劉家興，李麗美，楊慶云，臧清策，吳松，張瑞萍*，再帕爾·阿不力孜，2（.中國醫(yī)學科學院/北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所 天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室，北京 00050；2.中央民族大學 生物成像與系統(tǒng)生物學研究中心，北京 0008）

他達拉非（tadalafil，TDF），化學名：6-（1，3-苯間二氧戊環(huán)-5-基）-2，3，6，7，12，12a-六氫化-2 甲基-（6R，12aR）-吡嗪并[1'2'：1，6]吡啶并[3，4-b]吲哚-1，4-二酮，可以特異性長效抑制磷酸二酯酶5（PDE5），是一種非激素類抗男性勃起功能障礙（ED）藥，與其他治療ED的藥物相比，該藥具有活性高、不良反應少、半衰期長等優(yōu)點。他達拉非于2003年11月在美國上市，2005年5月在中國上市。他達拉非的化合物專利ZL95192078.2 已于2015年1月到期，所以研究突破專利的新工藝對于他達拉非仿制藥在中國上市具有重要價值，迫切需要開展他達拉非仿制藥的質量控制方法研究。

文獻報道的他達拉非的合成路線主要有7條，其工業(yè)化生產路線是以

D

-色氨酸甲酯鹽酸鹽為起始原料，與胡椒醛進行Pictet-Spengler反應后再經(jīng)?；磻⒂H核取代及關環(huán)反應制得他達拉非（見圖1）。其中，（1

R

，3

R

）-1-（1，3-苯并二氧戊環(huán)-5-基）-2-（2-氯乙?；?1，2，3，4-四氫-9H-吡啶并[3，4-b]吲哚-3-羧酸甲酯（T2），是基于該路線合成他達拉非過程產生的中間體物質，作為合成他達拉非最后一步反應的原料，不可避免會作為雜質存在于終產品中。

圖1 他達拉非工業(yè)合成路線Fig 1 Industrial synthetic route of tadalafil

該雜質結構中含有羰基取代的鹵代烷基，該基團不僅具有強吸電子特性，還具有強電負性，會產生具有強親電性的碳原子，易與DNA 等生物大分子發(fā)生烷基化反應，被納入歐盟發(fā)布的具有基因毒性的警示結構。本課題組采用歐盟委員會的歐洲化學品局聯(lián)合研究中心（Joint Research Centre of European Chemicals Bureau）開發(fā)的免費毒性預測平臺Toxtree（http：//toxtree.sourceforge.net/）進一步預測T2 的致癌性和遺傳毒性，評價結果為陽性，按照2020年版《中國藥典》四部通則9306 遺傳毒性雜質控制指導原則，T2 屬于第3 類雜質，需要進行毒理學關注閾值限度控制以及進一步的毒理學實驗評價。本研究旨在建立一種基于UPLC-q/LIT-MS 技術的專屬性強、靈敏度高的他達拉非原料藥中潛在基因毒性雜質T2 的定量測定方法。

1 儀器與試藥

分析天平（XPE205，Mettler Toledo，USA）；ACQUITY UPLC 超高效液相色譜儀（Waters，USA）；四極桿-線性離子阱串聯(lián)質譜儀（QTRAP 5500，AB SCIEX，USA）；四極桿-飛行時間串聯(lián)質譜儀（Triple TOF 5600 ＋，AB SCIEX，USA）；渦旋混合器（MS3，IKA）；單通道微量移液器（Eppendorf，USA）；Captiva 96 孔板過濾裝置（Agilent，USA）；雜質對照品（自制）；他達拉非原料藥（批號分別為TDLF01、TDLF02，自制）；甲醇、乙腈（LC-MS 純，F(xiàn)isher）；乙酸銨（分析純，Sigma）；其余試劑為分析純；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件 采用ACQUITY UPLC HSS T3柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相A 為0.02 mol·L乙酸銨溶液（含0.1%乙酸），流動相B 為乙腈，梯度洗脫（0 ～1 min，70%→21%A；1 ～6.5 min，21%→20%A；6.5 ～8 min，20%→70%A）；流速：0.35 mL·min；柱溫：25 ℃；進樣量：5 μL。

