莫為春，陳俊峰，郭朋，趙鑫，王苛苛，楊斐宇，申捷，張志華

1.上海市復(fù)旦大學(xué)化學(xué)傷害與急危重病研究中心＆上海市衛(wèi)生健康委員會(huì)化學(xué)傷害急危重病醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室＆復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院急危重病中心，上海 200540；2.復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院心超室，上海 200540

膿毒癥是感染引起宿主自身的復(fù)雜異常反應(yīng)，造成具有生命危險(xiǎn)的器官功能障礙［1］，為全世界重癥監(jiān)護(hù)室里患者的主要死亡原因之一［2］。膿毒癥可以導(dǎo)致多種器官功能損害，最常見的有肺臟、腎臟、肝臟、心臟等。隨著目前老齡社會(huì)的到來，老年患者明顯增多，老年患者因?yàn)槠鞴俟δ艿臏p弱，更容易發(fā)生膿毒血癥及多臟器功能衰竭。膿毒癥心肌病早有報(bào)道過，Pulido 等［3］報(bào)道膿毒癥心肌病發(fā)病率達(dá)64%，膿毒癥患者伴有心肌功能障礙更容易死亡。心功能障礙是膿毒癥誘導(dǎo)的多器官功能衰竭的一個(gè)嚴(yán)重組成部分，與較高的死亡率相關(guān)［4?5］。膿毒癥導(dǎo)致的心肌功能損害，包括可逆性左心室收縮功能失調(diào)，左心室擴(kuò)大等，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)不僅存在左心室收縮功能失調(diào)而且存在左心室舒張功能失調(diào)、右心室功能失調(diào)，甚至彌漫性心肌功能失調(diào)［6］。但是對(duì)于老年患者膿毒癥導(dǎo)致心肌功能損害出現(xiàn)的時(shí)間，相關(guān)研究極少。本研究通過膿毒癥老年大鼠炎癥因子，常規(guī)心臟超聲檢查結(jié)果及血心肌酶聯(lián)合闡述膿毒癥老年大鼠早期心臟功能的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物SPF 級(jí)同遺傳背景SD 老年雌性大鼠24 只，12月齡，體質(zhì)量（180 ±10）g，上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)營(yíng)部提供（動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2018?0006，動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：20180006022419）。大鼠飼養(yǎng)條件：自由飲食與飲水，室內(nèi)溫度22～24 ℃，室內(nèi)濕度50%～60%，保持飼養(yǎng)環(huán)境安靜，噪音小于80 分貝，保持飼養(yǎng)環(huán)境清潔。實(shí)驗(yàn)經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物符合3R 原則。

1.1.2 主要儀器與試劑臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，上海托莫斯科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)： 1?16R； －80 ℃醫(yī)用低溫保存箱，青島海爾股份有限公司，型號(hào)：Haier DW?86L338J；多功能酶標(biāo)儀，瑞士Tecan（帝肯），型號(hào)：Infinite M1000 Pro；試劑：Lactate dehydrogenase as?say kit，南京建成，貨號(hào)： A020?2?1；試劑： Rat Creatine kinase MB isoenzyme Assay Kit，南京建成，貨號(hào)： H197?1?1；試劑： Rat TroponinⅠAssay Kit，南京建成，貨號(hào)：H149?1?1；試劑： Rat Myoglobin Assay Kit，南京建成，貨號(hào)： H150?1?1。

1.2 方法

1.2.1 老年大鼠膿毒癥模型建立膿毒癥老年大鼠模型通過盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（Cecal Ligation Perfora?tion，CLP）建立，使用戊巴比妥鈉（20 mg／kg，腹膜內(nèi)）麻醉，采用隨機(jī)數(shù)字表將大鼠分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、手術(shù)1 h 組、手術(shù)3 h 組，每組6 只。手術(shù)1 h 組，手術(shù)3 h 組大鼠均予以盲腸結(jié)扎穿孔，建立膿毒癥模型；穿孔后，觀察大鼠出現(xiàn)精神萎靡，活動(dòng)減少，對(duì)于刺激的反應(yīng)減弱，說明造模成功。具體過程如下：

