姜玉松 李洪雷 李哲馨 徐曉玉 李隆云 黃孟軍,

（1西南大學資源環(huán)境學院，400715，重慶；2重慶文理學院特色植物研究院，402160，重慶；3重慶市中藥研究院中藥生藥研究所，400065，重慶）

植物轉錄因子種類繁多，包括MYB[1-2]、CBF[3-4]、NAC[5-6]和 WRKY[7]等，其中 WRKY 家族是植物特有的轉錄調控因子，含有一段約60個氨基酸殘基的WRKY保守結構域，包括N端的WRKYGQK七肽序列和C端的鋅指結構（zincfinger motif）[8]。根據(jù)WRKY結構域數(shù)目的差異，WRKY蛋白可分為Ⅰ和Ⅱ亞族，其中亞族Ⅰ含有2個WKRY結構域，其他亞族含有1個WKRY結構域[9]；結合C端鋅指結構域的差異，又可分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ亞族，其中Ⅱ亞族又細分為Ⅱ-a+Ⅱ-b、Ⅱ-c和Ⅱ-d+Ⅱ-e 亞組[10]。

WRKY轉錄因子廣泛參與植物系統(tǒng)發(fā)育[11-12]、逆境應答[13-14]和轉錄激活[15-16]等過程。LbWRKY3基因參與枸杞（Lycium barbarum L.）果實生長發(fā)育調控[17]；CaWRKY40和CaWRKY6在辣椒（Capsicum annuum）應答青枯菌和高溫脅迫的過程中具有正向調控作用[18]；MeWRKY20、MeWRKY21和MeWRKY24等16個WRKY基因調控木薯（Manihot esculenta）抗細菌性病害響應[19]。近年來，隨著大規(guī)模高通量測序的開展，越來越多的物種完成了WRKY家族信息的鑒定，如擬南芥包含72個WRKY成員[20]，粳稻和秈稻分別有98和102個[21]，番茄有81個[22]，棉花有116個[23]等。

生姜是姜科植物姜（Zingiber officinale Roscoe）的根狀莖，具有藥食兩用的特點，因具有單位面積產(chǎn)量高和經(jīng)濟效益好等巨大優(yōu)勢，是一種值得推廣的經(jīng)濟作物[24]。然而，生姜在旺盛生長期（6-9月）易遭受環(huán)境水分和青枯菌侵染等脅迫，對其生長、品質和產(chǎn)量有重要的影響。借助生物信息學手段可深入分析生姜對逆境脅迫的響應，挖掘抗性基因，解析轉錄因子介導的抗性調控機制。由于生姜基因組雜合性較高的限制，基因組測序工作一直沒有完成，導致分子生物學研究相對遲緩，特別是關于生姜ZoWRKY轉錄因子的研究更為少見。本研究在生姜轉錄組數(shù)據(jù)分析的基礎上，鑒定了ZoWRKY家族成員，并分析了不同土壤濕度和青枯菌侵染下ZoWRKY基因的逆境響應模式，對后續(xù)開展ZoWRKY轉錄因子功能研究、推進生姜抗性育種和提高生姜產(chǎn)量具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗以生姜品種西南竹根姜（Zingiber officinale Roscoe cv.Zhugen）為材料。生姜組培苗栽培于重慶文理學院特色植物研究院溫室。溫度30℃，土壤濕度（充水孔隙度，water-filled pore spaces，WFPS）為10%、25%、30%和 40%，光強200μE/(m2·s)，光周期為14h光照/10h黑暗），生長至3股杈（約90d）時進行青枯菌（Ralstonia solanacearum）侵染處理。侵染接種前，對各濕度條件下的生姜根莖進行創(chuàng)傷，然后用濃度為106cfu/mL的青枯菌懸浮液對處理組生姜的土壤進行浸漬接種，同時，以無菌水接種為對照。生長至6個月，收集不同土壤濕度和青枯菌侵染處理的生姜地下肉質根、地下根莖、地上莖和葉片等組織，置于液氮中快速冷凍，-80℃中保存用于提取RNA。

1.2 RNA-Seq測序

按照Trizol試劑盒說明書分別提取生姜各組織總RNA，經(jīng)檢測合格后等量混合，基于Illumina公司Hiseq 4000（Illumina，美國）平臺進行轉錄組測序，采用Trinity軟件拼接獲取Unigenes。

1.3 ZoWRKY轉錄因子基因篩選

利用Galaxy網(wǎng)站（https://usegalaxy.org/）的EMBOSS程序預測生姜Unigenes的開放閱讀框（ORF），獲取生姜Unigenes編碼蛋白質數(shù)據(jù)庫。從EMBL-EBI網(wǎng)站（https://pfam.xfam.org/）下載WRKY保守域種子序列（序列號PF03106），利用HMMER 3.0軟件建立數(shù)值表格型隱馬可夫模型（Profile HMM），檢索生姜Unigenes編碼蛋白質數(shù)據(jù)庫。根據(jù)WRKY保守結構域序列覆蓋度和E值等參數(shù)，利用Perl腳本語言篩選獲得覆蓋度高、置信度高的ZoWRKY轉錄因子序列。

