詹原泉 叢龍玲 呂永慧 黃雅靜 謝英杰 周婉妃 吳宇金

(1 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院脾胃科，廣州，510130；2 廣東省人民醫(yī)院，廣州，510000；3 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州，510405)

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis，UC)屬于一種炎癥性腸病，是病因尚不明確的結(jié)直腸慢性非特異性炎癥性疾病[1]。UC復(fù)發(fā)率高且預(yù)后差，有效治療UC給臨床帶來了極大的挑戰(zhàn)。近年來，遺傳學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科迅速發(fā)展，尤其是關(guān)于細(xì)胞因子、黏附因子、核因子κB及Toll樣受體等的研究，為揭示UC的發(fā)病機(jī)制提供了大量有價(jià)值且可靠的線索，并已成為開發(fā)新治療藥物的強(qiáng)有力的理論依據(jù)。但是，目前對(duì)UC的發(fā)病機(jī)制還沒有完全清楚。本研究采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法，觀察腸炎清對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的保護(hù)作用并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行研究，以期為腸炎清的臨床推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 購(gòu)入南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級(jí)SD大鼠，雌性，6～8周齡，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2015-0001，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(粵)2015-0150，倫理審批號(hào)：STUDY111。大鼠給予標(biāo)準(zhǔn)鼠維持飼料，自由飲用純凈水，每日換水，動(dòng)物墊料采用白楊木片，購(gòu)自廣州市賽柏諾生物科技有限公司。飼養(yǎng)環(huán)境室溫20～26 ℃，濕度40%～70%，12 h明暗交替。動(dòng)物入室實(shí)驗(yàn)前先檢疫適應(yīng)環(huán)境5～7 d，選擇健康動(dòng)物作為受試動(dòng)物。

1.1.2 藥物 腸炎清(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，批號(hào)：粵藥制字Z06022718)，150 mL/袋；美沙拉嗪緩釋顆粒(艾迪莎)(上海愛的發(fā)制藥有限公司，批號(hào)：161118)，0.5 g/袋。

1.1.3 試劑與儀器 模型誘導(dǎo)劑2,4,6三硝基苯磺酸(2,4,6-Trinitrobenzene Sulfonic Acid,TNBS)(Sigma公司，美國(guó)，批號(hào)：SLBT1675)；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(Smad2/3)(Cell signaling公司，美國(guó)，貨號(hào)：5678S)；磷酸化胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(p-Extracellular Rignal-regulated Kinase，ERK)(Cell signaling公司，美國(guó)，貨號(hào)：8544S)；胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(erk)(Cell signaling公司，美國(guó)，貨號(hào)：4370T)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Transforming Growth Factor,TGF-β1)(abcam公司，英國(guó)，貨號(hào)：ab92486)；脫水機(jī)(武漢俊杰電子有限公司，型號(hào)：JJ-12J)；包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司，型號(hào)：JB-P5)；凍臺(tái)(武漢俊杰電子有限公司，型號(hào)：JB-L5)；病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司產(chǎn)品，型號(hào)：RM2016)；組織攤片機(jī)(金華市科迪儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)：KD-P)；烤箱(萊玻瑞儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)：GFL-230)；正置光學(xué)顯微鏡(日本尼康公司，型號(hào)：Nikon Eclipse E100)；成像系統(tǒng)(日本尼康公司，型號(hào)：NIKON DS-U3)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 按照體質(zhì)量將25只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(溶媒對(duì)照組)、模型組、美沙拉嗪組(陽性藥物組)、腸炎清低劑量組和腸炎清高劑量組，每組5只。除空白對(duì)照組外，其余大鼠均采用TNBS誘導(dǎo)建立UC模型；造模當(dāng)日以50 mg/kg TNBS乙醇溶液灌腸。

