張學術，張加盟，曹淑新，李翠，宋智慧

1.唐山市婦幼保健院婦科門診，河北唐山 063000；2.唐山市婦幼保健院優(yōu)生遺傳科，河北唐山 063000；3.唐山市婦幼保健院產(chǎn)科，河北唐山 063000

子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率與人口老齡化相關，主要見于圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后女性，是最常見的女性生殖系統(tǒng)腫瘤之一［1］。有報道［2］證實，當宮頸局部天然屏障功能被破壞，細菌可逆行進入宮腔，形成局部高感染狀態(tài)，引起炎癥發(fā)生，促進子宮內(nèi)膜癌進展，細菌特定的成分和產(chǎn)物對子宮內(nèi)膜癌的進展有正向或負向的調(diào)節(jié)作用。細菌、病毒感染可迅速上調(diào)環(huán)氧化酶?2 和前列腺素E2 水平，進而激發(fā)炎癥［3?4］。并且，二者在子宮內(nèi)膜癌組織高表達，提示同子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展相關［5?6］，COX?2 抑制劑也在子宮內(nèi)膜癌治療中顯示出臨床效果［7?8］。目前，細菌感染對子宮內(nèi)膜癌生長及COX?2 表達影響的研究較為缺乏。本文觀察人子宮內(nèi)膜癌細胞株在脂多糖刺激下的細胞生長增殖及炎癥因子COX?2 水平變化，探討其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人子宮內(nèi)膜癌RL95?2 細胞株采購于上海富衡生物，培養(yǎng)于含10%胎牛血清（Gibco）、 100 μg／mL青霉素、100 μg／mL 鏈霉素、 0.005 mg／mL 胰島素、1 ×GlutaMAXTM（Invitrogen）的DMEM／F12 培養(yǎng)液（Invitrogen）中，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)。

1.2 脂多糖、單抗和抑制劑的加藥處理和分組

用胰蛋白酶消化RL95?2 細胞，按照4 ×104／孔密度接種于96 孔培養(yǎng)板（Corning），每孔100 μL 培養(yǎng)體系，細胞過夜貼壁后，加入各種藥物處理。處理方式如下：采用0～50 μg／mL 脂多糖（L4391，Sigma）刺激細胞24 h，以確定最適濃度；采用5 μg／mL 脂多糖刺激細胞0～72 h，以確定最適孵育時間，上述實驗均設立不做任何處理的control 組。

干預實驗中，將RL95?2 細胞隨機分為5 組： control組、 LPS 組、 LPS ＋CD14 mAb 組、 LPS ＋TAK?242 組、LPS ＋cetuximab 組。control 組：不做任何處理；LPS 組：5 μg／mL LPS 刺激細胞24 h；LPS ＋CD14 mAb 組：5 μg／mL LPS 和10 μg／mL CD14 mAb（MAB3832，R＆D Systems）聯(lián)合干預24 h；LPS ＋TAK?242 組：5 μg／mL LPS 和10 nm｀ol／L TAK?242（614316，Sig?ma）聯(lián)合干預24 h；LPS ＋cetuximab 組：5 μg／mL LPS和10 μg／mL cetuximab（C225，MedChemExpress）聯(lián)合干預24 h。收集細胞或上清液進行后續(xù)檢測。

1.3 MTT 法檢測細胞增殖活力［9］

根據(jù)實驗要求用不同藥物處理細胞24 h 后，更換為含有0.5 mg／mL MTT 試劑（Sigma）的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)于37 ℃孵育培養(yǎng)4 h，小心吸棄上清液，加入100 μL二甲亞砜，避光水平震搖3 min，490 nm 波長讀取吸光度值。

1.4 qRT?PCR 檢測Ki?67 和COX?2 基因水平［10］

如收集各組樣品，裂解細胞、提取總RNA（Bio?sharp）。cDNA 由逆轉錄試劑盒（Qiagen）獲得。qRT?PCR 檢測各基因表達，β?actin 作為管 家基因，在ABI7500 實時定量PCR 系統(tǒng)上操作，擴增程序為：95 ℃預變性10 min；然后95 ℃變性15 s、 55 ℃退火延伸50 s，40 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。Ki?67 引物序列：正向為5′?AGAAGACAGTACCGCAGATGA?3′，反向為5′?CGGCTCACTAATTTAACGCTGG?3′。COX?2 引物序列：正向為5′?TGAGCATCTACGGTTTGCTG?3′，反向為5′?AACTGCTCATCACCCCATTC?3′。β?actin 引物序列：正向為5′?GCA CCA CAC CTT CTA CAA TG?3′，反向為5′? TGC TTG CTG ATC CAC ATC TG ?3′。根據(jù)熒光定量的標準曲線分析獲得循環(huán)閾值（Ct 值），以2?ΔΔCt法和control 組計算目標基因的相對表達量。