1.4 ZoWRKY轉錄因子的系統(tǒng)進化分析

從PlantTFDB數(shù)據(jù)庫（http://planttfdb_v3.cbi.pku.edu.cn/）下載擬南芥AtWRKY家族蛋白序列作為參考序列，運用MEGA-X的Multiple alignments程序對AtWRKY參考序列和篩選到的ZoWRKY蛋白序列進行多重比對，將比對結果采用鄰接法（neighbor-joining method）構建系統(tǒng)進化樹，參數(shù)設置為Poisson model、Pairwise deletion和Bootstrap（重復1000次）。

1.5 ZoWRKY序列保守結構域分析

利用DNAMAN 7.0軟件分別對篩選到的ZoWRKY蛋白序列進行多序列比對，獲得保守結構域區(qū)域。利用MEME（http://meme-suite.org/）和WebLogo 3（http://weblogo.threeplusone.com/）對ZoWRKY保守結構域序列標簽進行分析。

1.6 ZoWRKY理化性質分析

采用ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）分析ZoWRKY編碼氨基酸序列長度、分子量大小和理論等電點等信息。采用SOPMA（htttp://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/nps.）獲取二級結構相關信息。

1.7 ZoWRKY基因的逆境響應模式分析

從NCBI網(wǎng)站下載不同WFPS（10%、25%、30%和40%）和青枯菌（R.solanacearum）侵染前后的生姜根莖轉錄組數(shù)據(jù)（Bioproject：PRJNA380 972），利用Bowtie 2.0軟件（http://bowtie-bio.source forge.net/bowtie2/index.shtml）將下載的轉錄組reads數(shù)據(jù)與篩選到的ZoWRKY基因進行映射分析。使用Trinity包的Perl腳本語言，計算并歸一化獲得每個ZoWRKY基因的FPKM（Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads）值，分析ZoWRKY基因家族對不同土壤濕度及青枯菌侵染的逆境響應表達水平。

2 結果與分析

2.1 RNA-Seq測序及組裝

用Illumina HiSeq?進行混合RNA樣品二代轉錄組測序，共產(chǎn)生27 645 008對Paired-End reads（表1）。經(jīng)過Trinity組裝、cd-hit-est聚類后獲得381 871條無冗余、長度大于300bp的Unigenes，平均長度為891bp，N50長度為1260bp，最大長度為16 953bp，GC比例為45.30%的340.2Mb生姜轉錄組數(shù)據(jù)。

表1 生姜轉錄組組裝統(tǒng)計Table 1 Statistics of transcriptome assembly in ginger

2.2 ZoWRKY篩選及全長序列的獲取

381 871條Unigenes經(jīng)EMBOSS程序預測獲得106 653條蛋白序列（長度≥150），利用HMMER 3.0軟件質詢WRKY保守域種子序列（序列號PF03106），設置序列覆蓋度＞90%和Independent E value＜0.01，共篩選獲得78條序列不同的ZoWRKY蛋白。參照生姜近緣物種香蕉MaWRKY家族基因序列，其中72條ZoWRKY具有完整的ORF序列，而Zoff188265等6條僅有部分ORF序列。

對 Zoff188265、Zoff210606、Zoff217771、Zoff244943、Zoff295642和Zoff614319等6條無完整ORF序列的ZoWRKY轉錄因子進行Race-PCR擴增。首先基于無完整ORF序列的ZoWRKY序列設計5′和3′端特異性引物，準備好反應所需酶系和體系，然后借助Race-PCR試劑盒（Clontech，Mountain View，美國）分別進行cDNA第1條鏈和第2條鏈的合成。Race-PCR試驗成功獲得其全長ORF序列，其中Zoff614319的ORF長度最短，為600bp，Zoff295642的ORF長度最長，為2499bp。

2.3 ZoWRKY系統(tǒng)進化分析

以擬南芥AtWRKY蛋白序列為指導，利用MEGA-X對AtWRKY和ZoWRKY蛋白序列進行多序列比對，用Neighbor Joining法構建系統(tǒng)進化樹。根據(jù)7個不同亞族的AtWRKY序列與78條ZoWRKY序列的聚類情況，將ZoWRKY轉錄因子分成3個亞族，亞族Ⅰ有14個成員；亞族Ⅱ有55個成員，其中Ⅱ-a、Ⅱ-b、Ⅱ-c、Ⅱ-d和Ⅱ-e分別有10、12、11、14和8個成員；亞族Ⅲ有9個成員（圖1）。

