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        基于LTB4/BLTR通路探討黃芩苷-梔子苷配伍對局灶性腦缺血大鼠再灌注損傷的影響

        2022-09-13 08:23:36周爽李慧敏張行行史永恒王川王國全李敏王斌陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西咸陽712046
        中南藥學(xué) 2022年6期
        關(guān)鍵詞:腦損傷腦缺血腦組織

        周爽,李慧敏,張行行,史永恒,王川,王國全,李敏,王斌(陜西中醫(yī)藥大學(xué),陜西 咸陽 712046)

        腦缺血損傷可觸發(fā)一系列的有害事件,包括谷氨酸相關(guān)的興奮性毒性、炎癥、氧化應(yīng)激和細胞凋亡。近年來,越來越多的研究關(guān)注炎癥在腦缺血發(fā)病中的作用。缺血性病變中分泌的炎癥介質(zhì),包括細胞因子、前列腺素、自由基和趨化因子,可以招募其他免疫細胞,參與已經(jīng)過度激活的炎癥反應(yīng),導(dǎo)致腦細胞進一步損傷。因此,調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)通路,減少炎癥因子的釋放,對改善腦損傷具有重要意義。白三烯B4(leukotriene B4,LTB4)是不飽和脂肪酸通過5-脂氧合酶(5-lipoxygenase,5-LOX)途徑中重要的下游代謝產(chǎn)物,與細胞膜上的白三烯受體(leukotriene B4 reportor,BLTR)結(jié)合。BLTR即BLT1 和BLT2,參與并增強炎癥反應(yīng)。越來越多的證據(jù)表明,血漿中LTB4 水平可以作為急性腦卒中患者臨床預(yù)后不良的生物標(biāo)志,但LTB4 在腦損傷中的作用機制尚不明確。

        黃芩苷(BC)、梔子苷(GP)是中藥黃芩和梔子的主要活性成分。依據(jù)中醫(yī)基礎(chǔ)理論“清熱解毒”的現(xiàn)代化研究,課題組的前期實驗研究發(fā)現(xiàn),BC/GP(最佳配伍比例7∶3)聯(lián)合應(yīng)用可減輕腦缺血大鼠缺血區(qū)的炎性損傷和組織水腫,可緩解腦缺血損傷后的炎癥反應(yīng),并通過下調(diào)5-LOX 起到腦保護的作用。有研究指出,抑制5-LOX 的凈效應(yīng)可能掩蓋了LTB4 的作用,如影響中性粒細胞浸潤和細胞因子等作用。為進一步探討B(tài)C/GP 是否調(diào)控LTB4 發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用機制,本實驗建立腦缺血大鼠再灌注模型,探討LTB4 通路在腦缺血再灌注中的作用機制,及BC/GP 是否可以有效調(diào)控LTB4/BLTR 通路降低腦損傷,為進一步研究缺血性腦卒中的診斷和臨床治療提供依據(jù)。

        1 材料

        1.1 儀器

        大鼠LTB4-ELISA 試劑盒(深圳欣博盛科技有限公司,批號20160712);ElX800 酶標(biāo)儀(Bio-TEK 公司);miniprotean3cell 電泳儀(Bio-R-AD 公司);Milli-Q 純水機(Millipore 公司);5430R 型冷凍離心機(Eppendorf 公司)。

        1.2 試藥

        黃芩苷、梔子苷(北京索萊寶生物公司,含量≥98%,批號:20201007);白三烯B4 受體阻斷劑LY255283(abcam,HY-15744);BLT1抗體(abcam,ab95492);BLT2 抗體(abcam,ab115453);腫瘤壞死因子-

        α

        (TNF-

        α

        )、髓過氧化物酶(MPO)、白介素-1

        β

        (IL-1

        β

        )、白三烯B4(LTB4)ELISA 檢測試劑盒(武漢博士德)。

        1.3 動物

        SPF 級SD 雄性大鼠120 只,體質(zhì)量180 ~220 g[許可證號SCXK(川)2020-030,成都達碩實驗動物有限公司,于陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理實驗室飼養(yǎng)]。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周,自由飲食飲水。

