張晨曦，關(guān)勝男，謝凱，張康，王海峰

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸科，河南 鄭州 450000； 3.呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450000

社區(qū)獲得性肺炎(community acquired pneumonia，CAP)是一種由多種病原體引起的急性肺部感染性疾病，有高發(fā)病率和病死率[1]。隨著人口老齡化、免疫功能減弱、宿主數(shù)量增多和抗生素耐藥性增加等問題，CAP的發(fā)病率持續(xù)增長[2]。有研究表明，依據(jù)感染指標(biāo)指導(dǎo)的抗生素濫用率在55%以上，且其耐藥性在全球范圍內(nèi)迅速蔓延，對公眾健康造成了嚴(yán)重威脅[3-4]。中醫(yī)藥治療呼吸系統(tǒng)疾病具有獨(dú)特優(yōu)勢和顯著療效，且具有多靶點(diǎn)、不良反應(yīng)少、統(tǒng)籌整體的特點(diǎn)[5]。研究表明，中藥治療CAP能明顯改善臨床癥狀，降低炎癥指數(shù)，調(diào)節(jié)免疫功能[6-9]。CAP屬中醫(yī)“風(fēng)溫肺熱”“咳嗽”范疇[10]。臨床上關(guān)于中藥治療CAP的研究多為隨機(jī)對照試驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、系統(tǒng)及療效評價(jià)等，缺少方藥總結(jié)和機(jī)制探索。因此，本文通過挖掘具有明顯臨床治療效果的常用代表方藥，總結(jié)經(jīng)典藥對，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出藥物的核心化學(xué)成分，分析其作用的靶點(diǎn)和機(jī)制，并結(jié)合中藥性能闡釋中醫(yī)藥治療CAP的有效性和科學(xué)性。

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)來源本研究所搜集的文獻(xiàn)主要來源于知網(wǎng)、萬方醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)庫和維普資訊等數(shù)據(jù)庫，檢索時(shí)間為數(shù)據(jù)庫建立至2021年8月。以“社區(qū)獲得性肺炎”“肺炎”“肺部感染”“風(fēng)溫肺熱病”“中醫(yī)”“中醫(yī)藥”“中草藥”“中藥”為主題詞，限定文獻(xiàn)類型為實(shí)驗(yàn)性研究、觀察性研究、名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)、醫(yī)案、驗(yàn)案等。

1.2 文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)①符合CAP且病種單一，無較多合并癥，年齡大于18歲；②有明確的方藥組成；③有明顯的臨床療效；④單純的湯劑治療。

1.3 文獻(xiàn)排除標(biāo)準(zhǔn)①排除妊娠期和哺乳期婦女；②排除重復(fù)方藥、中西藥聯(lián)用、中藥針劑、復(fù)合制劑、中藥貼敷、針刺治療；③排除動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、療效與系統(tǒng)評價(jià)、綜述、指南、共識。

1.4 文獻(xiàn)整理與數(shù)據(jù)規(guī)范所篩文獻(xiàn)查重后由兩名工作人員通過對文獻(xiàn)標(biāo)題及摘要進(jìn)行首次剔除，由第3名工作人員瀏覽全文確定最終文獻(xiàn)。將文獻(xiàn)中所記載的所有方劑名、中藥、中醫(yī)證型記錄于Excel 2019軟件中，參考2015年版《中華人民共和國藥典》和2004年版《中醫(yī)藥學(xué)名詞》對所記載的中藥名進(jìn)行規(guī)范，如“酒軍”更改為“大黃”，“新會(huì)皮”更改為“陳皮”，“元參”更改為“玄參”，“淡子芩、條芩”更改為“黃芩”等。

1.5 數(shù)據(jù)挖掘利用Excel 2019軟件對藥物進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析，獲得高頻藥物，利用SPSS Modeler軟件對所有藥物進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，獲取藥物之間的關(guān)聯(lián)度。利用SPSS Statistics軟件對藥物進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，最后結(jié)合藥物頻率、關(guān)聯(lián)規(guī)則及聚類分析結(jié)果得出中藥治療CAP的核心配伍藥對。

