龐星月 萬(wàn) 林 李 素 王宇航 劉 晨 肖曉璐 李心昊 馬 霓

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，430062，湖北武漢）

油菜是我國(guó)第一大油料作物，年種植面積達(dá)600萬(wàn)hm2以上，其中長(zhǎng)江流域約占85%[1]，近年來(lái)以直播種植方式為主[2]。然而南方秋冬季節(jié)干旱頻繁，油菜播種后容易出現(xiàn)出苗慢、出苗不齊、冬前弱苗和死苗等現(xiàn)象，難以實(shí)現(xiàn)壯苗齊苗，導(dǎo)致油菜籽產(chǎn)量和種植效益下降，影響了農(nóng)民的種植積極性，產(chǎn)生大量的冬閑田[3-4]。因此，解決干旱脅迫下油菜種子萌發(fā)和出苗困難等問(wèn)題，對(duì)擴(kuò)大油菜種植面積、減少冬閑田、提高我國(guó)食用油供給能力具有重要意義。

獨(dú)腳金內(nèi)酯（SLs）是一組類胡蘿卜素衍生的倍半萜激素，可誘導(dǎo)寄生性雜草的種子萌發(fā)[5]，在調(diào)控植物對(duì)生物和非生物脅迫的反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[6]。Van等[7]研究證明，在擬南芥中，SLs是植物對(duì)非生物脅迫（如鹽和干旱脅迫）的正向調(diào)節(jié)因子。在鹽脅迫條件下，外源SLs可以增加油菜葉片抗氧化物酶活性，降低活性氧含量，促進(jìn)油菜幼苗生長(zhǎng)[8]。并且SLs能顯著提高干旱脅迫下谷子發(fā)芽率和抗旱指數(shù)[9]。萬(wàn)林等[10]研究發(fā)現(xiàn)，0.18μmol/L SLs處理能加快干旱條件下油菜葉綠素合成，提高葉片抗氧化能力，有效增強(qiáng)油菜苗期抗旱性。

納米材料具有獨(dú)特的物理及化學(xué)特性[11]，與傳統(tǒng)化學(xué)藥劑相比，更安全高效且不易產(chǎn)生抗藥性，被廣泛應(yīng)用于納米農(nóng)藥、種子包衣劑和納米肥料等農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中[12]。姜余梅等[13]發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)濃度的碳納米管可以促進(jìn)水稻種子發(fā)芽和根系生長(zhǎng)，可提高根系活力。外施富勒烯對(duì)油菜種子萌發(fā)有顯著促進(jìn)作用[14]。納米鉬酸鉀（n-K2MoO4）作為一種新型納米材料，近年來(lái)，在金屬防銹顏料、化學(xué)催化、抗菌材料、電極電池材料、熒光材料、阻燃抑煙劑及閃爍探測(cè)等方面已有良好應(yīng)用[15]，本團(tuán)隊(duì)前期研究認(rèn)為n-K2MoO4可以增加油菜對(duì)菌核病的抗性，提高產(chǎn)量，且與農(nóng)藥混合配施能提高藥效（未發(fā)表）。因此，為促進(jìn)2種物質(zhì)在油菜生產(chǎn)上的應(yīng)用，本研究采用添加外源SLs和n-K2MoO4處理，比較干旱脅迫下油菜種子萌發(fā)過(guò)程中形態(tài)和生理指標(biāo)的變化規(guī)律，探討調(diào)控種子萌發(fā)和抗旱性的生理機(jī)制，為油菜栽培技術(shù)和產(chǎn)品研發(fā)轉(zhuǎn)化奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料是甘藍(lán)型油菜品種Q2（抗旱型）和秦優(yōu)8號(hào)（干旱敏感型），分別由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所和咸陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。SLs類似物GR24（純度≥98%）購(gòu)于上海翊圣生物有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