（1）麻醉的大鼠被固定在手術(shù)操作臺(tái)，將大鼠的腹部進(jìn)行備皮，充分暴露大鼠腹部皮膚，通過酒精對(duì)手術(shù)范圍進(jìn)行完全消毒。（2）手術(shù)區(qū)域完成消毒后，將無菌洞巾覆蓋于腹部正中切口區(qū)域。（3）使用手術(shù)刀作一縱向切口（約3 cm）于腹部正中線，逐層切開并鈍性分離皮膚，筋膜，肌肉。固定皮膚與肌肉，暴露手術(shù)區(qū)域。（4）用止血鉗在腹腔左下腹尋找盲腸，提出腹腔內(nèi)盲腸，減少過多腸管在空氣中暴露，同時(shí)將暴露于空氣中的腸管用濕紗布覆蓋，避免腸管因脫水造成腸壞死。（5）將盲腸內(nèi)殘余糞便推入盲腸頂端。（6）自盲腸的頂端向下，利用21 號(hào)針頭進(jìn)行貫通穿刺，穿刺過程中，避免損傷腸壁血管。同時(shí)確保穿刺后能排出少量糞便，穿刺部位的糞便通過生理鹽水進(jìn)行清洗。（7）在1／2 處盲腸通過4 號(hào)縫合線結(jié)扎，避免結(jié)扎太緊造成組織損傷，避免太松不能使盲腸內(nèi)糞便進(jìn)入腹腔。（8）4 號(hào)縫合線逐層縫合腹部肌肉、筋膜、皮膚，關(guān)腹后，碘伏消毒傷口。（9）手術(shù)操作完成后，將大鼠置于22 ℃恒溫籠具內(nèi)，保持充足食物及水。（10）假手術(shù)組同樣予以開腹、暴露盲腸、關(guān)腹等操作，但不進(jìn)行盲腸穿刺與結(jié)扎。

整個(gè)手術(shù)過程在10 min 內(nèi)完成，嚴(yán)格遵循手術(shù)過程中的無菌原則，避免因人為因素導(dǎo)致的感染，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.2 心臟超聲采集操作臺(tái)上固定大鼠四肢，胸部脫毛，使用GE?Vivid E95 超聲診斷儀，探頭L8?18?D，超聲探頭接觸部位涂抹超聲耦合劑，對(duì)大鼠進(jìn)行左室長(zhǎng)軸M 型超聲，常規(guī)多普勒血流速度、組織多普勒超聲檢查。觀察指標(biāo)包括左心室收縮末期及舒張末期的內(nèi)徑和容積、左心室EF、左心室短軸縮短分?jǐn)?shù)、舒張?jiān)缙诙獍暄魉俣菶 峰值、舒張晚期二尖瓣血流速度A 峰、 E／A 比值等。按照美國(guó)超聲心動(dòng)圖協(xié)會(huì)推薦方法進(jìn)行所有數(shù)據(jù)的檢測(cè)與計(jì)算，每組數(shù)據(jù)均為3 個(gè)連續(xù)心動(dòng)周期的平均值。見圖1和圖2。

圖1 老年大鼠四腔心切面

圖2 老年大鼠左室長(zhǎng)軸切面

1.2.3 血清標(biāo)本采集及儲(chǔ)存心臟超聲測(cè)定完成后立即由1 mL 注射器（0.45 mm）經(jīng)腹主動(dòng)脈采血1.0 mL 于真空采血管中（EDTA K2，2.0 mg／mL）／（分離膠-促凝劑）。于4 ℃環(huán)境下直立靜置2 h 后，離心機(jī)4 ℃，4 000 r／分鐘離心5 min，取上層血清于離心管，－80 ℃凍存留待后續(xù)檢測(cè)。

1.2.4 ELISA 測(cè)定細(xì)胞因子及心肌酶譜檢測(cè)?。?0 ℃凍存血清樣本，4 ℃自然融解，根據(jù)試劑盒說明書，通過ELISA 法對(duì)以下指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。（1）細(xì)胞因子：腫瘤壞死因子α （TNF?α）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF?β）、白細(xì)胞介素1β （IL?1β）、白細(xì)胞介素6 （IL?6）、白細(xì)胞介素8 （IL?8）及白細(xì)胞介素10 （IL?10）； （2）心肌酶譜：心肌肌鈣蛋白Ⅰ（TNI），肌酸激酶同工酶（CK?MB），肌酸激酶（CK）及乳酸脫氫酶（LDH）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析，方差齊采用LSD?t 檢驗(yàn)，不齊采用Tamhane'st檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。非正態(tài)分布采用Kruskai?Wallis 檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般行為

