孟瑩，王曉紅，劉曉利，張琪，盧甜甜，程忠哲*（.濰坊醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，山東 濰坊 6053；.淄博市疾病預(yù)防控制中心，山東 淄博 55000）

龍葵為茄科茄屬植物龍葵（

Solanum nigrum

L.）的全草部分，是一種藥食兩用的植物，作為傳統(tǒng)的中藥材，常用于治療疔瘡、癰腫、丹毒、跌打扭傷等疾病。天然藥物化學(xué)研究表明從龍葵中分離鑒定出的化學(xué)成分有生物堿、酚酸、黃酮等。其中酚酸類具有抑菌、抗病毒、抗氧化、降血壓等作用；黃酮類具有抗炎、抗病毒、抗自由基、抗脂質(zhì)過氧化、拮抗血小板活化因子、血管舒張、抗急性胰腺炎等作用。研究表明，綠原酸具有抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等活性?？Х人峋哂锌寡?、抗氧化等活性。沒食子酸可以抗糖尿病、抗肝纖維化、抗腫瘤等。（

E

）-阿魏酸能夠降血脂、抗血栓、抗氧化。原兒茶酸可以發(fā)揮調(diào)節(jié)肝糖異生、抗炎、抗病毒等作用。蘆丁具有抗病毒、抗自由基等活性。目前龍葵中各成分的定量研究多集中于生物堿和皂苷類化合物，針對其酚酸成分的含量研究尚未見報(bào)道，采用染色法測定龍葵中總酚酸及HPLC 法同時(shí)定量龍葵全草各部位（熟果、青果、莖、葉）中多種酚酸類化合物和黃酮類化合物的相關(guān)文獻(xiàn)均未見報(bào)道。故本實(shí)驗(yàn)首先采用三氯化鐵-鐵氰化鉀染色法研究龍葵不同部位（熟果、青果、莖、葉）中總酚酸含量的分布。然后，采用HPLC 分段波長法同時(shí)定量龍葵不同部位潛在的5 種酚酸類指標(biāo)成分[綠原酸、咖啡酸、沒食子酸、（

E

）-阿魏酸、原兒茶酸]及1 種黃酮類（蘆?。┏煞?，為龍葵的質(zhì)量控制及進(jìn)一步開發(fā)提供參考。

1 儀器與試藥

LC-20A 高效液相色譜儀，配有紫外檢測器（SPD-20A）、UV-2700 紫外分光光度計(jì)（日本島津公司），KQ3200DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），AR153CN 電子天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司]，200T 多功能粉碎機(jī)（永康市鉑歐五金制品有限公司）。蘆丁對照品（批號：100080-200707，純度：90.5%，中國食品藥品檢定研究院），沒食子酸（批號：C12211832）、（

E

）-阿魏酸（批號：C12085953）對照品（純度≥99%，上海麥克林生化科技有限公司），綠原酸對照品（批號：PS000627，純度＞98.0%，成都普思生物科技股份有限公司），原兒茶酸對照品（批號：W09A11B111046，純度≥97%，上海源葉生物科技有限公司），咖啡酸對照品（批號：BQZ406，純度：99.65%，上海畢得醫(yī)藥科技股份有限公司），十二烷基硫酸鈉、鐵氰化鉀（上海麥克林生化科技有限公司），無水三氯化鐵（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），濃鹽酸（煙臺遠(yuǎn)東精細(xì)化工有限公司），水為娃哈哈純凈水，色譜甲醇（MeOH）、色譜乙腈（ACN）（Sigma-Aldrich），其他試劑均為分析純。龍葵全草，2020年9月采于山西省運(yùn)城市垣曲縣，經(jīng)濰坊醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院王曉紅（講師）鑒定為茄科屬植物龍葵

Solanum nigrum

L.的全草。

2 三氯化鐵-鐵氰化鉀染色法定量分析

2.1 溶液的配制

2.1.1 顯色劑 ① 0.3%十二烷基硫酸鈉（SDS）：精密稱取SDS 0.300 g，加水100 mL 溶解，制得0.3%SDS 溶液。② 0.1 mol·L鹽酸：精密量取濃鹽酸4.1 mL，加超純水至500 mL，制得0.1 mol·L的稀鹽酸溶液。③ 0.9% K[Fe（CN）]試液：精密稱取K[Fe（CN）]粉末0.450 g，加超純水至50 mL，得0.9%K[Fe（CN）]溶液。④ 0.6% FeCl試液：精密稱取FeCl固體0.300 g，加超純水至50 mL，制得0.6%FeCl溶液。

