鄭海龍 那涵 陳小盼 蔡舒婷 韓鋒 吳海麗

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 1內(nèi)分泌科，海南 ?？?570102;2檢驗(yàn)科;3皮膚病科)

糖尿病足(DF)是糖尿病(DM)患者最常見、最嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一，在我國50歲以上的DM患者中，DF的發(fā)病率高達(dá)8.1%〔1〕，糖尿病足潰瘍(DFU)和糖尿病足感染(DFI)是導(dǎo)致DM患者截肢、死亡的主要原因，根據(jù)相關(guān)估計(jì)數(shù)據(jù)，全球每20 s就會(huì)有1例DFU截肢，總截肢率高達(dá)19.03%，DFU患者的年病死率高達(dá)14.4%〔2〕，而我國DFU患者的年病死率和截肢率分別為11%和22%〔3〕。細(xì)菌感染是影響DFU創(chuàng)面難愈和復(fù)發(fā)的核心因素，臨床就診的DFU患者幾乎全部存在不同程度的足部感染，老年DFI患者因具有合并基礎(chǔ)疾病、機(jī)體器官功能減退、組織修復(fù)和再生能力弱等特點(diǎn)，其治療難度更高、感染難以有效控制。及時(shí)全身性應(yīng)用廣譜抗菌藥物是治療DFI的基礎(chǔ)，但在老年患者中治療效果往往難以令人滿意，這與老年DFI患者創(chuàng)面病原菌的復(fù)雜性和耐藥現(xiàn)象有關(guān)，隨著第三代頭孢菌素等廣譜抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，病原菌耐藥現(xiàn)象更加嚴(yán)重〔4〕?；旌霞?xì)菌感染和多藥耐藥菌(MDROs)檢出率升高是DFI病原學(xué)特征的重要變化趨勢〔5〕，但目前關(guān)于DFI混合細(xì)菌感染的病原菌分布和相關(guān)因素研究結(jié)果分歧較多，同時(shí)，雖然研究證實(shí)了DFI的發(fā)生與機(jī)體免疫功能下降有關(guān)，但混合細(xì)菌感染的發(fā)生是否也與之相關(guān)，學(xué)術(shù)界仍未達(dá)成共識〔6〕，基于此，本研究針對老年DF患者混合細(xì)菌感染的病原菌分布及與免疫功能指標(biāo)的相關(guān)性進(jìn)行了分析，旨在為臨床治療工作提供研究依據(jù)。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取2019年10月至2021年3月海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收治的85例老年DFI患者作為研究對象，根據(jù)創(chuàng)面樣本病原菌分布將其分為混合感染組(36例)和非混合感染組(49例)，兩組患者均簽署知情同意書，自愿參與本研究，研究方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過。納入標(biāo)準(zhǔn)：DFI的診斷依據(jù)《中國糖尿病足診治指南》〔7〕和國際DF工作組制訂的《糖尿病足感染診斷和治療指南(2019年更新)》〔8〕，患者年齡均大于60歲，Wagner分級均為2～5級，均于入院當(dāng)日行常規(guī)入院檢查并采集感染創(chuàng)面樣本行細(xì)菌培養(yǎng)，住院資料完整。排隊(duì)標(biāo)準(zhǔn)：合并嚴(yán)重肝腎功能障礙、惡性腫瘤、自身免疫疾病、血液系統(tǒng)疾病、腦卒中、糖尿病急性并發(fā)癥者；入組前3個(gè)月內(nèi)有高壓氧、臭氧及其他創(chuàng)面治療史者。

1.2觀察指標(biāo)

1.2.1創(chuàng)面病原菌分布及耐藥性 于入院后當(dāng)日應(yīng)用抗菌藥物治療前首次傷口換藥時(shí)采集患者的足部創(chuàng)面樣本，樣本提取液于37℃下恒溫培養(yǎng)48～72 h后，采用MA120型微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)(珠海美華醫(yī)療科技有限公司)對分離菌株進(jìn)行菌種鑒定，質(zhì)控菌種為金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922、白假絲酵母ATCC90028，質(zhì)控菌種均購自南京樂診生物技術(shù)有限公司。將合并兩種及以上細(xì)菌感染判定為混合細(xì)菌感染，采用紙片瓊脂擴(kuò)散法對分離菌種進(jìn)行藥物敏感性檢測，參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)指南〔9〕對藥敏結(jié)果進(jìn)行判定，將對三類或三類以上抗菌藥物同時(shí)耐藥的病原菌判定為MDROs。注意事項(xiàng)：創(chuàng)面樣本采集過程均嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，采樣試管嚴(yán)格執(zhí)行滅菌處理，針對淺表潰瘍患者以滅菌鹽水棉拭子蘸取潰瘍底部分泌物或膿液進(jìn)行采集，注意避免沾染創(chuàng)面周圍皮膚；針對深潰瘍及足壞疽患者于清創(chuàng)后以探針采集潰瘍深部分泌物或膿液，采樣后立即送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測。

