黃海華，何琛波，孫毅

郴州市第一人民醫(yī)院影像醫(yī)學(xué)中心，湖南郴州 423000

乳腺癌是女性最常見的癌癥，嚴(yán)重威脅著女性的身心健康［1］。雖然隨著診斷技術(shù)和治療方式的改進(jìn)，乳腺癌的死亡率一直在下降，但全世界的乳腺癌發(fā)病率仍在上升，乳腺癌仍然是女性癌癥死亡的主要原因［2］。預(yù)計(jì)到2040年，全球范圍內(nèi)老年女性乳腺癌患者（65 歲以上）人數(shù)將翻兩番［3］。鑒于老年人體內(nèi)衰老標(biāo)志物和激素水平與年輕人不同，基于常規(guī)測(cè)量的生物標(biāo)志物和治療計(jì)劃可能不再適用于老年女性［4］。在乳腺癌的分類中，三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是最具侵略性的一種，三陰性乳腺癌是指雌激素受體、孕酮受體和人表皮生長(zhǎng)因子受體2 表達(dá)陰性的乳腺癌，由于與其他乳腺癌亞型患者相比，對(duì)三陰性乳腺癌患者進(jìn)行內(nèi)分泌或HER2 靶向治療效果收效甚微，并且化療的效果更差。TNBC 具有較高的癌癥特異性死亡率，在我國(guó)也不例外［5?6］。因此對(duì)于三陰性乳腺癌的治療面臨著嚴(yán)峻的考驗(yàn)［7?9］。TNBC 多發(fā)于年輕女性，因此研究也較多。有關(guān)老年人TNBC 的研究發(fā)現(xiàn)60 歲以上的患者會(huì)出現(xiàn)與乳腺癌相關(guān)的基因變異［10］。因此，開發(fā)適用于所有年齡段TNBC患者開的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)是很有必要的。

MicroRNA 是1 類長(zhǎng)度為18 ～25 個(gè)核苷酸的非編碼內(nèi)源性RNA。microRNA 可通過(guò)靶向mRNA，抑制后者翻譯或降解，從而發(fā)揮重要的調(diào)控作用［11?12］。已有研究［13?16］證明，miRNA 在不同類型的腫瘤組織中表達(dá)異常。miRNAs 有望成為臨床診斷和治療腫瘤疾病的1 種新的腫瘤標(biāo)志物。MiR?500a 在結(jié)直腸癌中發(fā)揮促癌作用［17］，且可預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌患者的不良預(yù)后［18］。此外，在Fadi Abdel?Sater 的研究中，利用Taq?man 低密度陣列（TLDA）篩選TNBC 與正常乳腺組織中20 個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中miR?500a 表達(dá)差異較顯著［20］。但是miR?500a 在TNBC 中的預(yù)后價(jià)值和生物學(xué)功能。

在本研究中，分析了miR?500a 在TNBC 臨床組織樣本和細(xì)胞樣本中的表達(dá)狀態(tài)。并進(jìn)一步分析miR?500a 對(duì)TNBC 的總體生存預(yù)后的意義。通過(guò)細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)，分析了miR?500a 在TNBC 中的生物功能。以期為TNBC 的預(yù)后分層和治療提供新的參考依據(jù)和靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 組織樣本收集

收集2012年8月—2015年8月在郴州市第一人民醫(yī)院確診并實(shí)施手術(shù)的113 例TNBC 患者的腫瘤組織及相應(yīng)的癌旁正常組織。所有TNBC 患者均按照世界衛(wèi)生組織的標(biāo)準(zhǔn)［21］進(jìn)行診斷。術(shù)后組織標(biāo)本立即置于液氮中，保存?zhèn)溆?。所有患者術(shù)前均未接受藥物、放療和化療等治療手段。5年的隨訪資料通過(guò)醫(yī)院病歷和電話訪談進(jìn)行收集并記錄?；颊叩呐R床病理信息見表1。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

TNBC 細(xì)胞系MDA?MB?231、 HCC1937、 SUM149?PT、 HCC1187 和正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF?10A 均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)（中國(guó)，上海）。所有細(xì)胞系在37 ℃、5%CO2飽和濕度下，含10%胎牛血清的RPIM 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)（Invitrogen，Carlsbad，CA，美國(guó)）。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR?500a 模擬物、 miR?500a 抑制物和陰性對(duì)照按照Lipofectamine 2000 說(shuō)明書（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，美國(guó)）轉(zhuǎn)染TNBC 細(xì)胞（以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為空白對(duì)照組）。

1.4 總RNA 提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR

使 用 TRIzol 試 劑（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，美國(guó)）提取TNBC 組織或細(xì)胞的總RNA，并使用NanoDrop 1000 （Thermo Fisher Scientific）驗(yàn)證其質(zhì)量和數(shù)量。用TaqManmiRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Fisher Scientific）合成cDNA。在ABI 7500 PCR 系統(tǒng)上使用TaqManmiRNAPCR 定量試劑盒（Ther?mo Fisher Scientific）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和定量分析。2－ΔΔCt法計(jì)算miR?500a 的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次。

