唐鈞，曹紅梅，余婷婷，李秀菊

1.上海市金山區(qū)亭林醫(yī)院檢驗科，上海 201505；2.上海市金山區(qū)亭林醫(yī)院體檢中心，上海 201505；3.復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院職業(yè)病科，上海 201508

隨著人口老齡化，腦卒中成為僅次于心臟病的第2致死原因［1］，其中老年腦卒中發(fā)病率為70%～80%。而缺血性腦卒中又占老年腦卒中的70%，并具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高致殘率和高死亡率的特點，不僅嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，而且給家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)［2］。臨床分析發(fā)現(xiàn)，老年腦卒中患者常存在高血壓和糖尿病等多種基礎(chǔ)疾病，而且老年腦卒中患者免疫力降低，易出現(xiàn)感染、褥瘡、肺栓塞和消化道出血等并發(fā)癥［3］，在治療上更為棘手，臨床用藥也需要考慮基礎(chǔ)疾病和藥物不良反應(yīng)而受到多方面限制。中藥在改善腦卒中后的神經(jīng)損傷方面具有相對安全有效和不良反應(yīng)小等優(yōu)勢，因此《中西醫(yī)結(jié)合腦卒中循證實踐指南（2019）》［4］指出，在缺血性腦卒中治療中，可參考使用丹參類、三七類及燈盞細(xì)辛注射液等的中藥注射劑。但目前這些中藥注射劑尚需要進(jìn)一步開展高質(zhì)量的臨床試驗以完善循證醫(yī)學(xué)證據(jù)［5］。由于燈盞花素（Breviscap?ine，Bre）是燈盞細(xì)辛的中藥提取制劑，是比較單一的有效成分，具有活血化瘀和疏通瘀滯之氣血等功效［6］，因此探討燈盞花素在缺血性腦卒中的神經(jīng)保護作用機制，旨在為燈盞花素的臨床應(yīng)用提供更充分的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

10 周齡健康雄性SD 大鼠72 只，SPF 級（購自上海吉輝實驗動物飼養(yǎng)有限公司），所有大鼠飼養(yǎng)于恒溫（25 ℃）環(huán)境，自由飲水，12 h 晝夜，實驗開始前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。動物實驗獲得上海市公共衛(wèi)生臨床中心的動物倫理委員會審批，并在實驗過程中嚴(yán)格遵守實驗動物福利和倫理要求。

研究分為2 個部分：第1 部分在缺血性腦卒中大鼠上探索燈盞花素的有效給藥劑量，分為模型組、溶劑對照組、 Bre 低劑量組（5 mg／kg）、中劑量組（10 mg／kg）和高劑量組（20 mg／kg），每組8 只大鼠，每組大鼠于造模后第5 天進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分和腦組織TTC 染色并計算梗死灶體積。第2 部分探討燈盞花素改善缺血性腦卒中損傷的分子機制，分為假手術(shù)組、模型組、溶劑對照組和Bre 組（10 mg／kg），每組8 只大鼠，每組大鼠于造模后第5 天取材，分別檢測損傷側(cè)皮層中MDA 和SOD 水平和Nrf2 和HO?1 的蛋白表達(dá)水平。

1.2 主要設(shè)備及試劑

分光光度計（美國Thermo 公司，型號NanoDro?P2000），低溫超速離心機（美國Beckman 公司，型號Allegra X?22R），化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海天能公司，型號Tanon4500），電泳儀及電轉(zhuǎn)移裝置（美國Bio?Rad公司，型號Basic 系列），酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司，型號Epoch）。注射用燈盞花素（湖南恒生制藥股份有限公司10 mg／瓶），2，3，5?三苯基氯化四氮唑（2，3，5?triPhenyl?2H?tetrazolium chloride，TTC，國藥集團化學(xué)試劑有限公司），MDA 測定試劑盒（南京建成生物科技有限公司，A003?1），SOD 測定試劑盒（南京建成生物科技有限公司，A001?3），Nrf2 抗體（美國Abcam 公司，ab331163），HO?1 抗體（美國Abcam 公司，ab13248），HRP 羊抗兔IgG（美國Invitrogen 公司，G21234），HRP 羊抗鼠IgG（美國CST 公司，7076S）。

1.3 MCAO 動物模型的建立及燈盞花素給藥

根據(jù)Zea Longa 的方法［7］制備大腦中動脈缺血再灌注模型，術(shù)前12 h 禁食，4 h 禁水，通過麻醉機給予異氟烷麻醉，暴露頸總動脈以及頸內(nèi)和頸外動脈，將直徑為0.28 mm 的線栓從頸外動脈沿頸內(nèi)動脈插入大腦中動脈分支處，缺血2 h 后抽出線栓約8 mm 并縫合切口。假手術(shù)組僅分離血管不插入線栓。

通過尾靜脈注射給藥，Bre 低、中、高劑量組分別給予Bre 5、10、20 mg／kg 的劑量，給藥組大鼠在造模后立即給藥，每天給藥1 次，共給藥5 次。溶劑對照組給予同體積的生理鹽水。