1.2.2臨床特征 通過查閱住院病歷對兩組患者的年齡、性別、DM病程、DFU病程、Wagner分級、抗菌藥物應(yīng)用史及入院當(dāng)日的空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、中性粒細(xì)胞百分比(NEU%)、降鈣素原(PCT)、C 反應(yīng)蛋白(CRP)、踝肱指數(shù)(ABI)、經(jīng)皮氧分壓 (TcPO2)等指標(biāo)進(jìn)行比較，其中，F(xiàn)BG、血脂指標(biāo)、CRP的檢測采用Cobas 501型全自動(dòng)血液生化分析儀(瑞士Roche公司)，WBC、NEU%的檢測采用 XT-2000i型五分類血液分析儀(日本Sysmex公司)，PCT的檢測采用E601電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(瑞士Roche公司)，HbA1c的檢測采用LC-30A型高壓液相色譜儀(日本Shimadzu公司)，ABI的檢測方法為測定踝部脛后動(dòng)脈或脛前動(dòng)脈及肱動(dòng)脈的收縮壓而后計(jì)算其比值，TcPO2的檢測采用TCM4 監(jiān)測系統(tǒng)(丹麥 Radiometer公司)。質(zhì)控措施為：在開展研究前，針對參與研究者進(jìn)行質(zhì)控培訓(xùn)，主要是對于研究對象的納入排除標(biāo)準(zhǔn)、病史問診要點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)室檢測標(biāo)準(zhǔn)方法和關(guān)鍵步驟進(jìn)行培訓(xùn)，要求檢測人員在開展研究前認(rèn)真閱讀儀器及試劑盒使用說明書，嚴(yán)格按照說明書步驟進(jìn)行操作，在提取數(shù)據(jù)時(shí)采用雙人分別提取病歷進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入，由研究組質(zhì)控人員對數(shù)據(jù)進(jìn)行最終復(fù)核和確認(rèn)。

1.2.3外周血T淋巴細(xì)胞亞群 于兩組患者入院當(dāng)日采集外周靜脈血樣本2 ml，經(jīng)乙二胺四乙酸抗凝處理后，采用BD Accuri C6 Plus型流式細(xì)胞儀(美國BD公司)對血清中的CD3+T淋巴細(xì)胞比例、CD4+T淋巴細(xì)胞比例、CD8+T淋巴細(xì)胞比例、CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值進(jìn)行檢測，試劑盒為儀器配套試劑盒。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、Fisher確切概率法、Logistic回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組創(chuàng)面病原菌分布及耐藥性 混合感染組創(chuàng)面中檢出病原菌72株，非混合感染組創(chuàng)面中檢出病原菌49株，兩組創(chuàng)面病原菌分布的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。混合感染組感染類型以金黃色葡萄球菌+大腸埃希菌〔7例(19.44%)〕、表皮葡萄球菌+大腸埃希菌〔6例(16.67%)〕、銅綠假單胞菌+大腸埃希菌〔6例(16.67%)〕占比較多；其余變形桿菌+大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌+肺炎克雷伯菌各4例(11.11%)，金黃色葡萄球菌+鮑氏不動(dòng)桿菌3例(8.33%)，變形桿菌+糞腸球菌、變形桿菌+摩氏摩根菌、糞腸球菌+摩氏摩根菌各2例(5.56%)。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，混合感染組創(chuàng)面中金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌中MDROs檢出率高于非混合感染組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表1 兩組創(chuàng)面病原菌分布〔n(%)〕

表2 兩組創(chuàng)面病原菌MDROs檢出率的比較〔n(%)〕

2.2兩組外周血T淋巴細(xì)胞亞群比較 混合感染組外周血CD3+T淋巴細(xì)胞比例、CD4+T淋巴細(xì)胞比例、CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值均低于非混合感染組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組外周血T淋巴細(xì)胞亞群比較

2.3兩組臨床特征比較 混合感染組DFU病程、抗菌藥物治療史、Wagner分級為4～5級比例、HbA1c水平高于非混合感染組，ABI和TcPO2水平低于非混合感染組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 兩組臨床特征比較