        2 方法

        2.1 藥品制備

        根據(jù)給藥劑量不同,稱取一定量黃芩苷、梔子苷藥物粉末,共同溶劑于適量純凈水中,超聲10 min,至4℃冰箱保存,藥液使用前振搖混勻。取LY255283 粉末10 mg 溶解于DMSO 中,定容至10 mL 備用。

        2.2 分組及造模

        將SD 雄性大鼠隨機分為7 組,每組15 只,分別為假手術(shù)組(sham),模型組(model),白三烯B4 受體抑制劑組(LY255283,1 mg·kg),黃芩苷-梔子苷7∶3 配伍組低、高劑量組(BC/GP 組,45 mg·kg、60 mg·kg)和BC/GP 聯(lián)合抑制劑組(BC/GP45 +LY255283、BC/GP60 +LY255283)。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,除假手術(shù)組外,其余組采用線栓法制備大腦中動脈栓塞(MCAO)模型。大鼠經(jīng)麻醉后,仰臥位固定于手術(shù)板上,頸部去毛,消毒,縱向切開頸部正中皮膚,逐層鈍性分離頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈,結(jié)扎頸外動脈,在頸總動脈上距離頸內(nèi)動脈交叉 5 mm處造口,插入線栓,至有微弱阻力時停止,扎緊線栓以防止滑落,縫合傷口,缺血后2 h 拔栓,恢復(fù)血流供應(yīng);假手術(shù)組相同處理但不進行結(jié)扎、造口和插栓操作。各組術(shù)后于(23±2)℃條件下喂養(yǎng),正常飲食進水。

        2.3 給藥

        大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后,按照BC/GP 45 mg·kg和60 mg·kg(1 mL/100 g)灌胃給藥,連續(xù)7 d,每日一次。LY255283 組、BC/GP45 +LY255283 組、BC/GP60 +LY255283 組在手術(shù)造模前30 min 腹腔注射LY255283(1 mg·kg),假手術(shù)組和模型組注射等體積的生理鹽水。

        2.4 神經(jīng)功能評價

        大鼠稱重后,用10%水合氯醛(0.3 mg·kg)腹腔注射麻醉,通過改良Longa 線栓法來建立大腦中動脈局灶性梗死MCAO 模型(右側(cè))。缺血2 h 后松開動脈夾再灌注24 h。神經(jīng)功能學(xué)評分參考Zea-Longa 5 分制評分標(biāo)準(zhǔn),所有大鼠均在模型成功后觀察大鼠行為。評分標(biāo)準(zhǔn)為0 分:無神經(jīng)功能缺陷征;1 分:一側(cè)前肢部分屈曲;2 分:一側(cè)前肢完全屈曲;3 分:向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈;4 分:向偏癱側(cè)傾倒;5 分:不能自發(fā)行走,意識喪失。大鼠手術(shù)蘇醒后,進行Zea-Longa 評分,評分1 ~4 分則納入實驗。拔出線栓,再灌注24 h 觀察并記錄神經(jīng)功能缺損癥狀,進行神經(jīng)嚴(yán)重程度評分(mNSS)。

        2.5 大鼠腦組織切片HE 染色

        腦組織4%多聚甲醛固定腦組織,梯度濃度乙醇脫水,二甲苯脫醇;浸蠟包埋;切片,厚度5 μm;再以二甲苯、乙醇脫蠟;蘇木素浸泡20 min,酸水分化;純凈水浸泡20 min;0.5%伊紅染色2 min,沖洗;梯度乙醇脫水,樹脂封片。在病理顯微鏡下拍照。