2.1.2 供試品溶液 稱取過五號篩的樣品粉末0.1 g，加入2 mL 50%甲醇水溶液，稱重，超聲20 min，補(bǔ)足失重，12 000 r·min離心10 min，取出上清液，待用。

2.1.3 沒食子酸對照品溶液 精密稱定沒食子酸對照品5 mg 于25 mL 量瓶中，用甲醇定容，配制成質(zhì)量濃度為200 μg·mL的對照品儲備液，再稀釋10 倍得工作溶液，4℃保存，待用。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.1.3”項(xiàng)下沒食子酸對照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.2、1.6、2 mL 于25 mL 量瓶中，加入2 mL 0.3% SDS溶液， 再加入1 mL 0.9% K[Fe（CN）]與0.6%FeCl的等比混合溶液，搖勻，暗處靜置5 min 后以0.1 mol·L鹽酸定容。暗處靜置20 min，在400 ～800 nm 內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果顯示沒食子酸在720 nm 波長處吸光度值最大，結(jié)果如圖1 所示。以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)作線性回歸，得到

y

＝0.5749

x

＋0.1151，

r

＝0.9985，線性范圍0.16 ～1.6 μg·mL。

圖1 沒食子酸顯色后紫外-可見吸收光譜Fig 1 UV-vis absorption spectra of gallic acid after the coloration

2.2.2 精密度試驗(yàn) 將0.6 mL 含有20 μg·mL沒食子酸的對照品溶液顯色后連續(xù)測定6 次，計(jì)算得含量

RSD

為0.24%，表明本法精密度良好。2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 提取液置于室溫下分別于0、1、2、4、6、8、12、24 h 后顯色處理，測定吸光度值，計(jì)算含量

RSD

為4.0%。表明供試品溶液室溫條件下24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 分別吸取6 份100 μL 供試品溶液于25 mL 量瓶中，顯色，測定吸光度值，計(jì)算6 份供試品溶液含量的

RSD

為4.1%，表明重復(fù)性良好。2.2.5 加樣回收試驗(yàn) 分別吸取100 μL 供試品液6份，按1∶1水平精密加入沒食子酸對照品溶液適量，顯色，測定吸光度值，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果總酚酸的平均加樣回收率為103.70%，

RSD

為2.7%。

2.3 樣品含量測定

按“2.1.2”項(xiàng)下方法配制龍葵不同部位供試品溶液，精密吸取100 μL 于25 mL 量瓶中，顯色，測定吸光度值，計(jì)算不同部位總酚酸含量。熟果、葉、青果、莖中總酚酸含量依次為（7040±195）μg·g、（4430±120）μg·g、（2720±97）μg·g、（810±9）μg·g，占比分別為0.70%、0.44%、0.27%、0.008%。

3 HPLC 定量分析

3.1 色譜條件

Kromasil 100-5C（150 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相分別為0.1%甲酸水溶液（A）和甲醇（B）；梯度洗脫（0.01 ～11 min，5%B；11 ～20 min，5%→20%B；20 ～30 min，20%→30%B；30 ～40 min，30%→45%B；40 ～45 min，45%→70%B；45 ～48 min，70%→90%B；48 ～53 min，90%→90%B；53 ～53.1 min，90%→5%B；53.1 ～58.1 min，5%→5%B）；流速1 mL·min；柱溫30℃；進(jìn)樣量20 μL；檢測波長274 nm（沒食子酸）、258 nm（原兒茶酸）、320 nm[綠原酸、咖啡酸、（

E

）-阿魏酸、蘆丁]。

3.2 溶液配制

3.2.1 供試品溶液 稱取過五號篩的樣品粉末0.1 g，加入2 mL 50%甲醇溶液，稱重，超聲20 min，補(bǔ)足失重，12 000 r·min離心10 min，取上清液，旋蒸至干，加入50%甲醇溶液500 μL渦旋復(fù)溶，過0.22 μm 濾膜備用。

3.2.2 混合對照品溶液 精密稱定對照品沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、（

E

）-阿魏酸和蘆丁適量，加50%甲醇溶液溶解，配制成質(zhì)量濃度分別為25、100、300、15、30 和250 μg·mL的混合對照品溶液，4℃保存。

3.3 方法學(xué)考察

3.3.1 專屬性試驗(yàn) 取“3.2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液和由莖、葉、青果、熟果粉末按“3.2.1”項(xiàng)下方法配制的供試品溶液分別進(jìn)樣分析。沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、（

