劑 C57BL/6J小鼠及ApoE-/-小鼠(華阜康生物技術(shù)公司，北京)。一抗FAK及P-FAK抗體(Tyr397)(圣克魯斯生物技術(shù)公司，美國)；二抗羊抗兔FITC-IgG(博奧森生物技術(shù)公司，北京)；山羊血清及含DAPI抗熒光淬滅封片液(碧云天生物科技公司，上海)。

1.2小鼠分組及疾病模型的建立 10只ApoE-/-小鼠為實(shí)驗(yàn)組、10只C57BL/6J小鼠為對照，常規(guī)方法建立AS疾病模型，建模時間為8 w，每周定時測量體重，8 w后處死，取血送檢血脂四項(xiàng)：總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白脂固醇(LDL-C)，分離主動脈弓與主動脈根部標(biāo)本固定包埋后進(jìn)行病理鑒定，同時制作冰凍切片。

1.3免疫熒光檢測FAK、P-FAK(Tyr397)表達(dá) 冰凍切片復(fù)溫30 min，4%多聚甲醛固定15 min；10%山羊血清封閉30 min；加一抗稀釋液：一抗1∶400+1.5%山羊血清+磷酸鹽緩沖液(PBS)，-4℃冰箱孵育過夜；復(fù)溫1 h；FITC標(biāo)記IgG染色：二抗1∶400+1.5%山羊血清+PBS，孵育2 h；封片干燥；熒光倒置顯微鏡下攝像采集圖片。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 Image pro plus6.0采集FAK、P-FAK特異性熒光部位平均灰度值，作為其表達(dá)含量指標(biāo)；采用SPSS22.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)及Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1AS疾病模型鑒定 實(shí)驗(yàn)組AS血脂四項(xiàng)均較對照組明顯增加(P<0.05)，見表1。小鼠主動脈切片HE染色病理鑒定結(jié)果顯示，各切片主動脈結(jié)構(gòu)完整，層次可辨，提示AS建模成功，標(biāo)本保存完好，見圖1。

表1 兩組血清脂質(zhì)水平比較

2.2FAK與P-FAK表達(dá)水平檢測及P-FAK與血脂四項(xiàng)相關(guān)性分析 免疫熒光結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組AS斑塊中FAK與P-FAK呈綠色熒光，DAPI染核呈藍(lán)色，F(xiàn)AK、P-FAK多表達(dá)于血管內(nèi)膜、中膜層及胞質(zhì)，見圖2。實(shí)驗(yàn)組AS小鼠病灶P-FAK表達(dá)水平(0.40±0.038)顯著高于對照組(0.35±0.030；P<0.05)，而FAK表達(dá)水平(0.78±0.042)與對照組(0.82±0.052)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。Pearson相關(guān)性分析顯示，P-FAK表達(dá)水平與小鼠血脂、TC、LDL-C、HDL-C、TG具有顯著相關(guān)性(r=0.84、0.87、0.89、0.71，均P<0.05)。

圖1 各組FAK主動脈病理鑒定(HE染色)

圖2 兩組主動脈組織FAK、p-FAK免疫熒光染色(×400)

3 討 論

隨著對AS不斷地深入研究，目前發(fā)現(xiàn)血流機(jī)械力作用與AS的發(fā)生發(fā)展緊密聯(lián)系，有研究證實(shí)時間平均壁面剪切力(TAWSS)和振蕩剪切指數(shù)(OSI)可以作為AS的主要危險參數(shù)〔3〕，通過聯(lián)合血流動力學(xué)和血脂等生化指標(biāo)可較為準(zhǔn)確地預(yù)測AS發(fā)生的風(fēng)險部位〔4〕。AS相關(guān)的血流機(jī)械力包括軸向斑塊應(yīng)力(APS)、內(nèi)皮切應(yīng)力(ESS)和斑塊結(jié)構(gòu)應(yīng)力(PSS)等〔5〕。各類血流機(jī)械力信號經(jīng)常見于內(nèi)皮細(xì)胞膜機(jī)械感受器，如整合素家族、黏著斑(FA)、細(xì)胞膜糖萼〔6〕、機(jī)械門控Piezo離子通道(Piezo)1〔7〕和跨膜受體蛋白(NOTCH)1〔8〕機(jī)械門控離子通道、G蛋白耦聯(lián)受體等發(fā)揮作用，并通過與F-actin、微管中間絲等細(xì)胞骨架蛋白連接，由Hippo、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)和核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB等〔9,10〕信號通路參與實(shí)現(xiàn)生物學(xué)效應(yīng)。