        2.6 酶聯(lián)免疫法檢測相關(guān)因子在腦組織含量

        采用ELISA 試劑盒檢測腦梗死皮層的大鼠腦組織白三烯A4 水解酶(LTA4H)、LTB4、MPO 和炎性因子的含量。24 h 取材,將腦組織置于液氮后,研磨后取上清液,嚴(yán)格按照試劑盒操作測定。

        2.7 Real-time PCR 檢測BLTR 在腦組織中的含量

        取勻漿管,加入1 mL 的RNA 提取液,置冰上預(yù)冷。取100 mg 組織,加入到勻漿管中。勻漿儀充分研磨直至無可見組織塊。樣本前處理之后,12 000 r·min離心10 min 取上清液。加入250 μL 三氯甲烷,顛倒離心管15 s,充分混勻,靜置3 min,4℃、12 000 r·min,離心10 min,將400 μL 上清液轉(zhuǎn)移到一新的離心管中。加入0.8 倍體積的異丙醇,顛倒混勻。-20℃放置15 min。4℃、12 000 r·min離心10 min,管底的白色沉淀即為RNA。溶解RNA 將離心管置于超凈臺上吹3 min,加入15 μL 無RNA 酶的水溶解RNA,55 ℃ 孵育5 min。檢測RNA 濃度。進行反轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)體系:5×Reaction Buffer 4 μL、dT引物(100 μmol·L)0.5 μL、dNTP 混合物(100 μmol·L)0.5 μL、反轉(zhuǎn)錄酶1 μL、總 RNA 10 μL、DEPC 處理水添加20 μL。取0.2 mL PCR 管,配制如下反應(yīng)體系:2×qPCR Mix、7.5 μL 2.5 μmol·L基因引物 1.5 μL、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2.0 μL、ddHO 4.0 μL,每個反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3 管。定量PCR 擴增反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性10 min,95℃、15 s,60 ℃、30 s,熔解曲線 60 ~95℃,每升溫0.5℃采集一次熒光信號(循環(huán)40 次)。以GAPDH 為內(nèi)參,采用2法計算mRNA 相對表達量。引物序列見表1。

        表1 引物序列
        Tab 1 Primer sequence

        基因名稱F(5'→3')R(5'→3')LTA4HGGAGAAAGCCAGGGTTACAAAGTGCTTTCCTGAAGTCTGCTCG BLT1TTTCCTACACTTTCTGGCTCGGTTCTTGGGTGTTACTGTGCGGT BLT2GAGACCCTGACTGCCTTCGTCGCCTGTAGGAGATTGACCG GAPDHCTGGAGAAACCTGCCAAGTATGGGTGGAAGAATGGGAGTTGCT

        2.8 統(tǒng)計分析

        所有統(tǒng)計分析均使用Graphpad Prism 5 軟件進行。實驗數(shù)據(jù)以

        x

        ±

        s

        表示。同一時間點的比較采用獨立樣本

        t

        檢驗。多組之間比較采用單因素方差分析,兩組間資料比較采用LSD 檢驗。

        P

        <0.01 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

        3 結(jié)果

        3.1 BC/GP 對腦缺血大鼠再灌注神經(jīng)功能損傷的影響

        如圖1 所示,與假手術(shù)組比,手術(shù)造模后大鼠神經(jīng)功能損傷嚴(yán)重,麻醉蘇醒后出現(xiàn)在水平地面上向輕癱側(cè)傾倒行為,再灌注24 h 后向輕癱側(cè)轉(zhuǎn)圈,提尾表現(xiàn)為前肢屈曲,頭部在30 s 內(nèi)偏離垂直軸>10°或出現(xiàn)癲癇、肌陣攣、肌張力障礙等行為,平衡木測試中出現(xiàn)試圖在平衡木上平衡但跌落(>20 s)的現(xiàn)象。與模型組相比,LY255283 組神經(jīng)功能評分無明顯差異。BC/GP組大鼠行為表現(xiàn)相似,各項評分較模型組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

