陳海燕，隨家寧，黃婉清，農(nóng)麗惠，馮婷，李芳嬋*，蔣林，2，3*（.廣西中醫(yī)藥大學，南寧 530200；2.廣西壯瑤藥工程技術研究中心，南寧 530200；3.廣西高校中藥制劑共性技術研發(fā)重點實驗室，南寧 530200）

三方益子方由三個古代經(jīng)典名方加減化裁而來，由鹽益智、鹽補骨脂、烏藥、金櫻子、酒覆盆子、酒黃精、枸杞子、桑葚、芡實、酒蓯蓉和炙甘草11 味藥組成，具暖腎祛寒、溫脾養(yǎng)肝、縮尿止遺的功效。方中益智仁能溫腎暖脾、固精縮尿，補骨脂能溫腎助陽、納氣平喘、溫脾止瀉，鹽炙能緩和辛竄濕燥之性，并可引藥入腎，增強補腎健脾之功效，兩者共為君藥。烏藥能行氣止痛、溫腎散寒，能除膀胱和腎間冷氣、止小便頻數(shù)，為臣藥。肉蓯蓉能補腎陽、益精血、潤腸道，為佐藥。甘草益氣補中、調(diào)和藥性，為使藥。

在選擇含量測定對象時，要全面且科學，按君臣佐使選擇重點質(zhì)量標志物，文獻表明，5-羥甲基糠醛是食品和藥品中普遍存在的共性成分，具有保肝、改善學習記憶、保護神經(jīng)系統(tǒng)、抗炎、抗氧化等多種功效，且可促進甘草酸的代謝，加強抑制腫瘤、抗炎、降低血中膽固醇的作用，本方中鹽益智、黃精、枸杞子、桑葚、酒蓯蓉、炙甘草均含有該成分，覆蓋君臣佐使藥。方中鹽益智、金櫻子、桑葚、枸杞子均含有原兒茶酸，該化合物可通過抗氧化應激活性發(fā)揮保肝作用。單體松果菊苷為肉蓯蓉中的保肝活性成分，補骨脂素和異補骨脂素是補骨脂中的主要活性成分之一，甘草中的甘草酸具改善腎功能的作用。為提升和完善三方益子膏質(zhì)量標準，確保臨床用藥的安全，本研究擬采用薄層色譜法對三方益子膏中鹽益智、鹽補骨脂、烏藥、酒蓯蓉、炙甘草5 味藥材進行定性鑒別，采用高效液相法測定有效成分5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、松果菊苷、補骨脂素、異補骨脂素和甘草酸含量，為三方益子膏的質(zhì)量標準起草提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

安捷倫1260 高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；超純水儀一體機Direct-Q5UV（廣西南寧市博美生物科技有限公司）；KQ-500E 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SQP 十萬分之一電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；DZF-6090 真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；HH-4 恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；AR204E 千分之一電子天平[奧豪斯儀器（常州）有限公司]。

1.2 試藥

甲醇（批號：2020102902）、乙醇（批號：2019121602）、乙酸乙酯（批號：2020081101）、冰醋酸（批號：2018081301）、 硫酸（批號：2018082901）、正丁醇（批號：2019032201）、石油醚（批號：2020072701）（成都市科隆化學品有限公司）；36%醋酸（上海阿拉丁生化技術有限公司）；甲酸（批號：2019040802，天津市大茂化學試劑廠）；正己烷（批號：2020080501）、環(huán)己烷（批號：2019071802）（天津市富宇精細化工有限公司）；色譜級乙腈[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；分析級磷酸（批號：20190606，成都金山化學試劑有限公司）；蜂蜜（湖南藥圣堂中藥科技有限公司）；阿斯帕坦（南寧市越前食品添加劑有限責任公司）；對照藥材益智仁（批號：121590-202003）、 補骨脂（批號：121056-201605）、烏藥（批號：121096-201907）、肉蓯蓉（批號：121101-201603）、甘草（批號：120904-202021）； 對照品原兒茶酸（批號：110809-201906）、松果菊苷（批號：110749-201919）、補骨脂素（批號：111525-201912）、異補骨脂素（批號：110736-201943）、5-羥甲基糠醛（批號：110629-201919）（含量＞98%，中國食品藥品檢定研究院）；對照品甘草酸（批號：RP190517，含量：99.34%，成都麥德生科技有限公司）；薄層樣品（批號：20201001、20201002、20201003），S1 ～S10 號樣品（批號：20210301，20210302，20210303，20210304，20210305，20210306，20210307，20210308，20210309，202103010）（由廣西中醫(yī)藥大學廣西壯瑤藥工程中心實驗室自制，規(guī)格：180 g/瓶）。

