袁凱旋，張?jiān)Ｈ海S愛偉，葉龍，陳曉麗，陳卓曦，劉素玲，顧兵

廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），廣州 510080

近年來，隨著糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、廣譜抗菌藥物的廣泛應(yīng)用及腫瘤化療、器官移植等危險(xiǎn)因素增多，侵襲性念珠菌病發(fā)病率呈明顯上升趨勢[1]。全球真菌感染行動(dòng)基金（https://gaffi.org/）數(shù)據(jù)顯示每年住院及危重患者感染念珠菌的人數(shù)超過750 000，每年估計(jì)死亡人數(shù)超過350 000。國外多中心研究數(shù)據(jù)顯示，近年來以近平滑念珠菌為代表的非白色念珠菌在侵襲性感染中的分離率逐漸升高，且耐藥率高于白念珠菌[2～3]。中國侵襲性真菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)（https://www.chifnet.com/）2010～2014年的數(shù)據(jù)顯示，近平滑念珠菌在侵襲性真菌感染中占比18%，僅次于白念珠菌及熱帶念珠菌[4]。

近平滑念珠菌復(fù)合群主要包括近平滑念珠菌（Candida parapsilosis）、似平滑念珠菌（Candida metapsilosis）和擬平滑念珠菌（Candida orthopsilosis）[5]，其可借由醫(yī)護(hù)人員及相關(guān)工作人員的手部皮膚接觸，引起院內(nèi)傳播。與其他念珠菌比較，近平滑念珠菌易附著于各種裝置和材料的表面、易在高糖的腸外營養(yǎng)液中存活，從而增加感染風(fēng)險(xiǎn)[3]。盡管近平滑念珠菌復(fù)合群通常對(duì)大多數(shù)抗真菌藥物敏感，但有研究顯示其對(duì)棘白菌素和唑類抗真菌藥物的敏感性正在下降[6]，因此對(duì)唑類抗真菌藥物耐藥的近平滑念珠菌需引起臨床重視和關(guān)注。但目前關(guān)于近平滑念珠菌復(fù)合群臨床可用的抗真菌藥物的敏感性數(shù)據(jù)有限，且不同菌種的抗真菌藥物敏感性亦可能存在差異。基于此，本研究探討了4種臨床常用的抗真菌藥物（氟康唑、兩性霉素B、伊曲康唑和伏立康唑）對(duì)近平滑念珠菌、似平滑念珠菌和擬平滑念珠菌的抗真菌體外藥敏特點(diǎn)，旨在為臨床治療、真菌耐藥監(jiān)測和流行病學(xué)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集2020年1月～2022年7月期間本院278例侵襲性真菌感染患者臨床分離的非重復(fù)近平滑念珠菌復(fù)合群278株。所有菌株均經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix～assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI～TOF MS）和形態(tài)學(xué)鑒定（表1）。

表1 侵襲性真菌感染患者的一般資料 n（%）

續(xù)表

1.2 菌株復(fù)核

根據(jù)Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒說明書提取DNA，利用真菌通用引物對(duì)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列為ITS1：5’～TCCGTAGGTGAACCTGCGG～3’；ITS4：5’～TCCTCCGCTTATTGATATGC～3’。反應(yīng)總體積為50μl：Taq PCR Master Mix 25μl、DNA模板5μ l、0.2μmol/L 上 下 游引物各2 μ l、ddH2O 16 μ l。擴(kuò)增條件：94℃ 預(yù)變性3min；94℃變性60s，56℃退火30s，72℃延伸2min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司完成測序。使用Contig Express 9.1軟件將兩端序列進(jìn)行拼接和手動(dòng)矯正后，在NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和MYCOBANK數(shù) 據(jù)庫（https://www.mycobank.org/）上進(jìn)行比對(duì)，種、屬信息鑒定原則參照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[7]。

1.3 抗真菌藥物敏感性試驗(yàn)

依照ATB FUNGUS 3試劑盒（法國生物梅里埃公司）說明書進(jìn)行操作。挑取培養(yǎng)純菌落，使用氯化鈉溶液制備成2.0MCF的菌懸液，取20μl菌懸液置入含培養(yǎng)液的安瓿瓶中，用吸管混勻，在每個(gè)杯狀凹槽中加入135μl混勻的培養(yǎng)液，在有氧、（35±2）℃的環(huán)境中，濕盒培養(yǎng)（24±2）h。采用近平滑念珠菌ATCC22019作為質(zhì)控菌株。

