周國忠 歐陽松 侯月梅 張彥

(1萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院心內(nèi)科，江西 萍鄉(xiāng) 337000；2上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院南院老年科；3福建醫(yī)科大學附屬福州市第一醫(yī)院心內(nèi)科)

心房顫動(房顫)是臨床上最常見的快速型心律失常，具有高住院率和致殘率的臨床特征，嚴重影響人類健康和生活質(zhì)量〔1〕。目前藥物仍然是臨床上治療房顫的主要手段之一〔2〕，且應(yīng)用最多的是西藥，如普羅帕酮、奎尼丁、胺碘酮等。但長期臨床結(jié)果顯示，西藥在維持房顫患者竇性心律的比例相對較低，長期應(yīng)用還會帶來致新的心律失常等毒副作用。由于療效顯著且毒副反應(yīng)小，中成藥防治陣發(fā)性發(fā)顫的作用越來越被重視〔3〕。研究表明參松養(yǎng)心膠囊對心房肌Na+、L型Ca2+(ICaL)、K+等多種離子通道均有阻滯作用〔4，5〕。臨床中參松養(yǎng)心膠囊不但抗房顫作用明顯且安全性好，但其抗房顫機制仍不十分明確，國內(nèi)外也較少有針對該機制的實驗動物基礎(chǔ)研究。本文旨在應(yīng)用微電極陣(MEA)技術(shù)，在快速心房起搏(RAP)兔房顫中，通過觀察參松養(yǎng)心膠囊干預(yù)下兔心房肌場電位和激動傳導等電生理信號的變化，從而研究其抗房顫機制。

1 材料與方法

1.1動物分組 50只成年新西蘭兔，體重3.0～4.0 kg，不限雌雄，動物質(zhì)量屬于普通級標準，購至青島康大生物科技有限公司(許可證號SCXK20160002)。隨機分為5組，對照組，起搏組，起搏+參松養(yǎng)心膠囊A組(1 g/L)，起搏+參松養(yǎng)心膠囊B組(2 g/L)，起搏+參松養(yǎng)心膠囊C組(4 g/L)各10只。

1.2實驗試劑和設(shè)備 臺氏液：KCl 5.0 mmol/L、NaCl 144 mmol/L、MgCl21 mmol/L、NaH2PO40.33 mmol/L、CaCl21.8 mmol/L、葡萄糖10 mmol/L、HEPES 10 mmol/L(pH值用NaOH滴定至7.4左右)。參松養(yǎng)心膠囊購至北京以嶺藥業(yè)有限公司。微電極陣列系統(tǒng)(Microeletrode arrays MEA64 System，MCS，Germany)主要由柔性電極(64感知位點)、USB-ME64轉(zhuǎn)換卡、MC-Rack軟件包、Stimulus Generator刺激儀、PGA64 放大器構(gòu)成。

1.3RAP模型制作 先經(jīng)兔耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉，靜推肝素(800 U)抗凝。在操作臺上固定，沿頸部正中切口分離右側(cè)頸內(nèi)靜脈，結(jié)扎近頭端。使用電生理儀(LEAD-7000，四川錦江電子科技)記錄心電圖和心腔內(nèi)電圖(高右房)與體表心電圖(體表Ⅱ?qū)?lián))，起搏右房并做好記錄。當電生理儀上出現(xiàn)大A波和小V波時固定電極導線。持續(xù)24 h以600次/min的固定頻率快速心房起搏。對照組不行RAP僅植入電極導線。

1.4離體心臟langendroff灌流 24 h RAP后(對照組同時間點)，開胸取出兔心臟，放入臺氏液(4℃)并充氧，順心臟跳動排擠出臟內(nèi)積血。ALC-CWB數(shù)控恒溫循環(huán)水槽恒定臺氏液在37℃，流速設(shè)為15 ml/min，持續(xù)通以混合氣體(95%O2+5% CO2)。灌管置于主動脈瓣及冠狀動脈開口上方后固定。Stimulus Generator刺激儀發(fā)出大于2倍閾值強度、2 ms波寬、1 Hz頻率的脈沖，行心房驅(qū)動刺激，設(shè)置子窗口23#為電極導線正極35#為負極。

1.5MEA系統(tǒng) 柔性電極(MEA1、MEA2)是在一塊柔性塑料片(大小6×28 mm2)基質(zhì)頭部(1.8×1.8 mm2)以陣列形式植入32個直徑50 μm金電極。工作原理：柔性電極緊貼心房肌采集原始電信號，經(jīng)放大器(PGA64)增益10倍調(diào)制，由模數(shù)轉(zhuǎn)換卡(USB-ME64)數(shù)字后再用MC-Rack處理。心臟跳動穩(wěn)定30 min后記錄心肌電信號變化。場電位參數(shù)：FPmin：第一個負向波峰值、FPmax：最后一個正向波峰值及場電位時限(fADP)：從FPmin到FPmax 的時間。激動傳導速度(ECV)：速度=距離÷時間，每個相鄰金電極間隔300 μm，同一心動周期內(nèi)，根據(jù)激動先后時間差即可得出激動傳播時間。