2 三方益子膏的制備

按處方量稱取鹽益智、鹽補骨脂、烏藥、金櫻子、酒覆盆等11 味藥材，加14 倍量水提取2 次，每次2 h，濾過，濃縮至相對密度為1.40 ～1.45（80 ～90℃），添加輔料蜂蜜∶阿斯帕坦（10∶0.1）適量，攪拌均勻，分裝，滅菌，即得（1 g 膏滋相當于1.842 g 生藥量）。

3 薄層鑒別

3.1 益智仁的薄層鑒別

取三方益子膏3 g（批號：20201001、20201002、20201003），加純水20 mL，用石油醚萃取2 次，每次40 mL，合并石油醚層，蒸干，殘渣用1 mL 甲醇溶解，作為供試品溶液。取益智仁對照藥材1 g 于具塞錐形瓶中，加入石油醚30 mL，超聲30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣用1 mL 甲醇溶解，即得對照藥材溶液。按處方比例稱取除益智仁外的10 味藥材，按制備工藝制備成膏滋，再同法制得缺益智仁陰性樣品溶液。照薄層色譜法試驗，各吸取供試品溶液和陰性樣品溶液15 μL，益智仁藥材溶液4 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（3∶1）為展開劑，飽和10 min，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱5 min，置日光燈下檢視。結(jié)果如圖1。

圖1 益智仁薄層色譜圖Fig 1 TLC of Alpiniae Oxyphyllae Fructus

3.2 補骨脂的薄層鑒別

取三方益子膏3 g（批號：20201001、20201002、20201003）于具塞錐形瓶中，加乙酸乙酯20 mL，超聲15 min（功率200 W，頻率40 kHz），濾過，濾液蒸干，殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為供試品溶液。取補骨脂對照藥材1 g 于具塞錐形瓶中，加20 mL 乙酸乙酯，超聲15 min（功率200 W，頻率40 kHz），濾過，濾液蒸干，殘渣加1 mL 乙酸乙酯使溶解，即得補骨脂對照藥材溶液。取補骨脂素對照品、異補骨脂素對照品，加乙酸乙酯制成每1 mL 各含2 mg 的混合溶液。稱取除補骨脂以外的10 味藥材，按制備工藝制備成膏滋，同法制得陰性樣品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液、陰性樣品溶液和補骨脂藥材溶液2 μL，對照品溶液1 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（4∶1）為展開劑，飽和10 min，展開，取出，晾干，噴以10%氫氧化鈉乙醇溶液，吹干，置紫外光燈下（365 nm）下檢視。結(jié)果如圖2。