圖1 生姜與擬南芥WRKY轉錄因子家族成員系統(tǒng)進化關系Fig.1 Phylogenetic relationships of WRKY transcription factors in Zingiber and Arabidopsis

2.4 ZoWRKY保守結構域分析

利用MEME和WebLogo3對ZoWRKY序列的保守結構域進行分析，78條ZoWRKY序列均含有高度保守的WRKY結構域（圖2a）。采用在線軟件SWISS-MODEL進行三維結構同源建模，結果（圖2b）顯示，ZoWRKY保守結構域的三維模型與模式植物擬南芥的WRKY結構域高度相似，由β1～β4共4個β-折疊結構域和1個鋅離子（Zn2+）結合位點組成。

圖2 ZoWRKY蛋白保守結構域序列標簽(a)及三維結構模型(b)Fig.2 The sequence tags(a)and three-dimensional structural model(b)of the WRKY conserved domain in ZoWRKY proteins

ZoWRKY亞族保守結構域分析結果（圖3）顯示，亞族成員的WRKY結構域保守度較高，個別成員發(fā)生WRKYGQK七肽域變異和鋅指結構變異。亞族Ⅰ含有2個WRKY保守結構域，根據(jù)其在序列中的位置又進一步分為Ⅰ-N和Ⅰ-C亞族。亞族Ⅰ-N的WRKY七肽域為WRKYGQK，鋅指結構為CX4CX22-23HXH形式。亞族Ⅰ-C的WRKY七肽域中為WRKYGQK，鋅指結構為CX4CX23HXH形式。與亞族Ⅰ不同，亞族Ⅱ和Ⅲ只有1個WRKY保守結構域，根據(jù)亞族Ⅱ的氨基酸序列差異，進一步分為Ⅱ-a、Ⅱ-b、Ⅱ-c、Ⅱ-d和Ⅱ-e。其中，亞族Ⅱ-a、Ⅱ-b、Ⅱ-d和Ⅱ-e的WRKY七肽域和鋅指結構為WRKYGQK和CX5CX23HXH形式，亞族Ⅱ-c的為WRKYGQK和CX4CX23HXH形式。亞族Ⅲ的WRKY七肽域和鋅指結構為WRKYGQK和CX7CX23HXC形式。

圖3 ZoWRKY轉錄因子保守結構域分析Fig.3 Sequence analysis of the WRKY conserved domain in ZoWRKY proteins

2.5 ZoWRKY氨基酸組成及結構預測分析

對ZoWRKY進行ProtParam分析（表2）表明，不同亞族之間的氨基酸殘基數(shù)目、相對分子質量和等電點等理化性質存在差異。亞族Ⅰ的氨基酸殘基數(shù)目最多，平均為490個，相對分子質量最高（53.6kDa）；亞族Ⅱ-a的氨基酸殘基數(shù)目最少，平均為210個，相對分子質量最低（23.5kDa）。ZoWRKY的等電點大多數(shù)在堿性范圍。

表2 ZoWRKY轉錄因子氨基酸理化分析Table 2 Physicochemical analysis of amino acid in ZoWRKY transcription factors

續(xù)表2 Table 2(continued)

通過Sopma網(wǎng)站預測蛋白質二級結構，ZoWRKY成員中α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲等結構在全序列中的占比差異較大，但構成元件中主要為無規(guī)則卷曲，平均占比大于70%。亞族Ⅰ的α-螺旋占比最低，平均為2.63%；亞族Ⅲ的α-螺旋占比最高，平均為17.85%。

2.6 ZoWRKY家族對逆境的響應模式

基于不同WFPS（10%、25%、30%和40%）及青枯菌侵染處理的生姜根莖轉錄組數(shù)據(jù)，分析ZoWRKY基因對逆境脅迫的響應。Zoff129734等7個ZoWRKY基因在高濕度土壤中上調表達，主要分布在亞族Ⅱ-c和Ⅱ-d，其中Zoff204548、Zoff129734、Zoff290286、Zoff407487和 Zoff178498分別上調了2.89、12.52、4.20、3.66和5.26倍。而Zoff193573等14個ZoWRKY基因下調表達，主要分布在亞族Ⅱ-a、Ⅱ-b和Ⅲ中，其中Zoff193573、Zoff224514、Zoff224527、Zoff109660和 Zoff554263分別下調至 0.02、0.06、0.06、0.03和0.04（圖 4a）。

青枯菌侵染分析發(fā)現(xiàn)，Zoff186957等19個ZoWRKY基因顯著響應青枯菌侵染，其中在侵染過程中顯著上調表達的5個主要分布亞族Ⅱ-b和Ⅱ-c中，Zoff147627、Zoff165467、Zoff186957、Zoff244550和Zoff536230分別上調了7.03、3.44、37.62、2.87和 7.38倍。而 Zoff129734等 14個ZoWRKY基因下調表達，主要分布在亞族Ⅰ、Ⅱ-a和Ⅲ中，其中 Zoff129734、Zoff146524、Zoff224526、Zoff258147和Zoff301103分別下調至0.02、0.07、0.17、0.03和0.09（圖4b）。