2.1.2 質譜條件 四極桿-線性離子阱串聯(lián)質譜儀、四極桿-飛行時間串聯(lián)質譜儀，配有TurboIonspray（ESI）離子源及Analyst1.5.1 分析軟件。所使用的各種氣路均為氮氣。離子源溫度500℃；離子源噴射電壓5.0 kV；霧化氣壓力50 psi；輔助氣壓力50 psi；氣簾氣壓力25 psi。定量分析采用Multiquant 3.0.3 軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2.1.3 目標離子的選擇 采用Triple TOF 5600 ＋質譜儀正離子檢測模式在

m/z

100 ～500 內全掃描，采集得到的雜質中間體的MS質譜圖如圖2所示。采用QTRAP 5500 質譜儀的MRM 模式進行定量數(shù)據(jù)采集，用于雜質定量測定的離子對為

m/z

427.1 →

m/z

135.0，去簇電壓為80 V，碰撞能量為30 eV。

圖2 雜質中間體的MS/MS 質譜圖Fig 2 MS/MS spectrum of the genotoxic impurity

2.2 溶液制備

2.2.1 雜質對照品儲備溶液配制 精密稱取雜質對照品適量于量瓶中，加乙腈超聲溶解并定容，搖勻，配制成1 mg·mL的雜質對照品儲備液。

2.2.2 原料藥供試品溶液配制 分別精密稱取他達拉非原料藥TDLF01 供試品3 份，每份10 mg，置于10 mL 量瓶中，加乙腈超聲溶解，并定容至刻度，搖勻，配制成1 mg·mL的原料藥供試品儲備液一。

分別精密稱取他達拉非原料藥TDLF02 供試品3 份，每份5 mg，置于5 mL 量瓶中，加乙腈超聲溶解，并定容至刻度，搖勻，配制成1 mg·mL的原料藥供試品儲備液二。

分別稀釋上述原料藥供試品儲備液至含他達拉非5.00 μg·mL，作為雜質含量測定的原料藥供試品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性考察 分別將空白溶劑、雜質對照品儲備溶液、原料藥供試品溶液進樣測定，得到XIC色譜圖如圖3 所示。雜質中間體的保留時間在3.08 min 左右，空白溶劑與待測樣品中均沒有干擾雜質中間體含量測定的物質存在，專屬性良好。

圖3 雜質T2 的XIC 色譜圖Fig 3 XICs of the genotoxic impurity

2.3.2 線性試驗 精密量取雜質對照品儲備液，用乙腈稀釋制成0.10、0.50、0.80、1.0、5.0、8.0、10、50和80 ng·mL系列對照品溶液，依次進樣。以峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程

Y

＝9.25×10

X

＋238（

r

＝0.9996）。結果表明，中間體化合物在0.10 ～80 ng·mL內與峰面積呈良好的線性關系。2.3.3 檢測限與定量限 取0.10 ng·mL的對照品溶液，逐級稀釋，依次進樣，以

S/N

＝3 時的濃度為檢測限，檢測限為25 pg·mL，

S/N

＝10 時的濃度為定量限，定量限為80 pg·mL。

2.3.4 精密度

① 日內精密度：精密稀釋“2.2.1”項下雜質對照品儲備液，用乙腈稀釋至0.50、5.0、50 ng·mL3 個質量濃度，平行制備5 份樣品，每個樣品一日測定3 次，結果其峰面積

RSD

分別為3.1%、5.0%、3.4%，結果說明日內精密度良好。② 日間精密度：精密稀釋“2.2.1”項下雜質對照品儲備液，用乙腈稀釋至0.50、5.0、50 ng·mL3 個質量濃度，平行制備5 份樣品，連續(xù)測定3 d，結果其峰面積

RSD

分別為8.2%、7.4%、3.6%，結果說明日間精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性

① 4℃放置穩(wěn)定性：精密稀釋“2.2.1”項下雜質對照品儲備液，用乙腈稀釋至5.00 ng·mL，在4℃下放置0、2、4、6、8 h，進樣測定，結果峰面積