1.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)1 ～3 d，進(jìn)行細(xì)胞增殖試驗(yàn)。CCK?8 法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的TNBC 細(xì)胞的增殖活性。10 μL CKK?8 溶液（Dojindo，Kumamoto，日本）添加到每個(gè)孔中，然后37 ℃培養(yǎng)2 h，450 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)細(xì)胞吸光度。

1.6 細(xì)胞遷移及侵襲試驗(yàn)

Transwell 法［22］用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲和遷移能力。對(duì)于細(xì)胞侵襲能力的檢測(cè)，Matrigel （BD Biosciences，San Jose，CA，美國(guó)）被預(yù)涂到transwell 的上室中。細(xì)胞密度為5×104個(gè)／孔，將含無(wú)血清培養(yǎng)基的細(xì)胞懸液100 μL 置于上室，并在下室中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液500 μL （Thermo Fisher Scientific，Waltham，美國(guó)）。培養(yǎng)24 h 后，下室固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，每孔隨機(jī)選取5 個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。遷移試驗(yàn)與侵襲試驗(yàn)不同的是，Ttranswell 遷移室不需要預(yù)涂Matrigel 基質(zhì)凝膠，其余步驟相同。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 和GraphPad 5.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間差異采用單因素t檢驗(yàn)或單因素方差分析。采用Kap?lan?Meier 法和Cox 回歸分析預(yù)后意義。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNBC 組織和細(xì)胞中miR?500a 表達(dá)水平

通過(guò)qRT?PCR 檢測(cè)miR?500a 的表達(dá)水平。如圖1A 所示，miR?500a 在TNBC 組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織（P＜0.001）。同時(shí)，miR?500a 在4 種TNBC 細(xì)胞系（MDA?MB?231、 HCC1937、 SUM149PT、HCC1187）中的表達(dá)也顯著高于正常乳腺細(xì)胞系（MCF?10A，P＜0.001），見圖1B。

圖1 miR?500a 在TNBC 組織和細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)

2.2 TNBC 患者中miR?500a 表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

為了評(píng)估TNBC 患者中miR?500a 表達(dá)水平與臨床病理特征之間的關(guān)系。將113 例TNBC 患者根據(jù)miR?500a 相對(duì)表達(dá)量的平均值（1.21）分組：高表達(dá)組（相對(duì)表達(dá)量大于1.21，n＝60）和低表達(dá)組（相對(duì)表達(dá)量小于1.21，n＝53）。miR?500a 在TNBC 組織中的表達(dá)與TNM 分期（P＝0.032）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＝0.037）相關(guān)，而miR?500a 的表達(dá)與TNBC 患者的年齡、腫瘤大小和分化程度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 miR?500a 表達(dá)水平與TNBC 患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 miR?500a 的上調(diào)與TNBC 患者的不良預(yù)后相關(guān)

進(jìn)一步評(píng)估了miR?500a 表達(dá)是否與TNBC 患者的預(yù)后相關(guān)。通過(guò)Kaplan?Meier 和log?rank test 分析方法，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)組患者的總生存率明顯低于低表達(dá)組（P＝0.037），見圖2。此外，多變量Cox 回歸分析顯示miR?500a（HR ＝3.700，P＝0.026）、 TNM 分期（HR ＝3.196，P＝0.035）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（HR ＝2.633，P＝0.035）是影響TNBC 患者總生存期的獨(dú)立預(yù)后因素。見表2。

圖2 TNBC 患者生存時(shí)間的Kaplan?Meier 曲線

表2 總生存期獨(dú)立危險(xiǎn)因素的多因素Cox 回歸分析

2.4 miR?500a 上調(diào)促進(jìn)TNBC 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

利用qRT?PCR 分析檢測(cè)miR?500a 在TNBC 細(xì)胞系中發(fā)揮的生物學(xué)作用。miR?500a 模擬物、 miR?500a抑制劑和陰性對(duì)照分別轉(zhuǎn)染MDA?MB?231 和HCC1937細(xì)胞。如圖3A 所示，與對(duì)照組相比，miR?500a 模擬物轉(zhuǎn)染的TNBC 細(xì)胞中miR?500a 表達(dá)水平顯著高于陰性對(duì)照，而miR?500a 抑制物轉(zhuǎn)染的TNBC 細(xì)胞中miR?500a 表達(dá)水平顯著低于陰性對(duì)照（P＜0.001）。CCK?8 檢測(cè)顯示，與對(duì)照組相比，miR?500a 模擬物轉(zhuǎn)染后促進(jìn)細(xì)胞增殖，而miR?500a 抑制物轉(zhuǎn)染后抑制細(xì)胞增殖（P＜0.05），見圖3B。

圖3 miR?500a 表達(dá)水平對(duì)MDA?MB?231 和HCC1937 細(xì)胞系增殖的影響

采用Transwell 侵襲和遷移試驗(yàn)檢測(cè)MDA?MB?231 和HCC1937 細(xì)胞的遷移和侵襲能力。結(jié)果表明，miR?500a 上調(diào)促進(jìn)TNBC 細(xì)胞的侵襲和遷移能力，miR?500a 下調(diào)則有相反的作用（P＜0.01）。見圖4。