1.2.2 給藥方法 造模24 h后，模型組、空白對(duì)照組大鼠分別以0.9%生理鹽水灌胃；美沙拉嗪組以30 mg/kg艾迪莎混懸液灌胃；腸炎清高劑量組以147.2 g/kg腸炎清灌胃；腸炎清低劑量組以36.8 g/kg腸炎清灌胃；1次/d，時(shí)間固定，持續(xù)7 d。藥物(生理鹽水)干預(yù)結(jié)束后，所有動(dòng)物采用戊巴比妥鈉(120 mg/kg)腹腔注射麻醉后，對(duì)動(dòng)物實(shí)施安樂死后進(jìn)行組織取材，采集結(jié)直腸即肛門到盲腸下端段，長(zhǎng)度約12 cm。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 1)觀察各組大鼠從給藥第1天至第8天的一般形態(tài)、體質(zhì)量的變化；2)觀察各組大鼠給藥后第8天的大體解剖；3)觀察大鼠腸道組織病理變化：取大鼠腸道組織，石蠟包埋固定，分別進(jìn)行蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin，HE)染色及免疫組織化學(xué)染色；對(duì)HE染色及免疫組織化學(xué)染色切片進(jìn)行顯微圖像采集分析，觀察大鼠組織病理情況。4)采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)大鼠結(jié)腸黏膜組織中TGF-β1、Smad3水平、ERK磷酸化的水平及TGF-β1信號(hào)通路活化的程度。以含蛋白酶抑制劑的裂解液提取大鼠組織總蛋白，布拉德福德(Bradford)法蛋白定量；90 mA恒流十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecylsulfate，SDS)電泳，90 V恒壓轉(zhuǎn)膜120 min，將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，麗春紅染色，根據(jù)Marker條帶位置和目的蛋白大小剪膜；含5%脫脂奶粉和TBST封閉液常溫封閉膜1 h；4 ℃孵育1抗過夜，TBST洗膜10 min 3次，常溫孵育2抗1 h；TBST洗膜10 min 3次，ECL法發(fā)光，圖像掃描分析；檢測(cè)大鼠結(jié)腸黏膜組織中TGF-β1、Smad3、ERK磷酸化的水平。5)以逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)組織細(xì)胞中ERK1/2 mRNA的表達(dá)：提取大鼠中細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用寡脫氧胸腺苷酸(Oligodeoxythymidylic Acid，Oligo)或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得ERK1/2 mRNA的表達(dá)。聚合酶鏈反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，72 ℃，30 s，45個(gè)循環(huán)。溶解曲線：65 ℃ 30 s。每個(gè)樣本各重復(fù)3次，擴(kuò)增結(jié)束，記錄Ct值，按照2-△△Ct法對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。測(cè)定ERK表達(dá)水平基因引物序列見表1。

表1 測(cè)定ERK表達(dá)水平基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 各組動(dòng)物一般狀態(tài)觀察 造模給藥期，空白對(duì)照組未見明顯異常；模型組、美沙拉嗪組、腸炎清低劑量組和高劑量組造模后，所有動(dòng)物均出現(xiàn)稀便，部分動(dòng)物出現(xiàn)肛門周血跡。開始給藥后，模型組部分動(dòng)物出現(xiàn)嚴(yán)重腸道反應(yīng)、明顯消瘦，部分動(dòng)物腸道反應(yīng)減輕，有自愈跡象。腸炎清低劑量組和模型組類似，但后期腸道反應(yīng)緩解。美沙拉嗪組和腸炎清高劑量組動(dòng)物腸道反應(yīng)明顯緩解，僅腸炎清高劑量組個(gè)別動(dòng)物出現(xiàn)腸道梗阻，可能與前期炎癥反應(yīng)導(dǎo)致腸道糞便阻塞所致。但緩解率明顯優(yōu)于腸炎清低劑量組。

2.2 各組動(dòng)物體質(zhì)量比較 造模后空白對(duì)照組動(dòng)物體質(zhì)量呈正常增長(zhǎng)趨勢(shì)；模型組、美沙拉嗪組和腸炎清低劑量組和腸炎清高劑量組造模后動(dòng)物體質(zhì)量明顯減輕，與動(dòng)物嚴(yán)重的腸道反應(yīng)相關(guān)，腸炎清高劑量組在給藥后期動(dòng)物體質(zhì)量略有恢復(fù)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組動(dòng)物體質(zhì)量比較

2.3 各組動(dòng)物大體解剖觀察 給藥后第8天動(dòng)物實(shí)施安樂死，大體解剖觀察，空白對(duì)照組動(dòng)物未見明顯異常；模型組、美沙拉嗪組、腸炎清低劑量組和高劑量組大腸段可見明細(xì)擴(kuò)張，結(jié)腸腸壁增厚，結(jié)腸段內(nèi)膜可見不同程度潰瘍，模型組最為嚴(yán)重，其次是美沙拉秦組和腸炎清低劑量組，腸炎清高劑量組潰瘍面減小，潰瘍程度減弱。與模型組比較，美沙拉嗪組、腸炎清低劑量組和高劑量組結(jié)腸損傷面積和損傷程度有明顯減?。慌c美沙拉嗪組比較，腸炎清組低劑量組結(jié)腸損傷面積和損傷程度沒有明顯差異，而腸炎清高劑量組差異顯著，對(duì)結(jié)腸損傷面積和損傷程度有明顯緩解作用。見圖1。