RSD

為4.3%；取“2.2.1”項下的原料藥供試品溶液，重復上述操作，結果峰面積

RSD

為5.9%，說明溶液在4 ℃放置8 h 內基本穩(wěn)定。② 室溫放置穩(wěn)定性：精密稀釋“2.2.1”項下雜質對照品儲備液，用乙腈稀釋至5.00 ng·mL，在室溫下放置0、12、24 h，進樣測定，結果峰面積

RSD

為7.1%；取“2.2.2”項下原料藥供試品溶液，重復上述操作，結果峰面積

RSD

為5.2%，說明溶液室溫放置24 h 內基本穩(wěn)定。2.3.6 加樣回收試驗 精密稱取“2.2.2”項下原料藥9 份，每份1.00 mg，置于2 mL 量瓶中，精密加入0.12、0.15、0.18 mL 2.00 μg·mL雜質對照品溶液，用乙腈超聲溶解并定容至刻度，搖勻，每個樣品平行制備3 份。分別稀釋上述溶液至含他達拉非5.00 μg·mL，進樣測定，獲得相應的雜質峰面積，計算回收率及對應

RSD

，結果顯示，加樣回收率均在90%～110%，

RSD

均小于10%，表明方法加樣回收率滿足要求。2.3.7 耐用性考察 對分析條件進行細微調整，考察了柱溫23℃與28℃，流速0.3 mL·min與0.4 mL·min的影響，發(fā)現(xiàn)雜質的XIC 圖中，色譜峰形無明顯變化，保留時間及峰面積發(fā)生微小改變，

RSD

值均小于5%，表明分析條件的微小變動不影響T2 雜質的檢測，方法的耐用性良好。

2.4 雜質含量測定

按“2.2.2”項下方法操作，精密配制2 個批次的原料藥供試品溶液，每個批次平行制備3 份，按“2.1”項下方法依次測定，結果其含量均低于檢測限。

3 討論

基因毒性雜質因其能對DNA 或RNA 中嘌呤、嘧啶堿基或者磷酸雙酯骨架上的N 原子或O 原子等進行親電進攻，從而造成DNA 雙鏈斷裂，空間構象改變等結構異常，進而產生誘導突變、致癌等毒性而受到廣泛關注。他達拉非合成工藝雜質（T2）具有基因毒性的警示結構，存在潛在的致癌風險，為保障用藥安全，有必要對該雜質進行嚴格的限量控制。毒理學關注閾值（TTC）的提出進一步規(guī)范了對于基因毒性雜質的監(jiān)管。2006年1月由輝瑞、強生、葛蘭素史克等國際制藥企業(yè)中的研發(fā)人員組成的美國藥物研究和制造商協(xié)會（Pharmaceutical Research and Manufacturers of America，PhRM）專家小組在Lutz Müller 等的領導下首次提出了“階段化TTC”的概念，即根據(jù)不同的暴露時間，設定不同的控制限度，對于有些基因毒性基團，如黃曲霉素類、偶氮苯類、

N

-亞硝基物類因具有較高的致癌風險，需要進行特殊的限度控制。人用藥物注冊技術要求國際協(xié)調會（ICH）基因毒性雜質研究指南M7（R1）對于基因毒性雜質監(jiān)管要求較為寬松，這可以為根據(jù)他達拉非的用藥劑量和用藥周期制訂合理的雜質控制標準提供參考。

4 結論

本研究建立了他達拉非原料藥中具有潛在基因毒性雜質T2 的定量分析方法。該方法簡單、快速、回收率好、靈敏度高，填補了國內該方面研究的空白，有助于對他達拉非仿制藥合成過程中的質量參數(shù)進行有效監(jiān)測。根據(jù)《基因毒性雜質限度指南》，基因毒性雜質限度水平應該小于1.50 μg·d，結合本制劑的用法用量，按每日服用最大量20 mg 計算，以本方法分析時原料藥中雜質含量相當于375 pg·mL。本方法的定量限低于該含量水平，因此適用于他達拉非潛在基因毒性雜質T2 的檢測，可以滿足高于TTC 要求雜質限度的準確分析。