正常對(duì)照組老年大鼠活動(dòng)力強(qiáng)，對(duì)于刺激反應(yīng)靈敏。膿毒癥組老年大鼠對(duì)于刺激反應(yīng)減弱，活動(dòng)力減弱，眼角出現(xiàn)分泌物增多以及抽搐的癥狀。

2.2 膿毒癥老年大鼠炎癥因子變化

手術(shù)3 h 組炎癥因子TNF?α、 TGF?β、 IL?10、 IL?1β、 IL?8 較正常對(duì)照組與假手術(shù)組均升高（P＜0.05）。手術(shù)3 h 組的IL?8 較手術(shù)1 h 組升高（P＜0.05）。手術(shù)1 h 組的IL?10、 TNF?α 較正常對(duì)照組與假手術(shù)組均升高（P＜0.05）。手術(shù)1 h 組的TGF?β 較正常對(duì)照組升高（P＜0.05）。見表1。

表1 膿毒癥老年大鼠炎癥因子變化

2.3 膿毒癥老年大鼠心肌酶變化

手術(shù)3 h 組較手術(shù)1 h 組，TNI、CK?MB、CK 均有所升高。但與正常對(duì)照組與假手術(shù)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 膿毒癥老年大鼠心肌酶變化

2.4 膿毒癥老年大鼠心臟超聲變化

手術(shù)3 h 組LVEDs，較對(duì)照組、假手術(shù)組、手術(shù)1 h組升高（P＜0.05）；手術(shù)3 h 組LVEF，較對(duì)照組、假手術(shù)組、手術(shù)1 h 組降低（P＜0.05）；手術(shù)3 h 組LVFS，較對(duì)照組、假手術(shù)組、手術(shù)1 h 組降低（P＜0.05）；手術(shù)3 h 組ESV，較對(duì)照組、假手術(shù)組、手術(shù)1 h 組升高（P＜0.05）；其余超聲指標(biāo)各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表3 膿毒癥老年大鼠心臟超聲指數(shù)變化

3 討論

膿毒癥是ICU 患者的主要死亡原因之一［2］，心功能障礙是與這種危重疾病息息相關(guān)的多器官功能衰竭中的重要組成部分［7］。從2002年發(fā)起拯救膿毒癥的倡議后，膿毒癥治療指南建議6 h 與24 h bun?dle 集束化治療策略，2012年修改為3 h 與6 h bun?dle 集束化治療策略，到2018年的1 h bundle 集束化治療策略，這是對(duì)膿毒癥的不斷認(rèn)識(shí)與理解做出的不斷更新。目前膿毒癥的病死率較前有所下降，但是膿毒癥的發(fā)病率沒有降低，尤其老年患者［8?9］。膿毒性心肌病明顯增加膿毒癥患者的病死率。隨著床旁心臟超聲的廣泛應(yīng)用，對(duì)膿毒性心肌病的認(rèn)識(shí)越來越深入，從以往認(rèn)為可逆性的左心室收縮功能受損及左心室擴(kuò)大到目前的左心室收縮與舒張功能受損、右心室功能受損，甚至彌漫性心肌功能受損［6］。但是老年膿毒癥患者心肌功能損害發(fā)生的時(shí)間目前沒有相關(guān)研究。

本研究通過建立膿毒癥老年大鼠模型，觀察膿毒癥發(fā)生的早期，血清炎癥因子、心肌酶、心臟超聲指標(biāo)的變化。通過研究發(fā)現(xiàn)，手術(shù)1 h 組，部分炎癥因子包括TNF?α、 TGF?β、 IL?10 已經(jīng)開始升高，其中TNF?α、 IL?10 較正常對(duì)照組與假手術(shù)組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），TGF?β 較正常對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。手術(shù)3 h 組，大部分炎癥因子包括TNF?α、 TGF?β、 IL?10、 IL?1β、 IL?8 較正常對(duì)照組與假手術(shù)組均升高（P＜0.05），其中手術(shù)3 h組IL?8 較手術(shù)1 h組進(jìn)一步升高（P＜0.05）。感染發(fā)生后，炎癥因子釋放促進(jìn)了機(jī)體炎癥反應(yīng)的發(fā)生，發(fā)揮主 要 作 用 的 炎 癥 因 子 包 括TNF?α、 IL?6、 IL?8、TGF?β、 IL?10、 IL?1β 等。TNF?α 是炎癥發(fā)生發(fā)展過程中最重要的炎癥因子，可以促使其他的炎癥因子合成與釋放。IL?8 能刺激中性粒細(xì)胞與T 淋巴細(xì)胞的趨化，使內(nèi)皮細(xì)胞損傷，微循環(huán)的血流淤滯與組織壞死，最終損害器官功能。其他炎癥因子包括TGF?β、 IL?10、 IL?1β、 IL?6 均參與炎癥反應(yīng)，與炎癥的發(fā)展密切相關(guān)。炎癥介質(zhì)“瀑布樣釋放”，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加重，以及器官功能損害。假手術(shù)組與正常對(duì)照組的炎癥因子差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明上述炎癥因子的釋放與手術(shù)本身無關(guān)；手術(shù)1 h 組部分炎癥因子開始升高，說明炎癥反應(yīng)已經(jīng)開始，手術(shù)3 h組大部分炎癥因子均已升高，并且與正常對(duì)照組與假手術(shù)組存在差異，提示炎癥因子升高與感染發(fā)生有關(guān)，并在感染后早期即可出現(xiàn)。