1.5 ELISA 檢測PGE2 濃度［11］

細胞經(jīng)不同藥物處理后，每孔用PBS（Invitrogen）清洗細胞2 次，然后更換為含有1% 胎牛血清、5 μmol／L花生四烯酸（10931，Sigma）的DMEM／F12培養(yǎng)液。孵育8 h 后收集細胞上清液，離心后留取上清液，于－80 ℃冰箱保存。PGE2 濃度用ELISA 試劑盒一次性檢測。

1.6 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。所有試驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)± 標準差表示，多個樣本均數(shù)用單因數(shù)方差分析（one way ANOVA），樣本均數(shù)間兩兩比較用Tukey 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 脂多糖對RL95?2 細胞株增殖的影響

首先，檢測脂多糖對人子宮內(nèi)膜癌細胞株增殖的影響，經(jīng)24 h 培養(yǎng)后，在0 ～25 μg／mL 濃度范圍內(nèi)，隨著脂多糖濃度的增加，RL95?2 細胞的生長逐漸增加，表明脂多糖刺激RL95?2 細胞的增殖呈劑量依賴關系；當濃度為50 μg／mL 時，RL95?2 細胞生長下降，表明該濃度的脂多糖具有毒性效應。見圖1。

圖1 不同濃度LPS 對RL95?2 細胞增殖率的影響

用5 μg／mL 的脂多糖處理RL95?2 細胞，0～72 h內(nèi)分別取樣，檢測細胞增殖。Control 組細胞隨著培養(yǎng)時間延長，在72 h 內(nèi)，RL95?2 細胞持續(xù)生長；加入脂多糖后，0～48 h 內(nèi)RL95?2 細胞持續(xù)生長，第72 h 時顯示了對細胞的毒性效應，表明脂多糖刺激的RL95?2細胞增殖呈時間依賴關系。見圖2。

圖2 5 μg／mL LPS 作用不同時間對RL95?2 細胞增殖率的影響

由于5 μg／mL 脂多糖刺激RL95?2 細胞24 h，處于細胞的線性增殖區(qū)間，因此該刺激劑量和時間被用于后續(xù)實驗。

2.2 脂多糖對RL95?2 細胞株Ki?67 基因水平的影響

Ki?67 為增殖標志物。相比于control 組，RL95?2細胞經(jīng)5 μg／mL 脂多糖刺激24 h 后，Ki?67 mRNA 表達水平明顯升高，是control 組的（3.42 ±0.33）倍。見圖3。

圖3 5 μg／mL LPS 對RL95?2 細胞Ki?67 mRNA 表達的影響

2.3 CD14、TLR?4 和EGFR 對脂多糖刺激RL95?2 細胞增殖的影響

5 μg／mL 脂多糖作用RL95?2 細胞的同時，加入10 μg／mL CD14 單抗（CD14 抑制劑）、 10 nmol／L TAK?242 （TLR?4 特異性抑制劑）或10 μg／mL cetux?imab （EGFR 抑制劑），24 h 后檢測細胞增殖，可見脂多糖刺激的細胞生長被全部抑制，同control 組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖4。

圖4 CD14 mAb、 TAK?242、 cetuximab 對LPS 刺激RL95?2 細胞增殖的干預作用

2.4 CD14、 TLR?4 和EGFR 對COX?2 表達的影響

相比于control 組，RL95?2 細胞經(jīng)5 μg／mL 脂多糖刺激24 h 后，COX?2 mRNA 表達水平明顯升高，是control 組的（3.82 ± 0.61）倍；然而經(jīng)CD14 單抗、TAK?242、 cetuximab 同時處理后，COX?2 mRNA 表達水平分別下降到（1.24 ±0.01）倍、 （1.14 ±0.06）倍、（1.18 ±0.15）倍，同control 組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 CD14 mAb、 TAK?242、 cetuximab 對LPS 刺激RL95?2 細胞COX?2 mRNA 表達的干預作用

2.5 脂多糖對RL95?2 細胞株分泌PGE2 的影響

在control 組中，隨著RL95?2 細胞培養(yǎng)時間延長，PGE2 分泌量逐漸增加；加入5 μg／mL 的脂多糖后，0～48 h 內(nèi)，PGE2 分泌量逐漸增加，第72 h 時，PGE2分泌降低，且均明顯高于control 同時間處理組（P＜0.05），圖6結果表明脂多糖升高了RL95?2 細胞分泌PGE2 的水平，且呈時間依賴關系。