2.4DFI患者混合細(xì)菌感染的相關(guān)因素分析 將上述有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的指標(biāo)作為自變量納入Logistic多元回歸模型進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，老年DFI混合細(xì)菌感染的發(fā)生與抗菌藥物治療史、Wagner分級、ABI、TcPO2、CD4+T淋巴細(xì)胞比例、CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值具有相關(guān)性(P<0.05)，其中，抗菌藥物治療史、Wagner分級為危險(xiǎn)因素，ABI、TcPO2、CD4+T淋巴細(xì)胞比例、CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值為保護(hù)因素。見表5。

表5 老年DFI混合細(xì)菌感染相關(guān)因素的Logistic多元回歸分析

3 討 論

與非老年DM患者相比較，老年DM患者的血糖波動(dòng)幅度大、低血糖發(fā)生率較高、血糖波動(dòng)具有性別差異、預(yù)后與HbA1c密切相關(guān)，上述血糖波動(dòng)特點(diǎn)導(dǎo)致老年DM患者的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)更加嚴(yán)重，血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙更加明顯，同時(shí)，老年DM患者還具有機(jī)體器官功能減退、組織修復(fù)和再生能力降低等生理變化，常規(guī)合并有多種基礎(chǔ)慢性代謝疾病，導(dǎo)致其DFU愈合速度明顯低于非老年患者，感染程度更加嚴(yán)重，治療難度更高。本研究結(jié)果可見，在老年DFI患者中，混合細(xì)菌感染病例的占比較高，超過了40%，這與相關(guān)研究〔10〕報(bào)道的水平基本一致。本研究報(bào)道了大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌是引起DFI的主要病原菌，相關(guān)研究〔11〕結(jié)果與本研究結(jié)果一致，但有研究〔12〕中也得出了差異化的結(jié)論，這可能與選取的研究對象在病變程度和抗菌藥物應(yīng)用史方面存在異質(zhì)性有關(guān)。DFI的感染類型比較多樣，包括了淺表的蜂窩織炎、皮膚淺表感染性潰瘍和深部的軟組織膿腫、壞死性筋膜炎、骨髓炎、壞疽等，相關(guān)的病原學(xué)研究〔13〕結(jié)果顯示，未接受過抗菌藥物治療的急性DFI通常由葡萄球菌和鏈球菌引發(fā)，在臨床實(shí)踐中針對輕度的局灶性淺表潰瘍DFI的經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療通常是針對金黃色葡萄球菌和鏈球菌。然而，深部潰瘍DFI則多由混合細(xì)菌感染所致，病原菌不僅包括革蘭陽性球菌，而且包括大腸埃希菌、克雷伯菌、產(chǎn)氣腸桿菌、變形桿菌等革蘭陰性桿菌和脆弱類桿菌、消化鏈球菌等厭氧菌，這導(dǎo)致了不同病情患者創(chuàng)面病原菌構(gòu)成出現(xiàn)了明顯的差異，加之相當(dāng)一部分患者在入院前已接受了全身性或局部抗菌藥物治療，進(jìn)一步對創(chuàng)面的病原菌分布狀態(tài)產(chǎn)生影響。通過本研究可見，混合細(xì)菌感染DFI患者的主要?jiǎng)?chuàng)面病原菌的MDROs檢出率較高，相關(guān)研究〔14〕結(jié)果顯示，DFI的病原學(xué)特點(diǎn)主要是兩種或兩種以上細(xì)菌混合感染占比較高和所感染的病原菌對多種抗菌藥物耐藥性較強(qiáng)，而在過去十年中，DFI病原菌的重要變化趨勢是MDROs檢出率的增加，其中，最重要的病原菌是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)和產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)大腸埃希菌，故金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌也是臨床上最常見的MDROs菌株。DFI中混合細(xì)菌感染和MDROs菌株的出現(xiàn)具有密切的相關(guān)性，相關(guān)研究〔15〕證實(shí)，混合細(xì)菌感染是導(dǎo)致DFI患者M(jìn)DROs感染風(fēng)險(xiǎn)升高的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而MDROs感染進(jìn)一步提升了抗感染治療難度，從而導(dǎo)致了創(chuàng)面難愈和DFU復(fù)發(fā)，最終提升了患者的截肢和死亡風(fēng)險(xiǎn)。這提示了臨床醫(yī)生在DFI治療中應(yīng)注意進(jìn)行創(chuàng)面病原學(xué)的分離和鑒定，對于混合細(xì)菌感染患者應(yīng)高度警惕MDROs感染的發(fā)生，在臨床治療中盡量依據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選取敏感性抗菌藥物開展抗感染治療。