1.4 判斷標(biāo)準(zhǔn)

將試驗(yàn)條放置于黑暗背景下進(jìn)行肉眼判讀。根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2020 年更新的 M59[8]和 M60[9]文件中相關(guān)判讀標(biāo)準(zhǔn)，參照臨床折點(diǎn)（clinical breakpoint， CBPs）和流行病學(xué)折點(diǎn)（epidemiological cutoff value，ECV）進(jìn)行結(jié)果解釋。兩性霉素B完全抑制真菌生長的濃度為最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）；與對(duì)照組比較，氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑的真菌生長抑制率超過80%時(shí)的藥物濃度為各藥物相應(yīng)的MIC。當(dāng)MIC≤ECV時(shí)，該菌株為未獲得相關(guān)藥物的耐藥機(jī)制或突變性耐藥的野生型（wild～type，WT）菌株；當(dāng)MIC＞ECV時(shí)， 該菌株為獲得相關(guān)藥物的耐藥機(jī)制或有突變耐藥的非野生型（non～wild～type，NWT）菌株。

本研究中具體標(biāo)準(zhǔn)如下：①近平滑念珠菌：兩性霉素B（MIC≤1 μ g/ml為WT；MIC＞1 μ g/ml為NWT），氟康唑（MIC≤2 μ g/ml為敏感；MIC =4 μ g/ml為劑量依賴性敏感；MIC≥8 μ g/ml為耐藥），伊曲康唑（MIC≤0.5 μ g/ml為WT；MIC＞0.5 μ g/ml為NWT），伏立康唑（MIC≤0.125 μ g/ml為敏感；0.25 μ g/ml≤MIC≤0.5 μ g/ml為中介；MIC≥1 μ g/ml為耐藥）。②似平滑念珠菌：兩性霉素B（MIC≤1 μ g/ml為WT；MIC＞1 μ g/ml為NWT），氟康唑（MIC≤4 μ g/ml為WT；MIC＞4 μ g/ml為NWT），伊曲康唑（MIC≤1 μ g/ml為WT；MIC＞1 μ g/ml為NWT），伏立康唑（MIC≤0.06 μ g/ml為WT；MIC＞0.06 μ g/ml為NWT）。③擬平滑念珠菌：兩性霉素B（MIC≤2 μ g/ml為WT；MIC ＞2 μ g/ml為NWT），氟康唑（MIC≤2 μ g/ml為WT；MIC＞2 μ g/ml為NWT），伊曲康唑（MIC≤0.5 μ g/ml為WT；MIC＞0.5 μ g/ml為NWT），伏立康唑（MIC≤0.12 μ g/ml為WT；MIC＞0.12 μ g/ml為NWT）。④近平滑念珠菌復(fù)合群的CBPs和ECV可參考近平滑念珠菌。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

通過每種藥物對(duì)不同菌株的MIC值，計(jì)算能抑制50%菌株生長所需的MIC（MIC50）、抑制90%菌株生長所需的MIC（MIC90）、MIC的幾何均數(shù)（geometric mean，GM）、WT菌株或敏感菌株的占比。不同抗真菌藥物的MIC比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，敏感菌株或WT菌株占比的比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 菌株復(fù)核結(jié)果

通過ITS區(qū)序列分析，278株受試菌株測序結(jié)果與MALDI～TOF MS和形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果相符，即近平滑念珠菌213株（76.62%）、似平滑念珠菌43株（15.47%）、擬平滑念珠菌22株（7.91%）。

2.2 一般資料

278例侵襲性真菌感染患者中，男性179例（64.39%），女性99例（35.61%）；年齡17天～96歲，平均年齡（60.88±17.71）歲；病原菌主要來源于創(chuàng)面分泌物（85株，30.58%）和潔凈中段尿（67株，24.10%）；患者主要分布于外科病區(qū)（89例，32.01%）、內(nèi)科病區(qū)（79例，28.42%）和ICU病區(qū)（77例，27.70%）。詳見表1。