挑選大小一致、形態(tài)飽滿的種子，用75%酒精消毒10s，5%次氯酸鈉消毒5min，蒸餾水漂洗數(shù)次，用濾紙吸干水分。將消毒后的種子置于鋪有3層濾紙、直徑為90mm的玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)。每皿60粒種子，每個(gè)處理3個(gè)培養(yǎng)皿，3次重復(fù)，加入6mL處理液。用聚乙二醇6000（PEG）模擬干旱脅迫，根據(jù)SLs、n-K2MoO4和SLs+n-K2MoO4各4個(gè)濃度梯度的預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，分別設(shè)置處理液為蒸餾水（CK1），15% PEG（CK2），0.10μmol/L GR24+15% PEG（T1），0.24mmol/Ln-K2MoO4+15% PEG（T2），0.10μmol/L GR24+0.24mmol/L n-K2MoO4+15% PEG（T3），SLs和n-K2MoO4溶于15% PEG溶液中。將培養(yǎng)皿放到人工氣候箱（三洋MLR-350）中，在光照/黑暗25℃16h/20℃8h、濕度70%條件下發(fā)芽。每2d更換底部濾紙，加入各處理液5mL。試驗(yàn)重復(fù)多次，7d后取樣測(cè)定幼苗農(nóng)藝性狀和生理指標(biāo)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù) 每天觀察并統(tǒng)計(jì)供試材料發(fā)芽情況，以胚根長(zhǎng)度不小于種子直徑一半作為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)。以幼莖直立，子葉平展，子葉由淡黃轉(zhuǎn)為綠色為出苗標(biāo)準(zhǔn)。各指標(biāo)計(jì)算方法[14]如下：發(fā)芽率（germination rate，GR，%）=發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)×100；平均發(fā)芽時(shí)間（mean germination time，MT）=∑(ni×di/n)，式中，ni為第i天發(fā)芽種子數(shù)，di為開始播種天數(shù)，n為發(fā)芽的種子總數(shù)；發(fā)芽指數(shù)（germination index，GI）=(n1/1)+(n2/2)+…(ni/i)，式中，n1，n2，…，ni為第1，2，…，i天發(fā)芽數(shù)量；活力指數(shù)（vigour index，VI）=發(fā)芽率×（根長(zhǎng)+胚芽長(zhǎng)）。

1.3.2 胚根長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)及干重 發(fā)芽7d后取長(zhǎng)勢(shì)一致的10棵幼苗，分別測(cè)定苗高、胚根長(zhǎng)和側(cè)根數(shù)。測(cè)量完后將子葉和胚根放入烘箱中，105℃殺青30min，80℃烘干至恒重，稱地上和地下干重。所有性狀取10個(gè)幼苗的平均值。

1.3.3 葉綠素含量 采用分光光度法測(cè)定幼苗葉片葉綠素含量，葉綠素a（Chl a）、葉綠素b（Chl b）和類胡蘿卜素分別在665、649和470nm有最大吸收峰。取0.2g葉片，用95%乙醇提取油菜葉片葉綠素，根據(jù)分光光度計(jì)測(cè)定的吸光值，計(jì)算葉綠素含量[16]。

1.3.4 生理指標(biāo) 幼苗葉片超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化物酶（POD）活性及丙二醛（MDA）、過(guò)氧化氫（H2O2）、超氧陰離子（O-2·）、脯氨酸（Pro）和可溶性糖（SS）含量均由北京索萊寶科技有限公司的相應(yīng)試劑盒測(cè)定，每個(gè)指標(biāo)重復(fù)3次。SOD、POD和MDA測(cè)定試劑盒所用提取液為同一種，可同時(shí)測(cè)定。以上測(cè)量指標(biāo)所用樣品質(zhì)量分別為0.1g，測(cè)定步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2007錄入數(shù)據(jù)和計(jì)算，利用SigmaPlot 10.0軟件繪圖，SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的單因素方差分析（One-way ANOVA）和相關(guān)性分析（pearson correlation coefficient），采用LSD法測(cè)驗(yàn)α＜0.05水平上的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)油菜種子萌發(fā)性狀的影響

由表1可知，與CK1處理相比，干旱脅迫（CK2）顯著降低了秦優(yōu)8號(hào)種子GR，使2個(gè)品種的種子發(fā)芽時(shí)間增加。CK2處理Q2和秦優(yōu)8號(hào)的GR、GI、VI與對(duì)照（CK1）比均有所降低。CK2處理下，Q2種子GR、GI、VI和出苗率分別比CK1處理降低了1.11%、47.50%、90.02%和63.63%；秦優(yōu)8號(hào)相應(yīng)指標(biāo)分別降低了59.33%、85.45%、96.36%和82.76%。干旱脅迫（CK2）下，Q2的GR、GI、VI和出苗率均顯著高于秦優(yōu)8號(hào)。

