張奕梅，覃嘉怡，宋鵬書，潘平山

(廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院產科，南寧 530003)

胎兒生長受限(FGR)是指子宮內生長的胎兒的大小和重量減少，其發(fā)生率為所有妊娠的5%～10%。與正常發(fā)育的胎兒相比，F(xiàn)GR胎兒的圍生期死亡率至少增加了10倍[1]。FGR是產科常見并發(fā)癥之一，不僅出生時FGR嬰兒有更高的胎兒窒息和神經發(fā)育障礙的風險，而且兒童期及青春期體能和智能發(fā)育均受影響，成人后更易發(fā)生代謝綜合征[2]。FGR的成因大致可分為三大類：母體因素、胎兒因素和胎盤因素。胎盤因素是FGR最常見的病因之一，但其潛在機制尚不清楚[3]。 生長阻滯特異性蛋白6(Gas6)可表達于胎盤組織、內皮細胞等，是促進血管生成的因子。有研究發(fā)現(xiàn)Gas6可增強血小板脫顆粒，促進血小板聚集功能，從而介導血栓的形成，Gas6上調組織因子的表達，啟動凝血過程[4]。

現(xiàn)臨床有關胎盤Gas6水平檢測在FGR患者產前診斷中的作用研究尚不多見，鑒于此，本研究通過探討FGR患者胎盤Gas6的表達水平，尋找引起FGR的相關機制，為指導臨床對FGR的預防、診治提供一定的理論與臨床依據。

1 資料與方法

1.1一般資料

選取2020年6月至2021年6月本院產科診斷為FGR孕婦50例作為試驗組，同期選取50例妊娠正常孕婦作為對照組。納入標準：(1)出生體重低于同孕齡同性別胎兒平均體重兩個標準差或第十百分位數(shù)或孕37周后胎兒出生體重小于2 500 g；(2)胎齡大于或等于28周；(3)自然妊娠且單胎；(4)剖宮產終止妊娠。排除標準：(1)過期妊娠、多胎妊娠或胎兒畸形；(2)合并內、外科疾病，如闌尾炎、血液系統(tǒng)性疾病、高血壓、糖尿病等；(3)胎盤腫瘤及胎盤血管瘤；(4)明確臍帶因素導致的FGR；(5)明確胎兒染色體異常導致的FGR。本研究經本院倫理委員會批準，兩組孕婦均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1資料采集

收集孕婦社會人口統(tǒng)計學資料(年齡、孕前體重、身高、教育程度、職業(yè)、受孕方式等)和生活習慣(孕期是否抽煙、飲酒等)。記錄孕前體重指數(shù)(BMI) 、臍血流S/D值和妊娠期并發(fā)癥。待分娩后，從住院病歷系統(tǒng)收集母嬰結局資料。

1.2.2實驗試劑

Gas6酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，ml060423,ml038196)、多聚甲醛固定液(美國Sigma公司，P-6148)、Gas6抗體(美國Abcam公司，ab223738)、TRIzol、反轉錄試劑盒和熒光定量試劑盒(美國ThermoFisher公司，15596026，4368813，A25742)等。引物由上海生工生物技術公司合成，見表1。

表1 合成引物

1.2.3胎盤組織病理學檢查

取胎盤母體面中央約1 cm3組織塊，用生理鹽水漂洗血液，置于4%的多聚甲醛液中固定24 h。然后組織塊脫水，行石蠟包埋，切成4 μm厚度薄片，放入37 ℃溫水表面貼到載玻片上，再依次浸入二甲苯和梯度乙醇脫蠟。蒸餾水沖洗，將載玻片放入蘇木精溶液中染色，流水沖洗，放入37 ℃溫水中進行反藍，晾干，中性樹膠封固保存，顯微鏡觀察HE染色情況。

1.2.4ELISA檢測外周血Gas6表達

采集兩組孕婦外周血3 mL，室溫放置1 h 后4 ℃、3 000 r/min 離心 15 min，取上清液，使用對應的試劑盒通過ELISA檢測兩組孕婦血清Gas6的表達情況，所有操作均嚴格按試劑盒說明書進行。

1.2.5免疫組織化學(IHC)檢測胎盤組織中Gas6蛋白的表達

剪取分娩胎盤母體面約1 cm3組織塊，用PBS沖洗血液，置于4%的多聚甲醛液中固定24 h。然后組織塊脫水，石蠟包埋，切成4 μm厚度薄片貼到載玻片上，再依次經過脫蠟，高壓修復，3%雙氧水中孵育和封閉。滴加一抗孵育過夜，二抗孵育20 min，DAB顯色5 min。蘇木素染色1 min，分化反藍，梯度乙醇脫水，樹膠封片，用電子顯微鏡觀察陽性面積大小。

1.2.6qPCR檢測胎盤組織中Gas6 mRNA的表達

取分娩胎盤母體面約1 cm3組織塊，用PBS沖洗血液，將組織放在-80 ℃冰箱保存。根據TRIzol-Reagent試劑盒提取RNA，采用ND2000分光光度計測定RNA濃度，按照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，參照TaKaRa公司說明書進行qPCR。反應程序設置為95 ℃預變性3 min;95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，40個循環(huán);72 ℃延伸2 min。以GAPDH為內參，每次檢測設定3個復孔。根據PCR擴增曲線，得到每個樣本的循環(huán)周期數(shù)(Cq值)，使用2-△△Ct法計算目的基因表達水平。

1.3統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1一般資料

兩組孕婦均無吸煙/飲酒史。試驗組孕婦孕周、新生兒體重均明顯少于對照組，臍血流S/D值、BMI值、羊水過少發(fā)生率、妊娠期并發(fā)癥發(fā)生率、胎兒窘迫、急診剖宮產率均明顯大于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組孕婦一般資料比較