圖2 補骨脂薄層色譜圖Fig 2 TLC of Psoraleae

3.3 烏藥薄層鑒別

取三方益子膏3 g（批號：20201001、20201002、20201003）于具塞錐形瓶中，加甲醇20 mL，超聲30 min（功率200 W，頻率40 kHz），濾過，濾液揮干，用10 mL 純水溶解，再用氯仿萃取3 次，每次20 mL，合并氯仿層，蒸干，殘渣加1 mL 甲醇溶解，作為供試品溶液。取烏藥對照藥材1 g 于具塞錐形瓶中，加甲醇20 mL，超聲30 min（功率200 W，頻率40 kHz），濾過，濾液揮干，用10 mL 純水溶解，再用氯仿萃取3 次，每次20 mL，合并氯仿層，蒸干，殘渣加1 mL 甲醇溶解，即得烏藥對照藥材溶液。稱取除烏藥以外的10 味藥材，按制備工藝制備成膏滋，同法制得陰性樣品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液和陰性樣品溶液各12 μL，烏藥藥材溶液3 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以苯-乙酸乙酯-甲酸（8∶1.5∶0.1）為展開劑，飽和10 min，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱5 min，置紫外光燈下（365 nm）下檢視。結(jié)果見圖3。

圖3 烏藥薄層色譜展開圖Fig 3 TLC of Lindera Radix

3.4 酒蓯蓉薄層鑒別

取三方益子膏3 g（批號：20201001、20201002、20201003）于具塞錐形瓶中，加25 mL 甲醇，超聲提取30 min（功率200 W，頻率40 kHz），過濾，濾液揮干，用25 mL 純水溶解，再用水飽和正丁醇溶液萃取3 次，每次25 mL，合并正丁醇層，用水洗滌2 次，每次40 mL，合并正丁醇層，蒸干，殘渣加2 mL 甲醇溶解，作為供試品溶液。取肉蓯蓉對照藥材1 g 于具塞錐形瓶中，加25 mL 甲醇，超聲提取30 min（功率200 W，頻率40 kHz），過濾，濾液揮干，用25 mL 純水溶解，再用水飽和正丁醇溶液萃取3 次，每次25 mL，合并正丁醇層，用水洗滌2 次，每次40 mL，合并正丁醇層，蒸干，殘渣加2 mL 甲醇溶解，作為對照藥材溶液。取毛蕊花糖苷對照品適量，加甲醇溶解并定容，制得毛蕊花糖苷質(zhì)量濃度為1.045 mg·mL的對照品溶液。稱取除肉蓯蓉以外的10 味藥材，按制備工藝制備成膏滋，同法制得陰性樣品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液和陰性樣品溶液各7 μL，肉蓯蓉藥材溶液2 μL，毛蕊花糖苷對照品液2 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以醋酸乙酯-甲醇-9%醋酸溶液（15∶3∶2）為展開劑，飽和10 min，展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鐵乙醇溶液，吹干，置日光下檢視。結(jié)果見圖4。

圖4 肉蓯蓉薄層色譜圖Fig 4 TLC of Cistanches Herba

3.5 炙甘草薄層鑒別

取三方益子膏3 g（批號：20201001、20201002、20201003）于具塞錐形瓶中，加甲醇30 mL，回流提取1 h，濾過，濾液蒸干，用40 mL 水溶解，用正丁醇提取3 次，每次20 mL，合并正丁醇層，用水洗滌2 次，每次40 mL，合并正丁醇層，蒸干，殘渣加5 mL 甲醇溶解，作為供試品溶液。取甘草對照藥材1 g 于具塞錐形瓶中，加甲醇30 mL，回流提取1 h，濾過，濾液蒸干，用40 mL 水溶解，用正丁醇提取3 次，每次20 mL，合并正丁醇層，用水洗滌2 次，每次40 mL，合并正丁醇層，蒸干，殘渣加5 mL 甲醇溶解，作為對照藥材溶液。稱取除甘草以外的10 味藥材，按制備工藝制備成膏滋，同法制得陰性樣品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液和陰性樣品溶液各13 μL，甘草對照藥材溶液2 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（18∶7∶1）為展開劑，飽和10 min，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱5 min，置日光下檢視。結(jié)果見圖5。