血流應(yīng)力參與AS發(fā)生過程中，細(xì)胞黏附的改變?yōu)殛P(guān)鍵環(huán)節(jié)，黏著斑是使細(xì)胞與ECM緊密黏附并相互作用的重要結(jié)構(gòu)之一，有研究表明，根據(jù)黏著斑平均尺寸可以準(zhǔn)確而穩(wěn)定地預(yù)測細(xì)胞遷移行為〔11〕。黏著斑類型眾多，組成成分復(fù)雜，其代謝方式、結(jié)構(gòu)和功能至今尚未完全闡明，但其中心結(jié)構(gòu)均為整合素家族分子。由于其本身并不具有激酶活性，F(xiàn)AK則為介導(dǎo)整合素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的核心蛋白。

FAK可以被分為3個功能區(qū)，即N端FERM、C端FAT和中央激酶結(jié)構(gòu)域。在黏著斑構(gòu)建過程中，連接于黏著斑的肌球蛋白受力后可激活FAK，但尚不清楚FAK是直接被機(jī)械信號激活還是被機(jī)械信號轉(zhuǎn)導(dǎo)后激活〔12〕。整合素尾端與活化態(tài)的FAK N端FERM結(jié)構(gòu)域的F1區(qū)結(jié)合而消除自抑制狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)活化。FAK C端的FAT結(jié)構(gòu)域可與樁蛋白(paxillin)和(或)踝蛋白(talin)結(jié)合以維持黏著斑的完整。整合素與ECM結(jié)合后可以通過FAK的FAT結(jié)構(gòu)域與paxillin連接進(jìn)一步招募FAK和talin，從而增強(qiáng)整合素與ECM的連接〔13〕。另外，F(xiàn)AK還參與機(jī)械力傳感器p130Crk相關(guān)底物(p130Cas)的招募，并使其的底物結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)象改變從而將機(jī)械信號轉(zhuǎn)化為生物化學(xué)信號〔14〕?？梢?，黏著斑的合成與分解是一個高度動態(tài)化的復(fù)雜過程，順利完成這一過程的關(guān)鍵在于調(diào)節(jié)相關(guān)分子的自抑制狀態(tài)〔14〕，從而精確控制黏著斑組分的激活，從而完成相關(guān)蛋白的募集定位和復(fù)合物前體的形成。在這一過程中，F(xiàn)AK通過調(diào)節(jié)整合素的活化和內(nèi)吞再循環(huán)對黏著斑的合成與分解起著關(guān)鍵作用〔15〕，是協(xié)調(diào)黏著斑各組分的關(guān)鍵激酶，在黏著斑信號網(wǎng)絡(luò)中起著重要作用。

因此，F(xiàn)AK協(xié)助整合素等黏著斑組分完成與細(xì)胞骨架的連接，并在黏著斑合成與分解過程中承擔(dān)不可或缺的角色，也使其成為指示血流機(jī)械應(yīng)力因素對血管內(nèi)皮細(xì)胞影響的重要指標(biāo)。近年來，在各類脈管疾病中FAK作為細(xì)胞黏附與力學(xué)信號分子備受學(xué)者關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源FAK抑制劑FRNK通過與FAK結(jié)合位點(diǎn)競爭性結(jié)合抑制 FAK 活性〔16〕，從而抑制AS中細(xì)胞的黏附遷移。在血管炎癥研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AK/Pyk2雙重抑制劑(PF-271)可在相關(guān)炎癥因子刺激下特異抑制血管細(xì)胞黏附分子(VCAM)-1的表達(dá)，有效降低巨噬細(xì)胞黏附及遷移的能力〔17〕。在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，0.03%FAK 抑制劑對AS的發(fā)展有明顯的抑制作用，同時尚未顯示任何明顯的毒性作用〔18〕，這將為以FAK活性調(diào)節(jié)作為治療AS的潛在靶點(diǎn)提供了可能性。

本研究結(jié)果表明FAK的異常活化與AS進(jìn)展相關(guān)；同時，提示P-FAK的異常表達(dá)可能與高LDL、高TC等風(fēng)險因素協(xié)同促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展。

綜上，F(xiàn)AK在機(jī)械應(yīng)力、炎癥反應(yīng)、血脂代謝等內(nèi)環(huán)境變化時產(chǎn)生異?；罨磉_(dá)，調(diào)控黏著斑的合成與分解，從而影響細(xì)胞的黏附、增殖、遷移等生物學(xué)行為。此外，眾多研究表明，在AS病變發(fā)生和發(fā)展過程中，F(xiàn)AK是不同血流條件下內(nèi)皮細(xì)胞整合素下游的關(guān)鍵信號的傳導(dǎo)介質(zhì)〔19〕，后續(xù)可能成為抑制機(jī)械應(yīng)力傳導(dǎo)和血管炎癥反應(yīng)等多個角度治療AS的潛在候選靶點(diǎn)之一。