2.2胎盤組織病理學檢查結果

對照組胎盤組織內部細胞排列整齊，絨毛組織幾乎無破損。試驗組胎盤組織內部出現(xiàn)細胞溶解，血管有水腫破裂，絨毛間質纖維化及纖維蛋白樣壞死，滋養(yǎng)層細胞腫脹，排列混亂，見圖1。

A:對照組；B:試驗組。

2.3外周血Gas6表達水平

對照組孕婦外周血Gas6表達水平為(9.60±2.52)pg/mL，試驗組為(12.55±2.34)pg/mL。試驗組孕婦外周血Gas6表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4胎盤組織中Gas6蛋白表達情況

與對照組比較，試驗組胎盤組織中Gas6蛋白的棕色陽性區(qū)域表達水平明顯上升，見圖2。

A:對照組；B:試驗組。

2.5胎盤組織中Gas6 mRNA表達情況

對照組胎盤組織中Gas6 mRNA的表達水平為1.03±0.04，試驗組為1.41±0.23。試驗組胎盤組織中Gas6 mRNA表達水平較對照組增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討 論

FGR的發(fā)生是由于胎盤功能的損害，胎兒沒有達到其宮內生長和發(fā)育的標準[5]。FGR是圍生期死亡的第二大原因，造成30%的死產嬰兒，也是早產和產時窒息的最常見原因。美國婦產科學院將FGR定義為胎齡低于10%的胎兒體重，并指出其與胎盤循環(huán)障礙有關[6]。胎盤循環(huán)障礙多與胎盤發(fā)育異常密切相關，F(xiàn)GR患者的胎盤多存在血管病變、胎盤血液循環(huán)阻力過高，導致胎盤血液循環(huán)受阻，胎盤血流量降低，引發(fā)嚴重胎兒缺血、缺氧、死亡的不良結局[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)FGR患者的胎盤組織內部血管破裂溶解，絨毛間質纖維化及纖維蛋白樣壞死，滋養(yǎng)層細胞腫脹，排列混亂，說明FGR患者的胎盤組織中血管壓力過大導致組織損傷出現(xiàn)纖維化狀態(tài)。纖維化是由于重復的組織損傷和修復過程失調而導致細胞外基質過度沉積的結果。Gas6基因是一種維生素k依賴的生長因子，表達于許多細胞類型，包括血管平滑肌細胞、系膜細胞和內皮細胞[8]。BELLAN等[9]指出Gas6在炎癥控制和纖維化疾病進展中扮演了重要角色，推測Gas6可能成為減少纖維化損傷的潛在治療靶點。有研究發(fā)現(xiàn)Gas6也在血小板中表達，可以加強血小板脫顆粒，促凝聚，促進血栓形成[10]。一項Gas6 抗體抑制血小板功能研究表明，Gas6 特異性抗體能有效作用于 Gas6 蛋白結構中負責將其與受體結合的C端，從而抑制血小板的活化[11]。陳宣辰[12]發(fā)現(xiàn)Gas6可能通過調節(jié)炎性反應、腎功能損害、脂肪形成、血管生成以及血栓形成參與子癇前期的發(fā)生、發(fā)展。FGR患者的胎盤多存在血管病變、循環(huán)阻力過高等問題，導致胎盤血液循環(huán)受阻，胎盤血流量降低，導致FGR，隨著胎盤血液循環(huán)阻力的不斷升高，可引發(fā)嚴重胎兒缺血、缺氧、死亡的不良結局[13]。為了驗證Gas6因子與FGR患者發(fā)病存在相關性，本研究收集了FGR患者分娩前的外周血和分娩后的胎盤組織，檢測了Gas6在其中的表達水平與正常孕婦相應表達水平的差別，結果發(fā)現(xiàn)Gas6分子表達與FGR存在相關性，Gas6在FGR患者外周血和胎盤組織中均高表達，可以初步推斷Gas6分子在FGR發(fā)病和疾病發(fā)展中存在一定的協(xié)同作用。

為了明確FGR癥狀發(fā)生危險性及其發(fā)生機制與胎盤組織病理的相關性，本研究收集了FGR孕婦與健康孕婦的一般資料和妊娠期情況進行比較，結果顯示，F(xiàn)GR孕婦臍血流S/D值、BMI值均明顯高于健康孕婦，說明FGR孕婦機體本身出現(xiàn)了異樣，如羊水量較少，發(fā)生妊娠期高血壓、妊娠期糖尿病和嚴重貧血，這些并發(fā)癥也均與胎盤發(fā)育異常有關。羊水量的多少反映胎盤的功能，羊水過少與宮內慢性缺氧導致胎兒體內的血液重新分布，使得胎兒腎臟血流量下降，所生成的尿液減少有關[14]。臍血流S/D值增加后外周小動脈阻力增加、小動脈發(fā)生痙攣，使得胎盤螺旋小動脈的血容量減少，引起胎盤缺血、缺氧和灌注不足、胎盤絨毛膜壞死梗阻均會導致妊娠期高血壓[15]。所以胎盤組織中血管的損傷病變均會導致胎兒對營養(yǎng)物質和氧氣攝入不足而發(fā)生FGR。

目前，已知胎盤及臍帶、胎兒遺傳性疾病等與FGR的發(fā)病密切相關，但其作用機制復雜，與FGR的關系尚未明確。Gas6有抗血管生成的作用，導致血流供應受阻，本研究中FGR孕婦外周血檢測Gas6表達水平高于正常孕婦。本研究總結，Gas6可以與超聲檢測指標、臨床診斷相結合，發(fā)揮其輔助診斷作用才能有效提高FGR的早期診斷效率。