表1 干旱和SLs、n-K2MoO4對(duì)干旱脅迫下油菜種子萌發(fā)性狀的影響Table 1 Effects of drought and SLs、n-K2MoO4on the germination traits of rapeseed under drought stress

外源SLs和n-K2MoO4處理后種子GR、GI和VI明顯高于CK2處理（表1），其中T3處理促進(jìn)種子出苗效果最好，Q2種子GR、GI、VI和出苗率比CK2處理分別提高1.12%、65.97%、268.79%和114.03%；秦優(yōu)8號(hào)的T3處理比CK2處理分別提高143.15%、512.78%、1027.13%和196.58%。

2.2 干旱脅迫和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)油菜幼苗農(nóng)藝性狀的影響

由表2可知，PEG脅迫使Q2和秦優(yōu)8號(hào)的干重、主根長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)和側(cè)根長(zhǎng)與CK1處理相比均有降低。Q2種子幼苗干重、主根長(zhǎng)、側(cè)根長(zhǎng)和側(cè)根數(shù)分別比CK1處理（正常條件）降低了17.57%、81.08%、84.20%和75.00%；秦優(yōu)8號(hào)相應(yīng)指標(biāo)分別降低了20.65%、71.05%、92.36%和85.71%，差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。

表2 干旱和SLs、n-K2MoO4對(duì)干旱脅迫下油菜幼苗農(nóng)藝性狀的影響Table 2 Effects of drought and SLs、n-K2MoO4on the agronomic traits of rape seedlings under drought stress

T1、T2和T3處理下2個(gè)品種的種子主根長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)及幼苗生長(zhǎng)勢(shì)均與CK2（干旱脅迫）有顯著性差異。T1處理下，Q2的干重、主根長(zhǎng)、側(cè)根長(zhǎng)和側(cè)根數(shù)分別比CK2處理提高了47.07%、774.29%、183.04%和400.00%；秦優(yōu)8號(hào)相應(yīng)指標(biāo)分別比CK2處理提高了27.57%、430.24%、1021.88%和1000.00%，差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。

2.3 干旱脅迫和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)幼苗葉片葉綠素含量的影響

由表3可知，大部分干旱處理顯著降低了油菜葉片的葉綠素含量。Q2的Chl a、Chl b、Chl a+b和Chl a/Chl b的降低率分別為19.15%、12.73%、17.03%和7.39%；秦優(yōu)8號(hào)分別為19.32%、16.62%、18.33%和3.51%。干旱脅迫下，外源SLs和n-K2MoO4顯著降低了葉綠素含量的降低幅度，其中T2處理的作用更明顯，Q2的Chl a、Chl b、Chl a+b和Chl a/Chl b分別增加了39.06%、23.18%、33.54%和12.77%；秦優(yōu)8號(hào)分別為45.52%、44.11%、44.87%和3.64%，差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。

表3 干旱和SLs、n-K2MoO4對(duì)干旱脅迫下油菜葉片葉綠素含量的影響Table 3 Effects of drought and SLs、n-K2MoO4on chlorophyll content of rape seedlings under drought stress mg/g FW

2.4 干旱脅迫和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)油菜幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

如圖1所示，干旱脅迫提高了SOD和POD活性，與CK1處理相比，Q2幼苗葉片SOD和POD活性分別提高了14.03%和193.33%，秦優(yōu)8號(hào)分別提高了11.53%和51.29%。在15% PEG中加入SLs、n-K2MoO4的處理能顯著提高這2種酶的活性，T1處理與CK2處理相比，Q2幼苗葉片SOD和POD活性分別增加了21.44%和58.00%；秦優(yōu)8號(hào)SOD和POD活性分別增加了26.50%和44.23%。T2與CK2處理相比，Q2中SOD和POD活性分別增加了22.81%和37.69%；秦優(yōu)8號(hào)中SOD和POD活性分別增加了15.72%和45.63%。T3與CK2處理相比，Q2中SOD和POD活性分別增加了38.78%和36.69%；秦優(yōu)8號(hào)中SOD和POD活性分別增加了33.52%和324.04%。