圖4 ZoWRKY基因對逆境的響應分析Fig.4 Expression analysis of ZoWRKY gene under stress conditions

3 討論

WRKY轉錄因子廣泛存在于植物體內，是植物重要的轉錄調控因子家族，通過功能域識別和結合靶基因啟動子上的順式作用元件W-box（TTGACC）或SURE（糖響應順式作用元件）[25]，調控靶基因在轉錄水平上的重編程，在植物生長發(fā)育、代謝等生理過程及應答環(huán)境脅迫和防御病原菌侵染等過程都有著重要作用[16]。

基于生姜轉錄組數(shù)據(jù)共篩選鑒定出78個ZoWRKY家族成員，多于擬南芥的72個WRKY基因，少于番茄的81個和蘋果的132個[20,22,26]。由于生姜的基因組測序還未完成，目前的數(shù)據(jù)通過無參考基因組轉錄組測序獲得，而轉錄組測序的深度、拼接效果及基因轉錄時空差異等諸多原因，可能會導致WRKY家族成員鑒定的缺失，其準確性還有待基因組數(shù)據(jù)獲得后開展進一步的驗證。然而，在現(xiàn)有研究條件下，借助轉錄組數(shù)據(jù)挖掘生姜及其他無基因組信息植物的關鍵基因仍是一條重要的途徑。

ZoWRKY聚類為3個亞族，共7個組別，與擬南芥[27]、煙草[28]和蘋果[26]中的分類情況一致，表明WRKY家族成員在物種中保守性較高。ZoWRKY成員含有WRKY序列（WRKYGQK）和鋅指結構（C2H2或C2HC型）為核心的WRKY保守結構域，部分成員的保守結構域中存在WRKYGQK七肽域變異和鋅指結構變異，也展示了WRKY家族的多樣性。序列預測分析顯示，ZoWRKY與基因組完善的物種（如擬南芥和番茄等）WRKY分組數(shù)量、理論等電點及相對分子質量等理化性質相接近，特別是與生姜近緣物種香蕉MaWRKY相似度較高。

WRKY家族成員在植物體內行使多種功能，當植物感知生物或非生物逆境脅迫后，可能啟動一系列ZoWRKY表達，選擇多種內源激素介導的信號通路，進而調控抗性基因轉錄，在抗性和防御反應中發(fā)揮作用。生姜中ZoWRKY成員分別有21個響應土壤濕度和19個響應青枯菌侵染，在Ⅱ-c有共同上調表達的成員，在Ⅱ-a和Ⅲ有共同下調表達的成員。高土壤濕度下呈上調表達的7個ZoWRKY主要聚類在Ⅱ-c和Ⅱ-d，結合與擬南芥同源性較高的AtWRKY8和AtWRKY17功能，推測其主要調控逆境信號通路和脅迫耐受[29]。下調表達的14個ZoWRKY主要分布在Ⅱ-a、Ⅱ-b和Ⅲ，結合同源性較高的AtWRKY40、AtWRKY6及AtWRKY54等功能，推測其主要調節(jié)防御、衰老和氣孔運動等過程[30]；青枯菌侵染引起上調表達的5個ZoWRKY基因主要聚類在Ⅱ-b和Ⅱ-c，結合同源性較高的AtWRKY6和AtWRKY51的功能，推測其主要調控病原體防御和防御反應信號通路[31]。下調表達的14個ZoWRKY主要聚類在Ⅰ、Ⅱ-a和Ⅲ，結合同源性較高的AtWRKY26、AtWRKY18和AtWRKY70等功能，推測其主要參與細胞分化、防御和信號通路選擇[32-33]。

4 結論

WRKY作為植物特有的轉錄因子家族，在生長發(fā)育、信號傳導和逆境脅迫應答中發(fā)揮著重要作用，但關于ZoWRKY轉錄因子鑒定及逆境響應分析還未見報道。本研究借助WRKY保守域種子序列檢索生姜Unigenes編碼蛋白質數(shù)據(jù)庫，共篩選鑒定了78個ZoWRKY成員，分為3個亞族，其中有21個和19個ZoWRKY基因分別響應不同WFPS和青枯菌侵染，參與調節(jié)逆境脅迫下生姜生長發(fā)育和對病原菌的防御反應等過程。結果有助于進一步探究ZoWRKY家族的生物學功能，解析生姜響應環(huán)境變化如何調控ZoWRKY基因轉錄表達，對生姜的抗性育種、提高產(chǎn)量及品質具有重要的意義。