圖6 5 μg／mL LPS 作用不同時間對RL95?2 細胞PGE 表達的影響

由于5 μg／mL 脂多糖刺激RL95?2 細胞24 h，處于PGE2 分泌的線性區(qū)間，因此該刺激濃度和時間被用于后續(xù)實驗。

2.6 CD14、 TLR?4 和EGFR 對PGE2 分泌的影響

圖7顯示，相比于control 組，5 μg／mL 脂多糖誘導RL95?2 細胞分泌PGE2 水平顯著升高，從（76.55±7.20）pg／mL 升高到（271.99 ±24.66）pg／mL（P＜0.01），然而經(jīng)CD14 單抗、 TAK?242、 cetuximab 同時處理后，PGE2 分泌水平分別下降到（118.42 ±10.74）pg／mL、（107.45 ±30.89）pg／mL、 （113.42 ±23.49）pg／mL，同脂多糖組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），同control 組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖7 CD14 mAb、 TAK?242、 cetuximab 對LPS 刺激RL95?2 細胞PGE 表達的干預作用

3 討論

子宮內(nèi)膜癌以55 ～65 歲女性之間發(fā)病居多，與年齡具有相關性，本研究可能為老年患者子宮內(nèi)膜癌的炎癥研究提供參考性的實驗依據(jù)。在脂多糖刺激下，促進RL95?2 細胞增殖，上調(diào)Ki?67 mRNA、COX?2 mRNA表達和PGE2 分泌，CD14 中和抗體、 TLR?4抑制劑和EGFR 抑制劑降低了COX?2／PGE2 信號活化和細胞增殖。研究證實，脂多糖通過LPS／TLR?4 信號通路、 EGFR 信號通路調(diào)控COX?2／PGE2 信號通路，促進子宮內(nèi)膜癌細胞生長。

脂多糖是革蘭氏陰性菌細胞壁上的主要成分，通過啟動生物體的多種炎癥反應，在細菌感染和癌癥演化中發(fā)揮重要作用。研究證實，子宮內(nèi)膜癌組織中細菌培養(yǎng)陽性率高于正常子宮內(nèi)膜組織，并且發(fā)現(xiàn)污泥單胞菌和普氏菌在高腫瘤負荷的子宮內(nèi)膜癌中富集［12］，炎癥因子IL?6、 IL?11 陽性表達升高，提示感染及炎癥因子可能參與了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病過程，癌組織中的細菌影響癌癥發(fā)展，可能與治療效果有關［2］。CD14 和TLR4 是人體細胞識別脂多糖和脂多糖啟動炎癥發(fā)生的重要受體。細胞膜表面的CD14 蛋白結合脂多糖并將其轉運至跨膜蛋白TLR4 的胞外基團，引起TLR4 胞內(nèi)基團的構象變化，將信號傳遞到細胞內(nèi)部，引起擴大的下游信號瀑布［13］。臨床研究也顯示，TLR4 主要定位于腺上皮和腔上皮，存在于子宮內(nèi)膜樹突狀細胞、單核細胞和巨噬細胞上，子宮內(nèi)膜異位癥中TLR4 mRNA 表達顯著增加［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，脂多糖促進了人子宮內(nèi)膜癌細胞株RL95?2 的增殖，抑制CD14 和TLR4 活性后，可以完全抑制RL95?2 細胞增殖。本研究的結果表明，脂多糖激活TLR4 胞內(nèi)信號的進程是脂多糖誘導RL95?2 細胞增殖的初始步驟。

與結構性環(huán)氧化酶COX?1 不同的是，COX?2 是誘導型環(huán)氧化酶，生理狀態(tài)下，在絕大部分組織和細胞中不表達，僅在受到各種刺激后迅速合成，參與炎癥和腫瘤的病理過程［15］。這一過程中，COX?2 作為花生四稀酸代謝的限速酶，合成各種具有炎性遞質作用的前列腺素產(chǎn)物，其中主要的代謝產(chǎn)物為PGE2。PGE2 作為重要的遞質，密切參與生長、炎癥、組織修復等過程。在多種組織和細胞中均發(fā)現(xiàn)，COX?2 和PGE2 水平可經(jīng)脂多糖刺激后上調(diào)，并且有研究報道，子宮內(nèi)膜癌組織含有高水平的COX?2 和PGE2［16?17］。本實驗發(fā)現(xiàn)，脂多糖誘導RL95?2 細胞24 h 后，COX?2 mRNA 表達及PGE2 分泌增加，然而，抑制脂多糖識別受體CD14 和TLR4 活性后，可以完全干預COX?2 mRNA 表達和PGE2 分泌，表明COX?2／PGE2 信號依賴于LPS／TLR4 信號通路激活。本研究同時發(fā)現(xiàn)，脂多糖刺激和TLR4 信號干擾對COX?2 mRNA、 PGE2、細胞增殖的反應表現(xiàn)一致，由此推測，脂多糖引起的RL95?2 細胞增殖中，LPS／TLR4 信號通路依賴的COX?2／PGE2 發(fā)揮關鍵作用。