2.3 抗真菌藥物敏感性結(jié)果

在復(fù)合群水平上，278株受試菌株中，對(duì)氟康唑耐藥的有16株（5.76%），劑量依賴性敏感的有6株（2.16%），敏感的有256株（92.09%）；4株為伊曲康唑NWT菌株（1.44%）；對(duì)伏立康唑耐藥的有9株（3.24%），中介的有7株（2.52%）；所有菌株均為兩性霉素B的WT菌株（100.00%）。

在種水平上，近平滑念珠菌（213株，100.00%）、似平滑念珠菌（43株，100.00%）和擬平滑念珠菌（22株，100.00%）均為兩性霉素B的WT菌株。氟康唑?qū)交钪榫退破交钪榫腗IC范圍均為1～128μg/ml，MIC50均為1μg/ml，MIC90均為 2μg/ml，GM 分別為 1.2477、1.2532μg/ml，二者比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。近平滑念珠菌中，199株（93.43%）為氟康唑敏感菌株，10株（4.69%）為氟康唑耐藥菌株；似平滑念珠菌中，42株（97.67%）為氟康唑WT菌株，1株（2.33%）為NWT菌株（氟康唑 MIC為128μg/ml）；擬平滑念珠菌中，氟康唑的MIC范圍 為 1～16μg/ml，MIC50為 1μg/ml，MIC90為16μg/ml，GM 為 1.6550μg/ml，15 株（68.18%）為氟康唑WT菌株，與其他兩種菌比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。伊曲康唑?qū)交钪榫?、似平滑念珠菌和擬平滑念珠菌亦表現(xiàn)出較好的抑菌活性，MIC50均為0.125 μ g/ml，且各菌種中95%以上菌株均為伊曲康唑WT菌株（P＞0.05）。伏立康唑?qū)交钪榫退破交钪榫腗IC50、MIC90均為0.06 μ g/ml，GM分別為0.0688、0.0672 μ g/ml，其中204株（95.77%）近平滑念珠菌為伏立康唑敏感菌株，42株（97.67%）似平滑念珠菌為伏立康唑WT菌株；伏立康唑?qū)M平滑念珠菌的 MIC50為 0.06 μ g/ml，MIC90為 0.5 μ g/ml，GM為0.1213 μ g/ml，GM與其他兩種菌比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），僅16株（72.73%）擬平滑念珠菌為伏立康唑WT菌株，與其他兩種菌比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。詳見表2。

表2 近平滑念珠菌復(fù)合群對(duì)4種抗真菌藥物的體外敏感性結(jié)果

續(xù)表

3 討論

近平滑念珠菌復(fù)合群是人類皮膚黏膜、消化道、生殖道內(nèi)的正常定植菌群，在某些危險(xiǎn)因素下可侵犯皮膚、黏膜和內(nèi)臟，表現(xiàn)為急性、亞急性或慢性炎癥，大多為繼發(fā)性感染，目前已經(jīng)成為侵襲性念珠菌病的第二大病原體[3，5]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合群中最常見的菌種為近平滑念珠菌，其次為似平滑念珠菌[2，5～6]。本研究納入分析的 278 株菌株以近平滑念珠菌（76.62%）為主，似平滑念珠菌（15.47%）次之，擬平滑念珠菌（7.91%）最少。皮膚表面是近平滑念珠菌最主要的分離部位[10]，本研究中創(chuàng)面分泌物是其最主要的標(biāo)本來源，這可能也是該菌易導(dǎo)致機(jī)會(huì)性自身感染的原因。近平滑念珠菌感染在66歲以上人群中更常見（128例，46.04%），且主要分布于外科、內(nèi)科和ICU病區(qū)，臨床需提高警惕并積極采取措施預(yù)防特殊人群感染侵襲性念珠菌。