1.6 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)篩選出核心配伍藥對的有效化學(xué)成分并獲取相應(yīng)的靶點(diǎn)，通過蛋白質(zhì)分析數(shù)據(jù)庫(universal protein，UniProt)匹配靶點(diǎn)的基因名(物種限定為人類)。在OMIM、GeneCard、Grugbank數(shù)據(jù)庫，以“Community acquired pneumonia”為檢索詞，將所有的疾病靶點(diǎn)合并、去重，得到CAP的疾病靶點(diǎn)，并通過UniProt數(shù)據(jù)庫矯正基因名。使用Venny2.1.0(http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)獲取藥物和疾病的交集靶點(diǎn)，將交集靶點(diǎn)和藥物靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建疾病-藥物-化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，獲得藥物核心化學(xué)成分。通過STRING(https：//string-db.org)獲取“string_interractions.tsv”文件，導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)，找到核心靶點(diǎn)?；贛etascap(http：//metascape.org/)進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析、京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，了解核心靶點(diǎn)的生物信息和信號通路。

2 結(jié)果

2.1 高頻藥物頻次與頻率共篩選到文獻(xiàn)8 794篇，剔除相關(guān)文獻(xiàn)后獲得286篇論文，方劑168篇，其中包含266味中藥。通過Excel 2019軟件進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析得出頻率大于10%的高頻藥物有27味，見表1。

表1 高頻藥物頻次與頻率

2.2 高頻中藥關(guān)聯(lián)規(guī)則與可視化在SPSS Modeler軟件中采用Apriori算法對高頻中藥進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，設(shè)置最小支持度為10%，最小規(guī)則置信度為80%，最大前項(xiàng)數(shù)為2。獲得兩項(xiàng)藥對組合兩個(gè)，分別是麻黃→杏仁、薄荷→連翹。3項(xiàng)藥對組合5個(gè)，分別是麻黃、杏仁→石膏，麻黃、石膏→杏仁，麻黃、黃芩→石膏，麻黃、黃芩→杏仁。其中麻黃→杏仁配伍支持度最高為16.67%，置信度>90%，出現(xiàn)頻次最高為28次，見表2。將關(guān)聯(lián)規(guī)則結(jié)果進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化處理，見圖1。27種高頻藥物在設(shè)置鏈接數(shù)≥15時(shí)，顯示杏仁、黃芩、麻黃、魚腥草、金銀花等藥物之間關(guān)系密切；當(dāng)鏈接數(shù)≥25時(shí)，顯示杏仁、黃芩、甘草、麻黃等藥物之間關(guān)系密切。

表2 高頻藥物組合關(guān)聯(lián)規(guī)則(支持度>10%，置信度>80%)

2.3 高頻中藥聚類分析與可視化將27種高頻藥物數(shù)據(jù)信息整合，依據(jù)是否在同一處方中出現(xiàn)分別記為“1”和“0”，導(dǎo)入SPSS Statistics軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，采用組間聯(lián)接法，設(shè)置區(qū)間為Pearson相關(guān)性，獲得譜系圖，結(jié)果顯示當(dāng)截距值取為12.5時(shí)，麻黃、杏仁、石膏可聚為一類，見圖2。結(jié)合關(guān)聯(lián)規(guī)則中，在置信度>80%的條件下，麻黃→杏仁支持度最高，考慮麻黃與杏仁為治療CAP的核心配伍藥對。

2.4 “麻黃-杏仁”化學(xué)成分和靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建通過TCMSP平臺檢索麻黃、杏仁，篩選出口服吸收率≥30%、類藥性≥0.18的有效化學(xué)成分，結(jié)果顯示：麻黃的有效化學(xué)成分有23個(gè)、杏仁有19個(gè)，兩者分別有452個(gè)、182個(gè)成分靶點(diǎn)。將麻黃和杏仁