E

）-阿魏酸和蘆丁的保留時(shí)間分別為7.00、15.49、25.19、27.00、35.39、40.83 min，各化合物分離度良好且無明顯干擾，如圖2 所示。

圖2 對照品和供試品代表性HPLC 色譜圖Fig 2 Typical HPLC chromatograms of reference and samples

3.3.2 線性關(guān)系考察 精密量取“3.2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，稀釋為6 個(gè)質(zhì)量濃度梯度的混合對照品工作溶液，進(jìn)樣測定，以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，各組分在其線性范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。以信噪比

S/N

≥3 時(shí)的濃度為檢測限（LOD），信噪比

S/N

≥10 時(shí)的濃度為定量限（LOQ），結(jié)果如表1所示。

表1 6 種成分線性關(guān)系
Tab 1 Linear relationships of 6 components

成分回歸方程r線性范圍/（ng·mL－1）LOD/（ng·mL－1） LOQ/（ng·mL－1）沒食子酸y ＝74.733x ＋7200.20.99932.5×102 ～2.5×104 48160原兒茶酸y ＝85.665x－150860.99981.0×103 ～1.0×105156520綠原酸y ＝66.128x ＋328140.99983.0×103 ～3.0×105 25 50咖啡酸y ＝123.94x－3584.90.99971.5×102 ～1.5×104 9 30（E）-阿魏酸y ＝116.95x ＋502280.99953.0×102 ～3.0×104 6 20蘆丁y ＝31.641x－250300.99982.5×103 ～2.5×105 85170

3.3.3 精密度試驗(yàn) 將“3.2.2”項(xiàng)下的混合對照品溶液稀釋1 倍，連續(xù)進(jìn)樣6 次，分別測得沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、（

E

）-阿魏酸、蘆丁含量的

RSD

分別為2.1%、1.8%、1.9%、2.0%、1.8%、2.0%，表明儀器精密度良好，將上述溶液連續(xù)3 d 進(jìn)樣，測得這6 種成分含量

RSD

分別為1.7%、2.1%、1.8%、2.8%、2.3%、2.7%，表明儀器日間精密度良好。3.3.4 穩(wěn)定性試 按“3.2.1”項(xiàng)下方法配制龍葵全草供試品溶液，置室溫下分別于0、1、2、4、8、12、24 h 后進(jìn)樣分析，測得沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、（

E

）-阿魏酸、蘆丁含量

RSD

分別為4.9%、3.9%、4.1%、4.8%、5.1%、2.2%。表明供試品溶液室溫條件下24 h 穩(wěn)定性良好。3.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取按“3.2.1”項(xiàng)下方法平行配制的6 份龍葵全草供試品溶液進(jìn)樣分析，測得沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、（

E

）-阿魏酸、蘆丁含量

RSD

分別為3.0%、3.2%、1.7%、0.80%、3.5%、2.3%，說明本法重復(fù)性良好。3.3.6 加樣回收試驗(yàn) 稱取龍葵熟果0.05 g，平行3 份，按“3.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別按照50%、100%、150%水平精密加入混合對照品溶液，進(jìn)樣測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果6 種成分的平均加樣回收率均在95.58%～108.41%，

RSD

在0.34%～4.5%。

3.4 樣品含量測定

按“3.2.1”項(xiàng)下方法配制不同部位供試品溶液，進(jìn)樣分析，結(jié)果見表2，含量熱圖如圖3 所示。

圖3 成分含量熱圖Fig 3 Heatmap of component content

表2 龍葵各部位中各組分含量測定結(jié)果(μg·g， ＝3)
Tab 2 Content of 6 components in L.(μg·g， ＝3)

部位沒食子酸原兒茶酸綠原酸咖啡酸（E）-阿魏酸蘆丁青果熟果9.39±0.59 14.67±0.83 9.04±0.26 11.27±0.19 123.25±0.84 890.27±9.20 25.47±0.27 159.35±1.60莖3.54±0.19 3.60±0.02 6.50±0.07 30.75±0.27 18.00±0.28葉7.26±0.58 17.59±0.42 8.72±0.75 21.13±0.24 364.95±3.36 42.17±0.42 1.56±0.08 9.65±0.30 27.65±0.24 19.15±0.38 56.65±0.97

3.5 樣品數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

樣品中5 種酚酸成分含量的差異采用方差分析進(jìn)行研究。由于莖中5 種酚酸類成分含量無較大差異，因此選擇熟果、葉和青果中5 種酚酸類成分含量采用IBM SPSS Statistics 24.0 軟件進(jìn)行無重復(fù)數(shù)據(jù)的兩因素方差分析，結(jié)果如表3 所示，表3 中成分的顯著性