1.4 大鼠神經(jīng)功能缺損評分

根據(jù)既往的方法在大鼠缺血再灌注損傷后的第5天進(jìn)行神經(jīng)功能缺損程度評分［8］：大鼠無任何不對稱活動為0 分；提起尾巴時左前爪不能完全伸展為1 分；在1分的基礎(chǔ)上左前肢活動障礙為2 分；左前肢緊貼胸壁為3 分；大鼠自由活動時向左側(cè)轉(zhuǎn)彎為4 分；伴有明顯的左前爪后推動作為5 分；只能圍繞原點旋轉(zhuǎn)為6 分；左側(cè)肢體完全不能支撐身體，只能躺向左側(cè)為7 分。

1.5 大鼠腦組織TTC 染色和梗死體積計算

完成神經(jīng)功能缺損評分后，大鼠進(jìn)行安樂死并迅速取腦，將大腦等分切成2 mm 厚的腦片，浸入2%的TTC 生理鹽水中30 min，而后移入4%的多聚甲醛溶液固定。腦片經(jīng)拍照、掃描后由Ulead Photo ExPress 2.0圖像分析軟件進(jìn)行腦梗死輪廓勾畫和梗死面積的測量再乘以腦片的厚度算出每側(cè)大腦梗死組織的體積，再除以同側(cè)腦總體積得到梗死體積的百分比。

1.6 大鼠腦內(nèi)MDA 和SOD 水平測定

損傷側(cè)大腦皮層組織稱定質(zhì)量后進(jìn)行勻漿，提取上清，然后按照說明書中的方法進(jìn)行檢測，同時檢測上清中的總蛋白含量。

1.7 腦內(nèi)Nrf2 和HO?1 的蛋白表達(dá)水平檢測

采用SDS?聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜再經(jīng)相應(yīng)的一抗（Nrf2 和HO?1 均為1∶1 000）孵育，二抗孵育及ECL 發(fā)光，最后在凝膠成像系統(tǒng)觀察拍攝，并使用Image J 軟件行條帶灰度分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，同時應(yīng)用Tukey 法進(jìn)行2 組之間的兩兩比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 燈盞花素對缺血性腦卒中大鼠腦損傷的影響

首先觀察不同劑量的燈盞花素對于缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)功能缺損評分的影響（見圖1B）。結(jié)果顯示只有Bre 中劑量組大鼠的神經(jīng)功能缺損評分顯著低于模型組（P＜0.001），而溶劑對照組、 Bre 低劑量組和高劑量組大鼠的神經(jīng)功能缺損評分與模型組相比無明顯差異（P＞0.05）。

其次，通過腦切片的TTC 染色可以觀察到正常腦組織染色呈現(xiàn)紅色，而梗死腦組織呈現(xiàn)蒼白色，Bre 中劑量組大鼠的梗死腦區(qū)面積較其他組小（見圖1A）。通過掃描腦片并計算梗死體積后可進(jìn)行組間比較，結(jié)果顯示Bre 中劑量組大鼠的梗死體積顯著小于模型組（P＜0.001），而其他各組大鼠的腦梗死體積與模型組相比無明顯差異（P＞0.05）。見圖1C。

圖1 燈盞花素對缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)功能缺損評分和腦梗死體積的影響

2.2 燈盞花素對缺血性腦卒中大鼠損傷測皮層中MDA 和SOD 的影響

為了明確燈盞花素對缺血性腦卒中大鼠損傷測皮層中氧化損傷的抑制作用，分別檢測了損傷測皮層組織中的MDA 和SOD 水平。結(jié)果顯示（見表1），與假手術(shù)組相比，模型組、溶劑對照組和Bre 組（10 mg／kg）的損傷測皮層中MDA 水平均顯著升高（P＜0.001），但Bre 組的MDA 水平卻顯著低于模型組和溶劑對照組（P＜0.05）。相反的，與假手術(shù)組相比，模型組、溶劑對照組和Bre 組（10 mg／kg）的損傷測皮層中SOD水平均顯著降低（P＜0.05），但Bre 組的SOD 水平卻顯著高于模型組和溶劑對照組（P＜0.001）。

表1 燈盞花素對各組大鼠損傷測皮層中MDA 和SOD 的影響

2.3 燈盞花素對缺血性腦卒中大鼠損傷測皮層中Nrf2 和HO?1 的影響

由于Nrf2／HO?1 通路可以引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的抗氧化效應(yīng)，因而檢測給予燈盞花素后，對缺血性腦卒中大鼠損傷側(cè)皮層中Nrf2 和HO?1 表達(dá)的影響。與假手術(shù)組相比，模型組和溶劑對照組損傷側(cè)皮層中Nrf2 的表達(dá)均顯著下降（P＜0.001），但Bre 組Nrf2 的表達(dá)顯著高于模型組和溶劑對照組（P＜0.05）。此外，模型組、溶劑對照組和Bre 組（10 mg／kg）的損傷側(cè)皮層中HO?1 表達(dá)均顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05），而且Bre 組的HO?1 表達(dá)還顯著高于模型組和溶劑對照組（P＜0.001）。見圖2。