通過本研究結(jié)果可見，除抗感染治療史外，DFU病情、末梢血管灌注和供氧情況、機(jī)體免疫功能均可對DFI混合細(xì)菌感染風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)生影響。在本研究選取的觀察指標(biāo)中，Wagner分級是學(xué)術(shù)界公認(rèn)的反映DFU病變程度的可靠指標(biāo)，相關(guān)研究〔16〕結(jié)果顯示，隨著DFU病變程度的加重，不僅病原菌中革蘭陰性桿菌的感染率升高，而且混合細(xì)菌感染概率和病原菌耐藥性也會(huì)顯著提升，MRSA、產(chǎn)ESBLs革蘭陰性腸桿菌等MDROs菌株的檢出率也隨之增加。ABI是一種簡便易行、無創(chuàng)血管灌注評價(jià)方法，已被用于冠心病、急性冠狀動(dòng)脈綜合征、外周血管疾病、2型糖尿病、腎功能不全等疾病的診斷和評價(jià)之中，相關(guān)研究〔17〕證實(shí)，隨著ABI的降低，DFI患者的下肢缺血程度加重，患者細(xì)菌感染程度與ABI呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。TcPO2能夠直接反映皮膚組織細(xì)胞的氧合狀態(tài)，從而提示局部血液循環(huán)情況，而DFI病變的直接原因是下肢皮膚微循環(huán)功能障礙導(dǎo)致皮膚氧供應(yīng)減少，故TcPO2可用于準(zhǔn)確評價(jià)DFI病變局部末梢的缺血缺氧程度，相關(guān)研究〔18〕結(jié)果顯示，DFI患肢足背ABI和動(dòng)脈血流量與TcPO2水平均呈正相關(guān)關(guān)系，并可預(yù)測DFU創(chuàng)面的細(xì)菌清除效果和遠(yuǎn)期愈合情況。上述三個(gè)指標(biāo)能夠綜合性反映DFU的宏觀病情和末梢組織灌注狀態(tài)，DFU病情的加重一般會(huì)導(dǎo)致創(chuàng)面加深和局部細(xì)菌清除能力的下降，最終通過影響創(chuàng)面病原菌的分析提升了混合細(xì)菌感染的發(fā)生率。本研究結(jié)果提示DFI患者機(jī)體免疫功能的下降與混合細(xì)菌感染風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，其原因可能包括以下方面：①DFI患者的免疫功能下降可加重病原微生物的感染程度和深部感染風(fēng)險(xiǎn)〔19〕，從而提升了混合細(xì)菌感染風(fēng)險(xiǎn)；②DFI患者機(jī)體免疫功能的下降可引起血清促炎因子的反應(yīng)性過表達(dá)和皮質(zhì)醇水平的升高，而全身性炎癥反應(yīng)的加重進(jìn)一步促進(jìn)了免疫內(nèi)環(huán)境紊亂、血管內(nèi)皮功能損害、凝血功能障礙等病理改變〔20〕，從而導(dǎo)致了機(jī)體對病原菌的防御和清除下降，最終提升了混合細(xì)菌感染風(fēng)險(xiǎn)；③在DFU的病理過程中，病灶局部存在著由肥大細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、單核細(xì)胞等參與的免疫調(diào)節(jié)和主動(dòng)角化過程〔21〕，而免疫細(xì)胞水平的降低可影響皮膚局部的免疫調(diào)節(jié)能力，從而造成再上皮化障礙、影響創(chuàng)面的愈合過程、提升混合細(xì)菌感染的風(fēng)險(xiǎn)。這提示了臨床醫(yī)生應(yīng)對DFI患者的病情狀態(tài)和免疫功能進(jìn)行全面的評價(jià)，并積極采取干預(yù)措施，努力糾正免疫功能失衡和血管灌注障礙，從而達(dá)到降低混合細(xì)菌感染率、加速創(chuàng)面病原菌清除、促進(jìn)創(chuàng)面愈合的目的。

由于患者的臨床資料有限，本研究未對負(fù)壓吸引等局部治療因素及抗菌藥物種類等因素進(jìn)行研究，也未對患者的肝腎功能、其他慢性并發(fā)癥情況進(jìn)行分析，這是不足之處。