“瀑布樣釋放”的炎癥因子，打破了促炎反應(yīng)與抗炎反應(yīng)之間的平衡，造成器官功能損害，包括心臟功能。本研究發(fā)現(xiàn)，手術(shù)1 h 組大鼠的各心臟超聲指標(biāo)較對(duì)照組與假手術(shù)組無變化。手術(shù)3 h 組部分心臟超聲指標(biāo)有變化，包括3 h LVEF，3 h LVFS 較對(duì)照組、假手術(shù)組、手術(shù)1 h 組降低；3 h 左心室收縮末期內(nèi)徑（Left ventricular end?systolic dimension，LVEDs）及3 h收縮末期容積（End?systolic volume，ESV）較對(duì)照組、假手術(shù)組、手術(shù)1 h 組擴(kuò)大，左心室舒張末期內(nèi)徑與容積無變化，符合膿毒性心肌病的特點(diǎn)。本研究的結(jié)果提示在膿毒癥早期3 h 的時(shí)候，左心室已存在收縮功能的損害，而同時(shí)檢測(cè)的手術(shù)1 h 組與3 h 組心肌酶TNI、 CK、 CK?MB、 LDH 與正常對(duì)照組、假手術(shù)組均無變化，提示心肌功能的早期異?？赡芨嗟嘏c炎癥反應(yīng)相關(guān)，而此時(shí)的心肌細(xì)胞尚未壞死，心肌酶未大量釋放。

膿毒癥早期，病原微生物與脂多糖結(jié)合蛋白結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，再與單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞表面的Toll 樣受體結(jié)合，這些細(xì)胞形成并釋放諸多炎癥因子。大量炎癥反應(yīng)因子打破了促炎反應(yīng)與抗炎反應(yīng)的平衡，同時(shí)免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)失控，血管內(nèi)皮功能障礙，內(nèi)皮細(xì)胞損傷以及線粒體功能受損，導(dǎo)致早期的臟器功能障礙，包括早期的心臟功能障礙。目前認(rèn)為還有非正常的新陳代謝與受損的腎上腺素能反應(yīng)也是潛在的驅(qū)動(dòng)力［10］。膿毒癥導(dǎo)致線粒體的結(jié)構(gòu)與功能受到損害，能量供應(yīng)不足，導(dǎo)致線粒體來源的損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）的過度生產(chǎn)，如活性氧物質(zhì)（mtROS）、線粒體DNA 片段（mtDNA）、 n?甲?；?、心磷脂、 ATP、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A 和細(xì)胞色素c［11］。在膿毒癥中，這些分子加劇心肌炎癥與繼發(fā)性心肌病的發(fā)生發(fā)展［12］。

總之，膿毒癥老年大鼠早期（3 h 內(nèi)）已經(jīng)出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，伴有心臟功能障礙，主要表現(xiàn)為左心室收縮功能減弱，左心室收縮末期內(nèi)徑與容積擴(kuò)大，而左心室舒張末期內(nèi)徑與容積無變化，此時(shí)的心肌酶并無變化，提示在膿毒癥早期運(yùn)用超聲心動(dòng)圖監(jiān)測(cè)心功能改變對(duì)膿毒性心肌病的早期診斷和及時(shí)干預(yù)具有重要的臨床價(jià)值。膿毒癥早期心臟功能障礙的發(fā)生機(jī)制可能與炎癥因子、免疫系統(tǒng)失控、血管內(nèi)皮功能受損、氧化應(yīng)激與細(xì)菌毒素致線粒體功能障礙相關(guān)。