有趣的是，本實驗發(fā)現(xiàn)干預EGFR 也可完全抑制脂多糖誘導的RL95?2 細胞增殖、COX?2 mRNA 表達和PGE2 分泌。EGFR 是子宮內(nèi)膜癌治療中極為重要的靶點，是由胞外配體結合域、跨膜親脂區(qū)域和胞內(nèi)酪氨酸激酶結構域組合成的跨膜蛋白。2 個EGFR 單體同多種配體結合后，形成有酪氨酸激酶活性的二聚體，對細胞內(nèi)眾多的信號分子進行磷酸化，促進細胞增殖、分化、遷移。目前已知EGFR 二聚體下游的信號級聯(lián)通路PI3K／AKT、RAS／RAF／MEK／ERK、p38MAPK，甚至JAK／STAT 均可能誘導COX?2 表達。本研究采用的cetuximab 是識別EGFR 胞外配體結合域，阻止EGFR 二聚體的干擾抑制劑，實驗結果顯示，干預EG?FR 二聚體形成可以完全抑制COX?2／PGE2 產(chǎn)生，表明COX?2／PGE2 的產(chǎn)生依賴于EGFR 活化，然而本實驗的前期結果同樣表明COX?2／PGE2 激活也依賴于LPS／TLR4 信號通路，由此推測位于初始環(huán)節(jié)的LPS／TLR4 信號可能對EGFR 及其下游通路有活化作用，從而激活COX?2／PGE2。有研究報道，腸上皮細胞中存在脂多糖對EGFR 的反式激活，TLR4 激活后，通過Src 家族激酶的信號傳遞和基質金屬蛋白酶的參與，反式激活EGFR，再經(jīng)由EGFR 下游RAS／RAF／MEK／ERK 信號調(diào)節(jié)COX?2 表達［18］。Holani 等［19］研究者在結腸上皮細胞內(nèi)也證實TLR4 信號通路和EGFR 信號通路之間存在交叉作用，TLR4 通過Src 激活EGFR，調(diào)控EGFR 依賴性的信號傳遞過程。此外，TLR4 也可能通過PGE2 反式激活EGFR，研究發(fā)現(xiàn)在干細胞隱窩分裂進程中，透明質酸結合TLR4，刺激下游COX?2／PGE2 發(fā)生，PGE2 再進一步激活EGFR［20?21］。本實驗結果表明，EGFR 的反式激活是LPS／TLR4 信號通路活化COX?2 和PGE2 的關鍵環(huán)節(jié)，提示EGFR 抑制劑可能在感染引起的子宮內(nèi)膜癌細胞生長方面有抑制效應。

子宮內(nèi)膜癌臨床被區(qū)分為2 種類型，Ⅰ型為雌激素依賴型，確診時常為早期，全子宮切除后大多可自治愈，Ⅱ型為非雌激素依賴型，確診時多屬晚期，惡性程度高，易復發(fā)，影響預后的因素多為腫瘤細胞的侵襲轉移能力。本研究選取雌激素受體陽性的子宮內(nèi)膜癌細胞株RL95?2 進行研究，無法完全代表2種類型的子宮內(nèi)膜癌，在未來的研究中，需對比EGFR 抑制劑處理雌激素依賴和非依賴性型子宮內(nèi)膜癌細胞的抑制作用差異。此外，本研究未全面驗證EGFR 抑制劑對EGFR 表達的影響，仍需在未來工作中補充和完善。

綜上所述，脂多糖可誘導子宮內(nèi)膜癌細胞的體外增殖，LPS／TLR4 信 號 通 路、 EGFR 活 化、 COX?2／PGE2 信號通路參與了該病理進程，炎癥遞質COX?2和PGE2 的水平上調(diào)依賴于TLR4 對EGFR 的反式激活。本研究從體外細胞水平上，提示EGFR 抑制劑可能在感染促進的子宮內(nèi)膜癌發(fā)展中有控制作用，為子宮內(nèi)膜癌并發(fā)感染的治療及聯(lián)合用藥方面提供證據(jù)，然而，各信號通路之間的激活和串擾仍需在體內(nèi)動物水平上進行驗證，以闡述信號通路之間的復雜聯(lián)系。