圖1 干旱和SLs、n-K2MoO4處理對(duì)油菜葉片SOD和POD活性的影響Fig.1 Effects of drought and SLs,n-K2MoO4on the SOD and POD activities of oilseed rape leaves

2.5 干旱脅迫和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)油菜幼苗葉片活性氧含量的影響

由圖2可知，15% PEG顯著提高了油菜子葉中的活性氧含量，與對(duì)照處理相比，Q2子葉中O-2·、H2O2和MDA含量分別上升了91.62%、49.86%和517.42%，秦優(yōu)8號(hào)分別上升了192.18%、48.56%和559.62%。在15% PEG中加入SLs、n-K2MoO4的處理顯著降低了O-2·的含量，T1與CK2處理相比，Q2的O-2·、H2O2和MDA含量分別減少了37.73%、16.10%和23.10%；秦優(yōu)8號(hào)中三者含量分別減少了56.14%、21.04%和62.89%。T2與CK2處理相比，Q2中O-2·、H2O2和MDA含量分別減少了34.49%、21.06%和31.92%；秦優(yōu)8號(hào)中三者含量分別減少了46.20%、10.37%和49.69%。T3與CK2處理相比，Q2中O-2·、H2O2和MDA含量減少了40.81%、14.82%和74.11%；秦優(yōu)8號(hào)中三者含量分別減少了54.01%、23.52%和75.22%。

圖2 干旱和SLs、n-K2MoO4處理對(duì)油菜葉片活性氧含量的影響Fig.2 Effects of drought and SLs,n-K2MoO4on the active oxygen contents of oilseed rape leaves

2.6 干旱脅迫和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)油菜幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

與正常處理相比，滲透脅迫提高了葉片中SS和Pro含量（圖3），Q2分別增加了79.34%和674.31%；秦優(yōu)8號(hào)分別增加了10.34%和348.05%。SLs、n-K2MoO4處理提高SS和Pro含量，T1與CK2處理相比，Q2葉片中SS和Pro含量分別提高了20.64%和57.93%；秦優(yōu)8號(hào)葉片中SS和Pro含量分別提高了42.67%和197.81%。T2與CK2處理相比，Q2葉片中SS和Pro含量分別提高了38.07%和48.28%；秦優(yōu)8號(hào)葉片中SS和Pro含量分別提高了22.62%和158.73%。T3與CK2處理相比，Q2葉片中SS和Pro含量分別提高了63.35%和157.03%；秦優(yōu)8號(hào)葉片中SS和Pro含量分別提高了21.75%和292.15%。

圖3 干旱和SLs、n-K2MoO4處理對(duì)油菜葉片SS和Pro含量的影響Fig.3 Effects of drought and SLs,n-K2MoO4on soluble sugar and proline contents of rape leaves

2.7 干旱脅迫下種子萌發(fā)相關(guān)指標(biāo)與幼苗生理指標(biāo)相關(guān)性分析

由表4可知，種子萌發(fā)相關(guān)指標(biāo)中GR、GI、VI與DW之間存在極顯著或顯著正相關(guān)，與平均發(fā)芽時(shí)間為極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。種子萌發(fā)相關(guān)指標(biāo)（GR、GI和VI）與 MDA、H2O2和 O-2·之間存在極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。Pro和SS含量與DW、SOD、POD活性為顯著或極顯著正相關(guān)，但和LRL為極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。

表4 種子萌發(fā)相關(guān)指標(biāo)與幼苗生理指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)Table 4 Correlation coefficients between seed germination parameters and physiological indexes in seedlings

3 討論

種子萌發(fā)是植物生長(zhǎng)過(guò)程中的起始階段，也是保證出苗的前提[17]。而干旱會(huì)常造成油菜種子發(fā)芽延緩、生長(zhǎng)緩慢和干物質(zhì)積累減少[18-19]。作物萌發(fā)期干旱常用高滲溶液模擬，如聚乙二醇、甘露醇和蔗糖等，15%濃度以上的PEG能顯著抑制作物種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)及幼苗生物量[20]。胡承偉等[21]發(fā)現(xiàn)，14% PEG滲透脅迫明顯抑制油菜根鮮重和側(cè)根數(shù)目。這些與本研究結(jié)果一致。另外，本研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫嚴(yán)重影響根長(zhǎng)生長(zhǎng)，而且抗旱性品種Q2在干旱脅迫下具有較高的GR、GI和VI。