        P

        <0.01),BC/GP 聯(lián)合抑制劑組的神經(jīng)損傷顯著降低(

        P

        <0.01,

        P

        <0.001)。假手術(shù)組無神經(jīng)功能障礙的表現(xiàn)。結(jié)果表明BC/GP可以降低神經(jīng)功能損傷。

        圖1 各組腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能評分結(jié)果(n =15)Fig 1 Neurological function score of rats with cerebral ischemiareperfusion in each group(n =15)

        3.2 BC/GP 調(diào)控LTB4 通路對大鼠腦組織病理形態(tài)的影響

        HE 染色結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比,腦缺血再灌注后腦組織大范圍損傷,損傷處組織腫脹變大,著色明顯變淡;皮層和紋狀體區(qū)神經(jīng)元大量壞死,神經(jīng)元數(shù)量減少,多見胞核固縮或消失,可見散在的炎性細胞浸潤;神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)松散,紋狀體神經(jīng)纖維團結(jié)構(gòu)模糊等現(xiàn)象。部分神經(jīng)元胞體和胞核腫脹,核質(zhì)疏松,神經(jīng)纖維水腫,結(jié)構(gòu)松散,纖維團破裂,有的結(jié)構(gòu)模糊不清;局部紋狀體下方明顯壞死,結(jié)構(gòu)疏松;紋狀體神經(jīng)纖維團結(jié)構(gòu)模糊,有的甚至液化,結(jié)構(gòu)疏松。與模型組相比,LY255283 組病理形態(tài)得到改善,BC/GP 組紋狀體結(jié)構(gòu)松散減輕,神經(jīng)壞死現(xiàn)象明顯改善。BC/GP 聯(lián)合抑制劑組的神經(jīng)壞死現(xiàn)象也有改善。假手術(shù)組的腦組織各結(jié)構(gòu)清晰,著色均勻,未見明顯梗死灶。結(jié)果表明抑制LTB4 受體的表達改善病理形態(tài)的效果并不明顯,BC/GP 可以有效改善腦組織病理形態(tài)(見圖2)。

        圖2 各組大鼠缺血側(cè)腦組織皮質(zhì)部分形態(tài)學(xué)觀察(HE,×20)Fig 2 Morphological of cerebral cortex on ischemic side of rats in each group(HE,×20)

        3.3 BC/GP 對腦缺血大鼠再灌注后腦組織中LTA4H、LTB4 和血清中LTB4 的影響

        與假手術(shù)組相比,腦缺血再灌注后腦組織中LTA4H、LTB4 和血清中LTB4 的表達顯著增加(

        P

        <0.01);與模型組相比,LY255283組LTA4H 和LTB4 的表達顯著降低(

        P

        <0.05,

        P

        <0.01),BC/GP 組 LTB4 和LTA4H 的表達顯著降低(

        P

        <0.01)。并且BC/GP(60 mg·kg組)可以降低血清中 LTB4 的表達(

        P

        <0.05)。結(jié)果表明,BC/GP 配伍可以顯著降低LTB4 的表達,提示BC/GP 可能可以通過抑制LTB4 在腦缺血后發(fā)揮作用(見圖3)。

        圖3 腦缺血再灌注后LTB4 的測定結(jié)果(n =3)Fig 3 LTB4 and MPO after the cerebral ischemia-reperfusion(n =3)

        3.4 BC/GP 對腦缺血大鼠再灌注后腦組織中MPO的影響

        MPO 是中性粒細胞的陽性標(biāo)記物。如圖4所示,與假手術(shù)組相比,腦缺血再灌注后腦組織中MPO 的表達顯著增加(

        P

        <0.01);與模型組相比,LY255283 組的MPO 表達顯著降低(

        P

        <0.01),給予BC/GP 顯著降低MPO 的表達(

        P

        <0.05,

        P

        <0.01)。結(jié)果表明,BC/GP 可以降低腦損傷后MPO 的表達和中性粒細胞浸潤。

        圖4 腦缺血再灌注后MPO 的測定結(jié)果(n =3)Fig 4 Expression of MPO after the cerebral ischemia-reperfusion(n=3)