圖1 各組大體解剖觀察

2.4 各組動(dòng)物病理學(xué)檢查結(jié)果及評(píng)分 結(jié)腸段組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，空白對(duì)照組未見明顯異常。模型組可見黏膜及黏膜下層腸壁壞死，并可見大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，平均組織病理評(píng)分3.3分;美沙拉秦組可見黏膜固有層壞死，伴有大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，平均組織病理評(píng)分2分；腸炎清低劑量組可見黏膜層壞死，大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，壞死區(qū)域可見鈣化灶，平均組織病理評(píng)分2.3分；腸炎清高劑量組可見黏膜層壞死，部分動(dòng)物可見下層輕度壞死，大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，平均組織病理評(píng)分2分。從組織病理學(xué)檢查結(jié)果分析，與模型組比較，美沙拉秦組和腸炎清高劑量組對(duì)結(jié)腸損傷有明顯改善作用，腸炎清低劑量組對(duì)結(jié)腸損傷有一定改善作用。見圖2、表3。

圖2 各組組織病理學(xué)檢查結(jié)果(HE染色，×100)

表3 各組大鼠組織病理學(xué)評(píng)分和通路分析

2.5 大鼠結(jié)腸黏膜組織中ERK磷酸化的水平及TGF-β1信號(hào)通路活化的程度 模型組p-ERK和ERK表達(dá)水平最低，并且腸炎清組p-ERK和ERK表達(dá)水平隨劑量升高而上升，且高劑量腸炎清組p-ERK表達(dá)水平顯著高于模型組，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高劑量腸炎清組p-ERK表達(dá)水平與美沙拉嗪組(陽性藥組)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3～4。

圖3 各組ERK磷酸化電泳結(jié)果

圖4 各組ERK磷酸化比較

2.6 大鼠腸黏膜TGF-β1、Smad3水平及TGF-β1信號(hào)通路活化的程度 (TGF-β1、p-Smad2/3、Smad2/3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組TGF-β1和p-Smad2/3明顯高于美沙拉嗪組(陽性藥組)、空白對(duì)照組和腸炎清觀察組(P<0.05)。見圖5～6。

圖5 各組TGF-β1、p-Smad2/3、Smad2/3電泳結(jié)果

圖6 各組TGF-β1、p-Smad2/3、Smad2/3比較

3 討論

腸炎清是廣州醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑，2010年評(píng)為廣州市中醫(yī)藥學(xué)會(huì)優(yōu)秀制劑，在應(yīng)用治療已知或未知原因引起的腸黏膜損傷的20年中，療效顯著。然而在前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),腸炎清對(duì)UC大鼠模型結(jié)腸黏膜ERK1、ERK2基因的相對(duì)表達(dá)量有上調(diào)作用，提示腸炎清治療作用可能與ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活有關(guān)[2-4]。在TGF-β1發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)時(shí)，促分裂原活化的蛋白激酶信號(hào)通路是其中的一個(gè)重要通路，且Smad3是TGF-β的關(guān)鍵始動(dòng)因子。研究表明，在多種細(xì)胞中,TGF-β1/Smad3與ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能存在多個(gè)環(huán)節(jié)有相互調(diào)節(jié)關(guān)系[5]，但其具體作用機(jī)制及關(guān)鍵環(huán)節(jié)還不明確。本研究通過觀察TGF-β1、Smad3、ERK三者關(guān)系，發(fā)掘腸炎清治療機(jī)制的作用靶點(diǎn)及途徑，為UC的治療提供新方法。

本研究發(fā)現(xiàn)，通過大鼠大體解剖觀察病理組織，腸炎清對(duì)腸道有一定的修復(fù)作用，且高劑量的腸炎清改善結(jié)腸損傷的療效等同于美沙拉嗪組，對(duì)腸道炎癥起到明顯修復(fù)作用。