圖1 高頻藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 27種高頻中藥聚類譜系圖

圖3 藥物-疾病靶點(diǎn)基因韋恩圖

圖4 藥物-疾病-化學(xué)成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

的成分靶點(diǎn)去重后分別為217個(gè)、70個(gè)靶點(diǎn)，通過UniProt數(shù)據(jù)庫對靶點(diǎn)進(jìn)行基因名矯正。通過OMIM、GeneCard、Grugbank數(shù)據(jù)庫，以“Community acquired pneumonia”為搜索詞檢索疾病靶點(diǎn)，所有疾病靶點(diǎn)合并去重后余135個(gè)，并通過UniProt數(shù)據(jù)庫矯正基因名，與藥物靶點(diǎn)基因取交集得54個(gè)，即麻黃-杏仁的有效化學(xué)成分作用于疾病的靶點(diǎn)，見圖3。將藥物靶點(diǎn)、疾病靶點(diǎn)、交集靶點(diǎn)進(jìn)行整理，生成"network" "type"文件，導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建“藥物-疾病-化學(xué)成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖(圖4)。該網(wǎng)絡(luò)包含213個(gè)節(jié)點(diǎn)，306條邊，藍(lán)色和紫色分別為麻黃和杏仁的有效化學(xué)成分，綠色為藥物的基因靶點(diǎn)，紅色為疾病和藥物的交集基因靶點(diǎn)。對網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析，選擇度值排名前5位作為麻黃與杏仁的核心化學(xué)成分，分別是槲皮素(quercetin)、植物甾醇(stigmasterol)、柚皮素(naringenin)、甘草查爾酮B(licochalcone B)、β-谷甾醇(β-sitosterol)，相關(guān)度值見表3。

表3 核心化學(xué)成分及度值

2.5 基于String和Cytoscape軟件的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將交集靶點(diǎn)基因上傳至String平臺，獲取“string_interractions.tsv”文件，導(dǎo)入Cytoscape軟件并構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，即核心藥物與疾病PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖5。根據(jù)度值調(diào)整網(wǎng)絡(luò)圖參數(shù)，圓圈代表每個(gè)蛋白質(zhì)目標(biāo)，連接線代表蛋白質(zhì)目標(biāo)之間的緊密程度。圓的大小、顏色、連接線的粗細(xì)、線條顏色與蛋白靶點(diǎn)的重要性呈正相關(guān)。白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、絲氨酸激酶B(AKT1)、IL-1β、腫瘤蛋白p53(oncoprotein p53，TP53)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP9)、胱天蛋白酶3(caspase 3，CASP3)、CXCL8、血管細(xì)胞黏附因子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM1)、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM1)、1SERPINE1等 10個(gè)蛋白靶點(diǎn)可能是藥物與疾病交互作用的重要靶點(diǎn)。其中IL-6、AKT1、IL-1β、MMP9、CXCL8這5個(gè)靶點(diǎn)與呼吸系統(tǒng)密切相關(guān)，可作為此次研究的核心靶點(diǎn)。

圖5 核心藥物-疾病PPI網(wǎng)絡(luò)

2.6 分子對接驗(yàn)證將5個(gè)核心靶點(diǎn)基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫獲取蛋白結(jié)構(gòu)，進(jìn)行分子對接。結(jié)合能見表4，對接結(jié)構(gòu)可視化可見圖6—圖10。5個(gè)核心靶點(diǎn)與中藥核心化學(xué)成分結(jié)合能均小于-5 kcal·mol-1，均有較強(qiáng)的結(jié)合作用。