        3.5 BC/GP 對腦缺血大鼠再灌注后腦組織中BLT1 和BLT2 mRNA 的影響

        RCR 結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比,腦缺血再灌注后BLT1 和BLT2 的mRNA 顯著升高(

        P

        <0.01);與模型組相比,LY255283 顯著抑制BLT1 和BLT2 mRNA 的表達(

        P

        <0.01),BC/GP顯著降低BLT1 和BLT2 mRNA 的表達(

        P

        <0.01),BC/GP 聯(lián)合LY255283 顯著抑制BLT1 用和BLT2 mRNA 的表達(

        P

        <0.01)。結(jié)果表明BC/GP 可以抑制LTB4 與BLT1 和BLT2 受體結(jié)合而發(fā)揮作用(見圖5)。

        圖5 各組BLT1 和BLT2 mRNA 的測定結(jié)果(n =3)Fig 5 BLT1 and BLT2 mRNA in each group(n =3)

        3.6 BC/GP 調(diào)控LTB4 通路對腦缺血大鼠再灌注后腦組織中炎性因子的影響

        如圖6 所示,與假手術(shù)組相比,腦缺血大鼠再灌注24 h 后大鼠腦組織中促炎因子TNF-

        α

        和炎性因子IL-1

        β

        表達顯著增加(

        P

        <0.01);與模型組相比,LY255283 組TNF-

        α

        的表達顯著降低(

        P

        <0.01)。 給予BC/GP 以及BC/GP 聯(lián)合LY255283 可以顯著降低TNF-

        α

        和IL-1

        β

        表達(

        P

        <0.01)。結(jié)果表明,抑制LTB4/BLTR 表達來影響炎性因子的釋放,下調(diào)LTB4 通路的表達會降低腦缺血后炎性因子的表達。BC/GP(7∶3)配伍可以降低炎性因子和改善腦損傷,其抗炎作用可能與下調(diào)LTB4/BLTR 通路有關(guān)。

        圖6 各組炎性因子TNF-α 和IL-1β 的測定結(jié)果(n =3)Fig 6 TNF-α and IL-1β inflammatory factor in each group(n =3)

        4 討論

        腦缺血后缺血損傷區(qū)存在多種細胞因子表達、炎性細胞浸潤和氧自由基反應(yīng),可加速缺血后細胞損傷。缺血再灌注損傷是缺血性腦卒中進展過程中最重要的部分,能量代謝異常,離子代謝紊亂、自由基損傷、炎癥反應(yīng)等都參與了缺血再灌注損傷的復(fù)雜病理機制。炎癥反應(yīng)在腦缺血損傷發(fā)生后被激活,導(dǎo)致神經(jīng)細胞凋亡、死亡和組織損傷。LTB4 主要在巨噬細胞、中性粒細胞和肥大細胞中表達,與細胞表面G 蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合,即LTB4 的受體(BLTR),產(chǎn)生多種細胞內(nèi)信號。LTB4 能激活粒細胞,生成超氧陰離子,對白細胞具有強效的活化作用,刺激白細胞趨化、聚集、釋放氧自由基和溶酶體酶,使血管通透性增加,血管壁收縮,這些生理特性被認為加重了缺血引起的細胞損傷。近年來不斷有研究發(fā)現(xiàn),在大鼠腦缺血中心區(qū)中,神經(jīng)元和小膠質(zhì)細胞BLT4 合成增加。在腦缺血模型前頸動脈注射LTB4 可增加梗死組織的體積,皮瓣抑制劑BAY-X1005 和BLT 拮抗劑LY255283可減少梗死體積。上述結(jié)果證明LTB4 在腦缺血中的產(chǎn)生是有害的,可使組織梗死程度惡化。本研究檢測了LTB4 在急性大鼠腦卒中模型中的水平及其機制,結(jié)果證實了在腦缺血再灌注損傷后LTB4 表達顯著增加。