圖5 炙甘草薄層色譜圖Fig 5 TLC of Grilled Glycyrrhiza

4 三方益子膏中有效成分含量的測定

4.1 色譜條件

采用Agilent 5 TC-C（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；流動相為乙腈（B）-0.1%磷酸水溶液（A），梯度洗脫（0 ～5 min，5%B；5 ～12 min，7%B；12 ～26 min，15%B；26 ～35 min，40%B；35 ～45 min，50%B；45 ～60 min，85%B）；切換波長檢測（0 ～15 min，260 nm；15 ～30 min，330 nm；30 ～60 min，252 nm）；柱溫35℃；流速1.0 mL·min；進樣量10 μL。

4.2 供試品溶液的制備

稱取三方益子膏（批號：20201002）3 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲30 min（功率200 W，頻率40 kHz），放冷至室溫，再次稱重，用甲醇補足減失的重量，即得供試品溶液。

4.3 對照品溶液的制備

精密稱取5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、松果菊苷、補骨脂素、異補骨脂素和甘草酸對照品各適量，加甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度分別為0.263、0.017、0.098、0.038、0.049、0.078 mg·mL的混合對照品溶液。

4.4 陰性樣品溶液的制備

按處方比例稱取相應藥材，按制備工藝制成膏滋。稱取各膏滋適量，按“4.2”項下方法制備陰性樣品溶液A（缺鹽益智、黃精、枸杞子、桑葚、酒蓯蓉、炙甘草），陰性樣品溶液B（缺鹽益智、金櫻子、桑葚、枸杞子），陰性樣品溶液C（缺補骨脂），陰性樣品溶液D（缺肉蓯蓉）及陰性樣品溶液E（缺甘草）。

4.5 方法學考察

4.5.1 專屬性考察 分別取混合對照品溶液、樣品溶液、陰性樣品溶液進樣分析，結(jié)果樣品中色譜峰保留時間與對照品相應的色譜峰保留時間一致，各峰分離度、對稱性較好，各陰性樣品對測定無影響，理論塔板數(shù)以原兒茶酸計不低于10 000，色譜圖見圖6。

圖6 三方益子膏專屬性試驗HPLC 圖譜Fig 6 HPLC chromatogram of specificity test for SanfangYizi ointment

4.5.2 線性關系考察 取“4.3”項下混合對照品溶液，稀釋成系列濃度混合對照品溶液，進樣測定，記錄峰面積，以峰面積（

Y

）為縱坐標，進樣量（

X

，μg）為橫坐標進行線性回歸，求得各成分的回歸方程，5-羥甲基糠醛：

Y

＝2832.16

X

＋43.45，

r

＝0.9999；原兒茶酸：

Y

＝3129.93

X

＋3.78，

r

＝0.9999；松果菊苷：

Y

＝1196.98

X

＋5.68，

r

＝0.9999；補骨脂素：

Y

＝5847.81

X

＋11.45，

r

＝0.9999；異補骨脂素：

Y

＝5404.57

X

＋18.96，

r

＝0.9999；甘草酸：

Y

＝804.76

X

＋2.79，

r

＝0.9999；5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、松果菊苷、補骨脂素、異補骨脂素、甘草酸分別在0.526 ～2.63 μg、0.034 ～0.17 μg、0.196 ～0.98 μg、0.076 ～0.38 μg、0.098 ～0.49 μg、0.156 ～0.78 μg 與峰面積線性關系良好。4.5.3 精密度試驗 取“4.3”項下混合對照品溶液連續(xù)進樣6 次，記錄相應的峰面積。結(jié)果5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、松果菊苷、補骨脂素、異補骨脂素、甘草酸峰面積的

RSD

分別為0.10%、0.13%、0.080%、0.080%、0.090%、0.060%， 顯示儀器精密度良好。4.5.4 重復性試驗 準確稱取三方益子膏（批號：20201002）6 份，各3 g，精密稱定，按“4.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，結(jié)果5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、松果菊苷、補骨脂素、異補骨脂素、甘草酸的平均含量分別為2.121、0.167、0.843、0.295、0.432、0.658 mg·g，