圖4 miR?500a 對(duì)MDA?MB?231 和HCC1937 細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

3 討論

TNBC 是乳腺癌的1 種亞型，具有特殊的生物學(xué)行為和臨床病理特點(diǎn)，其預(yù)后較其他類型乳腺癌差［23］。TNBC 臨床表現(xiàn)為侵襲性強(qiáng)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高。目前對(duì)TNBC 的治療尚無(wú)明確的指南，治療一般按常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)治療，但療效不盡人意［24］。miRNAs 是許多領(lǐng)域研究的焦點(diǎn)，研究表明miRNAs 至少調(diào)控人類30%的編碼基因［25］。這些miRNAs 廣泛參與人類生理和病理活動(dòng)的各個(gè)方面，包括細(xì)胞增殖、凋亡、分化、代謝、發(fā)育、造血、器官生成、病毒防御以及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在與腫瘤的關(guān)系研究中，miRNA 表達(dá)的突變、缺失和變化被證明在人類腫瘤中發(fā)揮著與原癌基因或腫瘤抑制基因相似的作用［26］。

在本文中，首先研究了miR?500a 在TNBC 組織和細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果表明，miR?500a 在TNBC 組織和細(xì)胞中具有異常高表達(dá)。miR?500a 的異常高表達(dá)不僅僅在TNBC 中存在，在很多其他癌癥中，也有相似的表現(xiàn)，例如在肝細(xì)胞癌中，Jiang 等［27］同樣利用qRT?PCR 證明了miR?500a 在肝細(xì)胞組織中具有過(guò)表達(dá)，同時(shí)揭示了miR?500a?3p 通過(guò)STAT3 途徑促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞干性維持的新機(jī)制。在惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，miR?500a?5p 在腫瘤組織和細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)，過(guò)表達(dá)的miR?500a?5p 促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞在體外的增殖、遷移和侵襲，證明了miR?500a?5p 可以作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者診斷和預(yù)后的新型生物標(biāo)志物［28］。TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對(duì)惡性腫瘤的治療和預(yù)后有著重要意義，因此評(píng)估了TNBC 患者的miR?500a 表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)miR?500a 在TNBC 組織中的表達(dá)與TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，這2 個(gè)因素同時(shí)也是影響TNBC 患者總生存期的獨(dú)立預(yù)后因素。類似地，miR?155 在TNBC 組織中的相對(duì)表達(dá)量明顯高于非腫瘤組織，而且這種異常表達(dá)與腫瘤分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示其具有預(yù)后價(jià)值［29］。低表達(dá)的miR?18a 則與TNBC 腫瘤大小和臨床淋巴結(jié)狀態(tài)相關(guān)，可用于不良預(yù)后的預(yù)測(cè)［30］。該研究探索了miR?500a 在TNBC 患者中的預(yù)后價(jià)值。研究結(jié)果證實(shí)，miR?500a 在可預(yù)測(cè)TNBC 的不良預(yù)后，有助于實(shí)現(xiàn)患者預(yù)后分層，為臨床個(gè)體化治療提供基礎(chǔ)。

Guo 等［19］除了研究miR?500a 在肝癌中的異常高表達(dá)及其不良預(yù)后，還對(duì)miR?500a 在肝癌中的生物學(xué)作用和機(jī)制做了進(jìn)一步的研究，發(fā)現(xiàn)miR?500a的上調(diào)促進(jìn)了肝癌細(xì)胞系的遷移和侵襲。本研究也對(duì)miR?500a 在TNBC 中的生物學(xué)功能進(jìn)行了相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)的miR?500a 會(huì)促進(jìn)TNBC 細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，這與上述結(jié)果一致。在結(jié)直腸癌中，miR?500a 也有相同的表現(xiàn)，低表達(dá)的miR?500a 抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移，而過(guò)度表達(dá)miR?500a 則促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移；另外，miR?500a 被證明可能靶向磷酸酶和張力蛋白同源基因的3'?非翻譯區(qū)。miR?500a 可能在大腸癌中起致癌作用［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，在TNBC 中也發(fā)揮致癌基因的作用。因此，推測(cè)miR?500a 可能是作為TNBC 的致癌因子，參與了TNBC 的發(fā)生和發(fā)展。這提示miR?500a具有作為TNBC 治療靶點(diǎn)的潛力。在本研究中，存在一些不足之處，例如樣本量小，未能進(jìn)行miR?500a在TNBC 中的靶基因試驗(yàn)等。在今后的工作中將擴(kuò)大其樣本量，并對(duì)miR?500a 在TNBC 中的發(fā)揮的機(jī)制進(jìn)行更深入的研究。

總之，本研究表明miR?500a 在TNBC 組織和細(xì)胞系的表達(dá)明顯高于正常組織和細(xì)胞系，且過(guò)表達(dá)的miR?500a 與TNBC 預(yù)后差、生存時(shí)間短有關(guān)。此外，高表達(dá)水平的miR?500a 促進(jìn)TNBC 的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力。這些結(jié)果表明miR?500a 可能作為一種預(yù)后分子標(biāo)志物，旨在為TNBC 提供新的治療策略。