P

＝0.044 證明了在置信區(qū)間95%范圍內(nèi)熟果、葉和青果各部位酚酸的含量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。

表3 方差分析結(jié)果
Tab 3 Analysis of variance

注：a. ＝0.708（調(diào)整后 ＝0.489）。
Note：[a. ＝0.708（adjusted ＝0.708）]

源Ⅲ類平方和 自由度均方F顯著性修正模型548 447.248a6 91 407.875 3.234 0.064截距196 070.2341196 070.234 6.936 0.030部位 92 588.2542 46 294.127 1.638 0.253成分455 858.9934113 964.748 4.031 0.044誤差226 149.5178 28 268.690總計(jì)970 666.99815修正后總計(jì) 774 596.76514

4 討論

研究表明，龍葵中含有酚酸和黃酮等活性成分，但其含量研究尚未見報(bào)道。龍葵通常為全草入藥，不同部位中酚酸類化合物的含量可能存在差異。

酚酸類化合物在抗氧化、抗腫瘤、抑菌、護(hù)肝、提高免疫力等方面表現(xiàn)出生物活性，因此多種藥用植物采用酚酸類化合物作為質(zhì)量控制指標(biāo)。如《中國藥典》（2020年版）中冬葵果以總酚酸作為質(zhì)量控制指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)對龍葵中總酚酸含量進(jìn)行測定，結(jié)果表明龍葵不同部位均含有總酚酸。其中熟果的含量最高，其次為葉，青果，莖中最低。藥典規(guī)定冬葵果總酚酸不低于0.15%，提示總酚酸可以作為龍葵質(zhì)量控制的指標(biāo)之一。

進(jìn)一步采用HPLC 分段波長法同時(shí)定量研究龍葵不同部位6 個(gè)多酚含量。分段波長法在提高檢測靈敏度的同時(shí)，又使分析物附近干擾峰減少，有利于提高分離度。本實(shí)驗(yàn)選取多酚類化合物中活性較高的綠原酸、咖啡酸、沒食子酸、（

E

）-阿魏酸、原兒茶酸及蘆丁進(jìn)行含量研究。結(jié)果顯示，6 種活性成分在不同部位中均有檢出。所有部位中綠原酸含量最高，其次為咖啡酸、蘆丁、（

E

）-阿魏酸、沒食子酸，原兒茶酸最低。不同部位中6種成分總和熟果含量最高，其次為葉、青果，莖中最低（見圖3 左上）。綠原酸在熟果中含量最高（0.089%），其次為葉（0.036%），青果（0.012%），莖中最低（0.002%），藥典規(guī)定杜仲葉、忍冬藤綠原酸含量分別不低于0.08%、0.10%，提示綠原酸可以作為龍葵質(zhì)量控制的指標(biāo)之一；咖啡酸在熟果中含量最高（0.016%），其次為葉（0.004%），青果（0.003%），莖中最低（0.0004%），藥典規(guī)定蒲公英咖啡酸含量分別不低于0.02%，熟果中含量接近，提示其可以作為龍葵質(zhì)量控制的指標(biāo)之一。綠原酸和咖啡酸在龍葵中含量與《中國藥典》規(guī)定較高或相近，可以作為主要質(zhì)量控制指標(biāo)，其他4 個(gè)酚酸類成分[（

E

）-阿魏酸、沒食子酸、原兒茶酸及蘆丁]可以作為次要質(zhì)量控制指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)采用三氯化鐵-鐵氰化鉀染色法測定了不同部位的總酚酸，結(jié)果各部位均含有總酚酸。其中熟果、葉和青果總酚酸含量高于《中國藥典》對冬葵果總酚酸含量的規(guī)定。進(jìn)一步采用HPLC分段波長法同時(shí)定量龍葵不同部位中5 種酚酸類化合物和1 種黃酮類化合物的含量，發(fā)現(xiàn)綠原酸和咖啡酸與《中國藥典》中的規(guī)定較高或接近，因此，綠原酸、咖啡酸可以作為龍葵潛在的主要質(zhì)量控制指標(biāo)。（

E

）-阿魏酸、沒食子酸，原兒茶酸及蘆丁可以作為龍葵潛在的次要質(zhì)量控制指標(biāo)。為龍葵的質(zhì)量控制研究及進(jìn)一步開發(fā)提供參考。