1.6給藥方法 根據(jù)各組所需藥物濃度的不同，將參松養(yǎng)心膠囊充分溶解于改良臺氏液中，重新滴定至pH7.4左右。

1.7MEA記錄各組fADP、ECV與心率(HR)變化 離體心臟用改良臺氏液進行l(wèi)angendroff灌流，選定20號(+)與31號(-)電極，對右房持續(xù)用電壓2 V、脈寬2 ms、延時100 ms續(xù)刺30 min。20號和31號窗口無電信號，MEA顯示為一條直線。起搏組用純臺氏液langendroff灌流，柔性電極貼附心房肌后連續(xù)刺激30 min。起搏+參松養(yǎng)心膠囊A、B、C組分別用混有1、2、4 g/L參松養(yǎng)心膠囊的臺氏液灌流。10 min后記錄各組fADP、ECV和HR的變化。

1.8統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、方差分析、LSD-t檢驗或Dunnettt檢驗。

2 結(jié) 果

2.1兔房顫模型 房顫模型制作成功標準：心電圖紊亂，P波消失，R-R間期絕對不齊，出現(xiàn)房顫小f波(450～600次/min)(圖1)，且持續(xù)時間大于15 s。本實驗?zāi)Ｐ统晒β?00%。

Ⅱ：體表Ⅱ?qū)?lián)心電圖；HRA：心腔內(nèi)電圖(高右房)圖1 RAP兔房顫

2.2離體心臟langendroff灌流結(jié)果 離體心臟在langendroff成功灌流下，可穩(wěn)定搏動較長時間。柔性電極(MEA 1、2)可清晰、準確記錄到無論基礎(chǔ)或藥物干預(yù)時64個位點的自主節(jié)律、場電位及激動傳導變化。

2.3各組實驗結(jié)果變化 與對照組相比，起搏組心房肌fADP明顯縮短，ECV明顯減慢，HR明顯加快(P<0.05)。與起搏組相比，參松養(yǎng)心膠囊A、B、C組明顯延長心房肌fADP、加快ECV，減慢HR(P<0.05)，且參松養(yǎng)心膠囊A、B、C組隨劑量升高，fADP明顯延長，ECV明顯加快(均P<0.05)，但參松養(yǎng)心膠囊A、B、C組HR變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1，圖2。

表1 各組fADP、ECV、HR變化比較

圖2 各組激動傳導

3 討 論

MEA技術(shù)通過檢測局部組織場電位變化能間接反映多種離子通道在興奮時的離子運動，與傳統(tǒng)膜片鉗技術(shù)相比具有操作簡單、實驗成功率高、成本低等優(yōu)勢，通過分析記錄群細胞激動的時間差，可推斷激動的傳播方向、途徑與速度〔6〕，能對因激動傳導異常所致心律失常和對應(yīng)抗心律失常機制進行研究。柔性電極能與細胞緊密耦合，MEA可準確、實時反映出細胞群的電生理信號變化，借助穩(wěn)定的傳感器，有潛力成為一種基于細胞電信號分析的藥物研發(fā)檢測工具。MEA采集的FPdur與房顫動作電位時程(APD)和有效不應(yīng)期(ERP)同步變化，可作為心肌電重構(gòu)的一項重要指標〔7，8〕。本研究與上述結(jié)論相符，也證實了MEA技術(shù)在房顫電重構(gòu)研究領(lǐng)域的可靠性。

RAP 24 h后心房肌延遲整流鉀(IKur)電流、細胞內(nèi)向整流鉀電流發(fā)生重要改變，ICaL電流和瞬時外向鉀電流也改變明顯〔9〕。實驗中RAP 24 h后心房肌fADP顯著縮短，推斷是因IKur、ICaL、乙酰膽堿調(diào)節(jié)的鉀離子(IK，ACh)等離子通道運動發(fā)生改變。在動作電位平臺期，抑制IKur外流與ICaL內(nèi)流可分別導致APD延長與縮短。而研究已證實參松養(yǎng)心膠囊對心肌細胞IKur和ICaL均具有抑制作用〔10〕，但本實驗結(jié)果表明在RAP兔房顫中，參松養(yǎng)心膠囊對IKur 的抑制作用要強于對ICaL的抑制作用。由此可得，參松養(yǎng)心膠囊可能通過調(diào)節(jié)IKur、ICaL等離子通道運動，延長心房肌APD及ERP，從而阻止房顫的進一步發(fā)生。

在RAP建立的犬房性心律失常模型中發(fā)現(xiàn)，心房傳導速度減慢，主要與瞬態(tài)鈉電流(INaT)密度顯著降低有關(guān)〔9〕。INaT減少使傳導速度減慢，房顫易形成和發(fā)展。本實驗中，起搏組ECV較對照組明顯減慢與上述研究結(jié)論相符。但在使用參松養(yǎng)心膠囊進行干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，ECV呈濃度依賴性加快，推測主要通過調(diào)節(jié)INaT的密度實現(xiàn)的。參松養(yǎng)心膠囊可能通過增加INaT密度使傳導速度加快、波長延長，進而不利于房顫的形成和發(fā)展。此外，參松養(yǎng)心膠囊對心率會產(chǎn)生影響，以往研究表明其對β受體有一定程度阻滯作用〔11〕，本實驗結(jié)果進一步表明參松養(yǎng)心膠囊對β受體的阻滯作用相對較輕，減慢心率變化范圍不大，在臨床應(yīng)用中具有較好安全性。

綜上，參松養(yǎng)心膠囊通過對心肌細胞Na+、K+、Ca2+等多離子通道的調(diào)節(jié)，發(fā)揮其抗房顫作用，并具有較好的安全性。