圖2 燈盞花素對血性腦卒中大鼠損傷測皮層中Nrf2 和HO?1 表達(dá)的影響

3 討論

缺血性腦卒中是指腦血循環(huán)障礙病因?qū)е履X血管堵塞或嚴(yán)重狹窄，使腦血流灌注下降，進(jìn)而缺血、缺氧導(dǎo)致腦血管供血區(qū)腦組織死亡［9］。隨著我國人口老齡化趨勢的不斷加速，缺血性腦卒中的發(fā)病率呈現(xiàn)增高的趨勢。因此尋找安全有效的藥物改善缺血性腦卒中的腦損傷成為醫(yī)學(xué)界關(guān)注的熱點。中醫(yī)把腦卒中歸于“中風(fēng)”和“偏枯”的范疇，并認(rèn)為“瘀血”是缺血性腦卒中發(fā)病的重要原因。朱丹溪提出“內(nèi)風(fēng)多由淤血致”，明清時期的《醫(yī)學(xué)綱目》認(rèn)為“脈道不利，氣血閉塞也”是中風(fēng)的主要原因。因而活血化瘀是治療缺血性腦卒中的主要方法，燈盞花素正具有活血化瘀、疏通脈絡(luò)的功效。

本研究觀察到中劑量的燈盞花素可以顯著降低缺血性腦卒中大鼠的神經(jīng)功能缺損評分并明顯減少腦梗死灶的體積，這些結(jié)果顯示燈盞花素可以減輕缺血性腦卒中后的腦損傷。這與燈盞花素在臨床腦卒中治療方面的療效相一致［10］，也與既往的動物研究結(jié)果相吻合［11?12］。但是燈盞花素改善缺血性腦卒中后的腦損傷的分子機制還有待于深入研究。

腦血流的急劇降低是缺血性腦卒中發(fā)生的始動因素，繼而的缺血和缺氧嚴(yán)重影響腦組織細(xì)胞的能量代謝，導(dǎo)致缺血區(qū)域pH 值降低和線粒體電子傳遞障礙，使得ATP 的生成進(jìn)一步減少而自由基生成增多，促發(fā)神經(jīng)細(xì)胞的過度去極化和興奮性神經(jīng)遞質(zhì)釋放，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的死亡［12?13］。在缺血性腦卒中的病理發(fā)生過程中，細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平升高是一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。大量的研究證實當(dāng)腦缺血后過度的氧化應(yīng)激反應(yīng)可造成神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的損傷以及血腦屏障的破壞［13］。為了減輕氧化應(yīng)激帶來的損傷，細(xì)胞內(nèi)還存在一個保守且復(fù)雜的抗氧化防御系統(tǒng)，細(xì)胞核因子E2 相關(guān)因子2（Nu?clear factor erythroid 2 Related Factor 2，Nrf2）是該系統(tǒng)中1 個重要的轉(zhuǎn)錄因子，它可以通過與抗氧化應(yīng)答元件（ARE）結(jié)合，調(diào)節(jié)多種抗氧化酶的表達(dá)［14］。而血紅素加氧酶1（HO?1）作為1 種重要的抗氧化酶，其表達(dá)就受到Nrf2 的調(diào)控，HO?1 是Nrf2 通路下游最主要的指標(biāo)，所以本文從最主要的指標(biāo)展開研究。HO?1可以催化血紅素氧化分解產(chǎn)生等物質(zhì)的量的亞鐵、CO 和膽綠素，膽綠素再轉(zhuǎn)化為膽紅素，進(jìn)而幫助細(xì)胞抵抗活性氧產(chǎn)生的氧化應(yīng)激損傷。因此普遍認(rèn)為Nrf2／HO?1 是細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)的1 個重要通路，可以作為腦缺血損傷治療的藥物靶點［15?16］。本研究發(fā)現(xiàn)，給予中劑量的燈盞花素可以降低損傷側(cè)皮層中氧自由基代謝產(chǎn)物MDA 水平，同時可以升高抗自由基的超氧歧化酶（SOD）水平，從而改善缺血性腦卒中的損傷側(cè)皮層中的氧化應(yīng)激水平。此外，給予中劑量的燈盞花素可以引起損傷側(cè)皮層中Nrf2 和HO?1 表達(dá)水平升高，激活損傷側(cè)皮層內(nèi)的細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)，產(chǎn)生相應(yīng)的腦保護作用。然而，燈盞花素如何促使Nrf2 的表達(dá)上調(diào)，以及燈盞花素通過Nrf2 對細(xì)胞內(nèi)其他抗氧化酶的調(diào)控作用還需要進(jìn)一步研究，進(jìn)而為燈盞花素在缺血性腦卒中的臨床應(yīng)用提供更充分的實驗依據(jù)。