        目前已知BLTR 有兩種亞型,即BLT1 和BLT2。LTB4 通過BLT1 引起炎癥趨化因子和細胞因子的釋放,BLT1 參與了許多炎癥性疾病,如中性粒細胞在病變部位積聚。有報道稱,BLT2激活導(dǎo)致活性氧(ROS)升高,隨后激活NF-

        κ

        B。LY255283 是一種非選擇性拮抗劑,可同時抑制BLT1(非競爭性)和BLT2(競爭性)介導(dǎo)的Ca動員。因此,所觀察到的LY255283 的保護作用可能涉及其中一種或兩種亞型。有研究表明,5-LOX 炎癥途徑在許多疾病中均被激活,引起炎癥反應(yīng),BLT1 和BLT2 是主要的促炎介質(zhì)。5-LOX 的抑制劑也具有腦保護作用,BLT1 拮抗作用在于不干擾除LTB4 外的脂質(zhì)代謝物,相比于5-LOX 可作為更有優(yōu)勢的治療靶點,因此,抗炎和神經(jīng)保護作用的凈效應(yīng)應(yīng)該比在5-LOX 抑制的情況下更為顯著。并且與BLTR 拮抗劑相比,5-LOX 抑制劑選擇性較低,消耗多種產(chǎn)物,其中包括對缺血損傷有益的產(chǎn)物(如脂素A4 是5-LOX 的抗炎產(chǎn)物,可以抑制白三烯合成,對腦缺血具有神經(jīng)保護作用),因此,BLTR 拮抗劑應(yīng)該是比5-LOX 抑制劑更好的選擇。當(dāng)缺血性腦損傷發(fā)生時,激活免疫反應(yīng),進而誘發(fā)一系列級聯(lián)反應(yīng)如炎癥反應(yīng)中TNF-

        α

        和IL-1

        β

        等的表達,加劇腦損傷。中性粒細胞浸潤被認為是缺血再灌注損傷主要的潛在的機制之一。MPO 是中性粒細胞的陽性標(biāo)記物,本實驗結(jié)果表明,在急性腦缺血腦損傷中,LTB4、MPO 和炎性因子的表達顯著增加,LY255283 可降低腦損傷組織中IL-1

        β

        和TNF-

        α

        表達,表明其可阻斷LTB4 通路有效抑制炎性因子的產(chǎn)生,從而減輕炎性損傷。LY255283 還可降低MPO 的表達和中性粒細胞浸潤,改善腦缺血再灌注的損傷。腦損傷后LTB4 表達顯著增加,LTA4H 是合成LTB4 的關(guān)鍵酶。BC/GP 可以顯著抑制LTA4H/LTB4/BLTR 的表達,減輕神經(jīng)功能缺陷,降低白細胞浸潤,改善腦組織的病理形態(tài)變化。BC/GP可以減輕神經(jīng)功能損傷,顯著降低急性腦缺血時期的炎性因子表達,降低中性粒細胞浸潤。說明BC/GP 可以通過抑制LTB4 通路起到腦保護的作用。此外,實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)BC/GP(7∶3)配伍聯(lián)合LY255283 對LTB4/BLTR 通路的抑制作用顯著增強,推測BC/GP 可能通過多種途徑抑制了LTB4/BLTR 通路。

        綜合以上結(jié)果,BLTR 抑制劑可以起到抗炎和神經(jīng)保護的作用,BC/GP 可以通過下調(diào)LTB4/BLTR 通路在腦缺血再灌注損傷中起到腦保護作用。后續(xù)將建立體外細胞模型研究LTB4/BLTR在腦缺血再灌注損傷中的作用機制,并且進一步闡述黃芩苷-梔子苷配伍對腦缺血損傷的保護作用機制。

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