表4 分子對接結(jié)合能

圖6 AKT1與5種核心化學(xué)成分對接圖

圖7 CXCL8與5種核心化學(xué)成分對接圖

圖8 IL-6與5種核心化學(xué)成分對接圖

圖9 IL-1β與5種核心化學(xué)成分對接圖

圖10 MMP9與5種核心化學(xué)成分對接圖

2.7 GO功能富集分析、KEGG通路富集分析依據(jù)Metascape數(shù)據(jù)庫對交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析、KEGG通路富集分析。在GO功能富集分析中取富集得分前10位，從生物過程(biological process，BP)來看，麻黃與杏仁的核心化學(xué)成分主要參與了凝血的正調(diào)控、氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)在凋亡信號通路的負(fù)調(diào)控、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、一氧化氮代謝過程的正調(diào)控、凝血機(jī)制調(diào)節(jié)、纖溶、止血調(diào)節(jié)、血管收縮的正調(diào)控、凝血調(diào)節(jié)。在細(xì)胞組成(cellular component，CC)方面，核心化學(xué)成分作用的位置可能是小窩、質(zhì)膜筏、膜筏、膜微區(qū)、肽酶復(fù)合物、富含ficolin-1的顆粒管腔、高爾基體、含膠原細(xì)胞外基質(zhì)、核基質(zhì)、核外圍。從分子功能(molecular function，MF)來看，核心化學(xué)成分可能影響了一氧化氮合酶結(jié)合、蛋白磷酸酶2A結(jié)合、無序結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、氧化還原酶活性、核心啟動(dòng)子序列特異性 DNA 結(jié)合、腫瘤壞死因子受體超家族結(jié)合、蛋白酶結(jié)合、蛋白激酶C結(jié)合、轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)子結(jié)合、絲氨酸水解酶活性，生物注釋與富集得分見圖11。KEGG通路富集分析則根據(jù)count值選取前20條通路，將其可視化，見圖12。點(diǎn)越大表示該通路上所富集的基因越多，顏色越深表示P值越小。其中位于前10位的通路主要有流體剪應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、晚期糖基化終末產(chǎn)物和受體(AGE-RAGE)信號通路、癌癥相關(guān)的通路、愛潑斯坦-巴爾病毒感染、丙型和乙型肝炎、磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸/蘇氨酸激酶(PI3K/AKT)信號通路、結(jié)核，考慮核心靶點(diǎn)可能作用于這些通路上。

圖11 BP、CC、MF生物注釋和富集得分

圖12 KEGG通路富集分析氣泡圖

3 討論

本文對286篇文獻(xiàn)，168個(gè)方藥進(jìn)行梳理規(guī)整和數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)在CAP的臨床治療中，麻黃與杏仁可作為核心藥對。兩者均入肺經(jīng)，一辛一苦，辛能升發(fā)，苦能斂降，宣降相因，共奏降氣化痰平喘之功，為宣降肺氣常用組合。臨床上也常應(yīng)用于外感風(fēng)寒表實(shí)證、外感風(fēng)寒內(nèi)兼郁熱證、外感風(fēng)寒肺失宣降證等。

槲皮素、植物甾醇、柚皮素、甘草查爾酮B、β-谷甾醇為麻黃、杏仁發(fā)揮藥效的核心化學(xué)成分。有研究表明，槲皮素可以促進(jìn)自噬反應(yīng)，通過調(diào)節(jié)活性氧的產(chǎn)生和病毒的生命周期，從而達(dá)到抗氧化、抗病毒和抗炎作用[10-11]。柚皮素作為柚皮苷的苷元，屬二氫黃酮類化合物，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、保護(hù)心臟等多種生物性能[12]，可通過抑制核苷酸結(jié)合域樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥小體、核轉(zhuǎn)錄因子信號(NF-κB)通路，減少細(xì)胞毒性，降低肺支氣管的炎癥反應(yīng)，改善肺損傷程度[13-15]。甘草查爾酮B為甘草的提取物，其所含的生物活性有抗革蘭陽性細(xì)菌作用，對耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌的作用尤為突出[16]。此外，甘草查爾酮B同樣也抑制NF-Kb信號通路的能力，具有很好的抗炎作用[17]。β-谷甾醇多存在于植物油、綠植和果蔬中，在抗炎、抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等方面有獨(dú)特的藥理活性[18-19]。Zhou等[20]研究發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇通過下調(diào)促凋亡因子來減輕視黃酸誘導(dǎo)基因I介導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞的凋亡損傷，對病毒感染的肺損傷有較好改善作用。Yuk等[21]研究發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇能減少嗜酸性粒細(xì)胞浸潤及杯狀增生，改善黏液分泌過多的現(xiàn)象，從而可以減輕肺部炎癥。Mahajan等[22]發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇通過抑制細(xì)胞反應(yīng)，減少2型T輔助細(xì)胞(Th2)細(xì)胞因子的釋放與合成，減輕肺部和氣道炎癥。