MDA是膜脂過(guò)氧化的主要產(chǎn)物之一[22]，可作為植物細(xì)胞膜損傷程度的指標(biāo)[23]。干旱脅迫在細(xì)胞水平上顯著加速ROS的生成[24-26]，ROS的自由基主要包括O-2·、過(guò)羥基自由基（HO2）和烷氧自由基（RO），而H2O2和單線態(tài)氧（O2）則以非自由基的分子形式存在[27-28]。本萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)果表明，干旱脅迫下，與正常供水相比，Q2子葉中MDA和O-2·含量上升幅度低于秦優(yōu)8號(hào)，說(shuō)明抗旱油菜品種受干旱傷害較輕。SOD是超氧化物的主要清除劑，產(chǎn)生H2O2，由POD通過(guò)酚類化合物或抗氧化劑分解H2O2[28-29]，從而提高植物抗旱能力。本研究在干旱處理后，2個(gè)油菜品種SOD和POD活性顯著上升。Pro和SS通過(guò)降低細(xì)胞滲透勢(shì)來(lái)維持細(xì)胞膨壓，防止細(xì)胞脫水，減輕逆境對(duì)細(xì)胞的傷害[30]。本研究結(jié)果表明干旱處理后抗旱品種Q2的Pro和SS含量較高。

SLs可以促進(jìn)種子萌發(fā)，調(diào)控根系構(gòu)型，增加根毛長(zhǎng)度，促進(jìn)次生生長(zhǎng)[31-32]，外施SLs可顯著緩解上述干旱脅迫對(duì)植物造成的傷害。納米材料因獨(dú)特的物理和化學(xué)特性廣泛應(yīng)用于植物生產(chǎn)中，可刺激植物生長(zhǎng)，改善植物的生長(zhǎng)環(huán)境，促進(jìn)植物代謝[33]。本研究中SLs和n-K2MoO4分別處理以及SLs+n-K2MoO4處理顯著緩解了干旱對(duì)敏感品種油菜種子萌發(fā)的抑制，尤其是SLs+n-K2MoO4對(duì)油菜種子GR的促進(jìn)作用最大。而本研究中SLs+n-K2MoO4互作對(duì)種子根長(zhǎng)和側(cè)根數(shù)的促進(jìn)作用小于SLs和n-K2MoO4各自處理，其作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

Mojde等[32]發(fā)現(xiàn)，SLs處理的植物對(duì)干旱脅迫有較強(qiáng)的耐受性，具有較高的抗氧化物酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。納米材料可促進(jìn)逆境脅迫下植物SOD、POD和CAT活性升高[33]。本研究中，SLs、n-K2MoO4處理后各油菜品種 MDA、H2O2、O-2·含量都顯著下降，說(shuō)明SLs和n-K2MoO4對(duì)干旱造成的MDA、H2O2和O-2·含量升高具有抑制作用，SLs和n-K2MoO4可以緩解干旱對(duì)油菜幼苗傷害。另外，SLs和n-K2MoO4提高油菜幼苗SOD、POD活性和SS、Pro含量，也從側(cè)面說(shuō)明油菜幼苗抗旱性有所增強(qiáng)。其中0.10μmol/LGR24+0.24mmol/Ln-K2MoO4對(duì)SOD和POD活性的促進(jìn)作用以及對(duì)MDA含量的抑制效果更加明顯。

4 結(jié)論

抗旱品種Q2在干旱脅迫后種子GR、GI、VI、出苗率、芽長(zhǎng)及SOD、POD活性、SS、Pro含量高于干旱敏感型品種秦優(yōu)8號(hào)，MDA、H2O2、O-2·含量低于秦優(yōu)8號(hào)。SLs、n-K2MoO4對(duì)干旱引起的種子出苗率低和幼苗生長(zhǎng)慢等現(xiàn)象均有一定的緩解作用，SLs主要促進(jìn)種子根系生長(zhǎng)和側(cè)根分化，n-K2MoO4主要增加了葉片葉綠素含量，而SLs+n-K2MoO4處理對(duì)干旱脅迫下種子萌發(fā)出苗和緩解細(xì)胞氧化損傷的效應(yīng)較好。