TGF-β1在炎癥和組織修復(fù)過程中起了重要作用[6]。TGF-β1是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)及分化的抗炎細(xì)胞因子，具有多種生物學(xué)活性，能抑制淋巴細(xì)胞增殖及其功能，并且抑制巨噬細(xì)胞激活[7]。同時(shí)它又屬于免疫抑制劑，能減輕局部炎癥反應(yīng)，主要通過抑制T、B細(xì)胞增殖，可減少主要組織相容性復(fù)合體(Major Histocompatibility Complex，MHC)Ⅱ類抗原表達(dá)。Smads家族蛋白在將TGF-β信號(hào)從細(xì)胞表面受體轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核的過程中起到關(guān)鍵性作用，Smads蛋白是一種中介分子，能將配體與受體作用的信號(hào)從胞質(zhì)傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，而活化的Smads進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)可同時(shí)抑制或激活它們調(diào)節(jié)的靶基因轉(zhuǎn)錄[8]。Smads家族成員是TGF-β下游的信號(hào)蛋白分子，而Smad3是這一信號(hào)通路的關(guān)鍵始動(dòng)因子[8]。在TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，Smads家族作為下游的重要信號(hào)蛋白分子，為TGF-β信號(hào)從細(xì)胞外轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)的重要部分，其中尤以Smad3最為關(guān)鍵，能在整個(gè)信號(hào)通路中發(fā)揮著極其關(guān)鍵的作用[9]。TGF-β1/Smad3信號(hào)通路調(diào)控免疫反應(yīng)[10-11]，可通過誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)成分膠原蛋白和黏蛋白的合成，減少細(xì)胞外膠原蛋白分解酶的釋放，促進(jìn)纖維化形成，有益于損傷組織的纖維化修復(fù)[12-15]。但在本實(shí)驗(yàn)中，通過蛋白質(zhì)印跡法得出的結(jié)果與有關(guān)研究報(bào)道不同，提示TGF-β1為化學(xué)趨化因子，對(duì)單核細(xì)胞具有促炎作用，可加重腸道炎癥，與有些研究結(jié)果相似?？紤]TGF-β可通過黏附分子將單核細(xì)胞募集到造模后受傷的腸道，同時(shí)通過誘導(dǎo)單核細(xì)胞IL-1、IL-6和白三烯C4合成酶加強(qiáng)炎癥反應(yīng)[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組中TGF-β1/Smad3明顯升高，而觀察組中TGF-β1/Smad3都降低明顯，考慮美沙拉嗪組及腸炎清組對(duì)TGF-β1/Smad3信號(hào)通路有明顯的抑制作用，且腸炎清高劑量更加明顯，提示腸道損傷炎癥反應(yīng)程度與TGF-β1/Smad3的表達(dá)負(fù)相關(guān)。

促分裂原活化的蛋白激酶信號(hào)通路是TGF-β1發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)的一個(gè)重要通路[18]。作為促分裂原活化的蛋白激酶的重要成員之一，ERK是組成從細(xì)胞膜到細(xì)胞核的細(xì)胞信號(hào)系統(tǒng)之一，通過調(diào)控細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡，參與細(xì)胞的生物學(xué)過程。國(guó)內(nèi)多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，ERK指標(biāo)與細(xì)胞增殖有關(guān)，表達(dá)水平升高代表細(xì)胞增殖活躍[19-21]。本實(shí)驗(yàn)中腸炎清組該指標(biāo)水平隨劑量升高而上升，且高劑量腸炎清組p-ERK表達(dá)水平顯著高于模型組，并與陽性藥組(美沙拉嗪組)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明高劑量腸炎清可能有利于腸炎病理狀態(tài)下的組織修復(fù)。治療后，腸炎清高劑量組及美沙拉嗪組在炎癥修復(fù)中p-ERK表達(dá)水平超過空白對(duì)照組，表明p-ERK升高更有利于炎癥改善。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組TGF-β1和p-Smad2/3明顯升高，而p-ERK明顯減低；而治療各組中TGF-β1和p-Smad2/3明顯減低，而p-ERK明顯升高，二者具有可比性。從結(jié)果中提示TGF-β1/Smad3信號(hào)通路與ERK負(fù)相關(guān)，提示腸炎清可通過下調(diào)TGF-β1/Smad3信號(hào)通路，提升ERK水平而發(fā)揮炎癥修復(fù)作用。故通過信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制入手，深入研究中藥腸炎清治療UC的作用機(jī)制及相關(guān)新信號(hào)通路，可為UC治療新藥的開發(fā)提供新思路。