美國傳染病學(xué)會(huì)2016年更新的《念珠菌病處理臨床實(shí)踐指南》（Clinical Practice Guideline for the Management of Candidiasis）中推薦，氟康唑可作為侵襲性念珠菌病的一線治療藥物，伏立康唑可作為替代藥物[11]。近平滑念珠菌復(fù)合群中各菌種的生物學(xué)特性存在一定差異，對(duì)抗真菌藥物的體外敏感性亦不盡相同。本研究采用ATB FUNGUS 3法對(duì)278株近平滑念珠菌復(fù)合群內(nèi)的3種菌種進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)，氟康唑總體耐藥率為5.76%，伏立康唑總體耐藥率為3.24%，該結(jié)果與SENTRY真菌監(jiān)測項(xiàng)目連續(xù)20年的監(jiān)測數(shù)據(jù)結(jié)果[12]相近，即近平滑念珠菌對(duì)氟康唑的耐藥率為2.5%～5.5%；對(duì)伏立康唑的耐藥率與張麗等[13]的研究結(jié)果相近。在種水平上，兩性霉素B對(duì)3種菌種均表現(xiàn)出良好的抑制活性，所有分離株均為WT菌株，與以往的研究結(jié)論一致[5～6]；伊曲康唑亦表現(xiàn)出較好的抗菌活性，3種菌種中95%以上菌株均為敏感菌株或WT菌株；氟康唑和伏立康唑的抗菌活性存在種間差異，93.43%的近平滑念珠菌為氟康唑敏感菌株，97.67%的似平滑念珠菌為氟康唑WT菌株，僅68.20%的擬平滑念珠菌為氟康唑WT菌株，可見氟康唑?qū)交钪榫退破交钪榫憩F(xiàn)出較好的抗菌活性，而對(duì)擬平滑念珠菌的抗菌活性較差；伏立康唑?qū)交钪榫退破交钪榫啾憩F(xiàn)出較好的抗菌活性，對(duì)擬平滑念珠菌的抗菌活性則較差。該結(jié)果提示不同藥物對(duì)不同菌株的體外抗菌活性不同，故準(zhǔn)確鑒定菌種、開展真菌藥敏試驗(yàn)、準(zhǔn)確判讀藥敏結(jié)果對(duì)臨床合理使用抗菌藥物具有重要意義。本研究中，256株（92.08%）菌株對(duì)氟康唑敏感（MIC≤2μg/ml），部分菌株敏感性較低，其中，氟康唑?qū)?0株（4.69%）近平滑念珠菌MIC范圍為8～128μg/ml；對(duì)1株（2.33%）似平滑念珠菌的MIC為128μg/ml；對(duì)5株（22.73%）擬平滑念珠菌的MIC范圍為8～16μg/ml。臨床應(yīng)警惕對(duì)氟康唑敏感性較低的分離株的出現(xiàn)，且菌株對(duì)部分唑類藥物可能存在交叉耐藥現(xiàn)象[14]，應(yīng)引起臨床重視。隨著質(zhì)譜、分子測序等技術(shù)的發(fā)展，實(shí)驗(yàn)室可實(shí)現(xiàn)對(duì)擬平滑念珠菌和似平滑念珠菌的準(zhǔn)確鑒定，但由于臨床分離率低、藥敏數(shù)據(jù)較少，二者的藥敏特點(diǎn)目前尚無定論。有研究發(fā)現(xiàn)，與近平滑念珠菌比較，似平滑念珠菌的伏立康唑NWT菌株分離率較高[15]，且似平滑念珠菌與擬平滑念珠菌均對(duì)氟康唑表現(xiàn)出高敏感性[16]。本研究中，與近平滑念珠菌和似平滑念珠菌相比，擬平滑念珠菌的氟康唑NWT菌株分離率最高（7株，31.82%），伏立康唑NWT菌株分離率次之（6株，27.27%）。但本研究納入的菌株數(shù)較少，相關(guān)結(jié)論還需進(jìn)一步增加樣本量、多中心聯(lián)合證實(shí)。

綜上所述，4種抗真菌藥物對(duì)近平滑念珠菌復(fù)合群的不同菌種的抗菌活性存在差異。兩性霉素B和伊曲康唑?qū)?fù)合群內(nèi)3種念珠菌均表現(xiàn)出較好的抗菌活性，但氟康唑和伏立康唑的抗菌活性則存在種間差異，表現(xiàn)為二者對(duì)擬平滑念珠菌的抗菌活性較差。因此，對(duì)近平滑念珠菌復(fù)合群進(jìn)行菌種鑒定和開展抗真菌體外藥敏試驗(yàn)對(duì)臨床合理使用抗菌藥物具有重要意義，也可為臨床治療、真菌耐藥性檢測和流行病學(xué)研究提供參考。