RSD

分別為0.50%、1.1%、0.57%、0.38%、0.48%、0.37%，表明該方法的重復性良好。4.5.5 穩(wěn)定性試驗 按照“4.2”項下方法制備三方益子膏（批號：20201002）供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 進樣測定，結(jié)果5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、松果菊苷、補骨脂素、異補骨脂素、甘草酸含量的

RSD

分別為1.0%、0.84%、1.4%、0.77%、0.76%、0.96%，表明供試品溶液24 h 內(nèi)穩(wěn)定。4.5.6 加樣回收試驗 稱取三方益子膏（批號：20201002）1.5 g，共6 份，分別加入適量的5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、松果菊苷、補骨脂素、異補骨脂素、甘草酸對照品，制備成供試品溶液進樣測定，結(jié)果5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、松果菊苷、補骨脂素、異補骨脂素、甘草酸的平均加樣回收率為101.75%、97.54%、101.90%、97.82%、96.56%、99.11%，

RSD

分別為1.2%、2.4%、1.9%、1.6%、1.0%、1.8%。

4.6 樣品含量測定

取S1 ～S10 樣品各3 g，按“4.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，結(jié)果見表1。10 批三方益子膏中5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、松果菊苷、補骨脂素、異補骨脂素、甘草酸的平均含量分別為0.863、0.187、2.323、0.145、0.185、0.631 mg·g。按照制劑含量測定范圍不得低于80%計算，10 批三方益子膏中5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、松果菊苷、補骨脂素、異補骨脂素、甘草酸的含量分別不得低于0.690、0.149、1.858、0.116、0.147 和0.504 mg·g。

表1 10 批樣品的含量測定結(jié)果(mg·g)
Tab 1 Content determination of 10 batches of samples (mg·g)

樣品5-羥甲基糠醛原兒茶酸松果菊苷補骨脂素異補骨脂素甘草酸S11.004 0.171 2.178 0.139 0.185 0.606 S20.802 0.171 2.215 0.137 0.180 0.544 S30.904 0.212 2.501 0.150 0.194 0.681 S40.808 0.213 2.292 0.135 0.162 0.671 S50.883 0.184 2.265 0.153 0.184 0.641 S60.791 0.204 2.557 0.154 0.182 0.675 S70.898 0.189 2.348 0.159 0.198 0.611 S80.853 0.190 2.049 0.147 0.187 0.589 S90.802 0.158 2.454 0.147 0.197 0.639 S100.889 0.176 2.374 0.134 0.180 0.653平均值0.863 0.187 2.323 0.145 0.185 0.631

5 討論

本研究建立了三方益子膏的薄層鑒別方法，在鹽益智、鹽補骨脂、烏藥、酒蓯蓉、炙甘草薄層鑒別的過程中，分別考察了濕度、溫度、不同展開劑以及不同薄層板對樣品展開的影響，發(fā)現(xiàn)環(huán)己烷-乙酸乙酯（3∶1）、正己烷-乙酸乙酯（4∶1）、苯-乙酸乙酯-甲酸（8∶1.5∶0.1）、醋酸乙酯-甲醇-9%醋酸溶液（15∶3∶2）、三氯甲烷-甲醇-水（18∶7∶1）作為鹽益智、鹽補骨脂、烏藥、酒蓯蓉、炙甘草的鑒別展開劑，斑點均明亮清晰、分離效果均較好，并且無拖尾現(xiàn)象。在含量測定方法中，分別考察了甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液4 種流動相，結(jié)果在以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相時的峰形與分離度均良好。

本研究對三方益子膏中鹽益智、鹽補骨脂、烏藥、酒蓯蓉、炙甘草5 味藥材進行薄層色譜法系統(tǒng)研究，覆蓋處方的君臣佐使藥，建立了合理、有效的三方益子膏主要成分的薄層鑒別方法；所建立的HPLC 方法，靈敏度高，準確性好，可作為三方益子膏的定量分析方法，為三方益子膏的質(zhì)量標準的建立提供依據(jù)。