10個(gè)蛋白靶點(diǎn)中與呼吸系統(tǒng)疾病密切相關(guān)的核心靶點(diǎn)主要有IL-6、AKT1、IL-1β、MMP9、CXCL8。其中，IL-6、IL-1β、CXCL8為炎癥反應(yīng)中的重要細(xì)胞因子，是中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)趨化因子和炎癥的關(guān)鍵介質(zhì)[23]。機(jī)體發(fā)生感染或組織損傷時(shí)，炎癥細(xì)胞會(huì)迅速產(chǎn)生IL-6[24]。IL-1β會(huì)誘導(dǎo)各種趨化因子，影響外周循環(huán)的炎癥因子聚集至肺組織結(jié)構(gòu)，加重肺部炎癥[25]。尚立芝等[26]發(fā)現(xiàn)，通過抑制CXCL8、CXC趨化因子受體1(CXCR1)、CXC趨化因子受體2(CXCR-2)的基因表達(dá)，可以控制炎細(xì)胞趨化，減緩疾病進(jìn)程。絲氨酸激酶(AKT1)參與糖代謝、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡過程。MMP參與各種生理過程中的組織重塑，如血管再生和傷口修復(fù)。已有研究證明，MMP-9在糖尿病和代謝疾病中的作用[27]。張永標(biāo)等[28]在臨床中發(fā)現(xiàn)，CAP患者血清MMP-9水平明顯上升，推測MMP-9可參與CAP的炎性反應(yīng)過程。

KEGG通路富集分析中PI3K/AKT信號通路與哮喘、COPD、急性肺炎等呼吸系統(tǒng)密切相關(guān)。P13K/AKT信號通路參與了氣道和肺部的炎癥反應(yīng)[29-30]。該通路能夠激活炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子，產(chǎn)生腫瘤壞死因子、IL等炎性因子[31]。PI3K/AKT通路也是病毒感染影響各種細(xì)胞功能的重要機(jī)制[32]，通過抑制PI3K的表達(dá)，能夠抑制IL-1β、IL-18等炎癥因子的活化[33]。除此之外，抑制PI3K/AKT通路能夠改善氣道重塑和降低炎癥反應(yīng)，抑制Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生，減少嗜酸性粒細(xì)胞浸潤和氣道黏液，降低氣道高反應(yīng)性[34-35]。其余通路參與CAP作用機(jī)制的相關(guān)科研證據(jù)尚不充分。由此，PI3K/AKT信號通路參與支氣管及肺部的炎癥反應(yīng)過程及氣道重塑過程，作為麻黃-杏仁參與CAP的重要通路之一。

綜上所述，本文總結(jié)了CAP的臨床用方規(guī)律，對其進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析、關(guān)聯(lián)規(guī)則和系統(tǒng)聚類分析，得出麻黃和杏仁是臨床CAP的常用藥對組合。槲皮素、植物甾醇、柚皮素、甘草查爾酮B、β-谷甾醇為其發(fā)揮藥效的核心化學(xué)成分，發(fā)揮抗炎、抗氧化、抑制炎癥產(chǎn)生相關(guān)信號通路的作用，并作用于IL-6、IL-1β、AKT1、MMP9、CXCL8等蛋白靶點(diǎn)，參與PI3K/AKT信號通路，從而達(dá)到減輕肺部炎癥反應(yīng)，改善臨床癥狀的治療效果，為今后中西醫(yī)治療CAP的臨床診療提供理論依據(jù)。