李 遜，嚴 嬌，蔡順禮，陳華劍

400016 重慶，重慶市急救醫(yī)療中心：檢驗科1，肝膽外科2

據(jù)最新全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)報告，肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的發(fā)病率居所有惡性腫瘤第6位，但致死率高居第3位。侵襲與轉(zhuǎn)移是導致肝癌高死亡率的主要原因，然而當前關于肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制仍沒有完全闡明。透明質(zhì)酸介導的細胞游走受體(hyaluronan-mediated motility receptor，HMMR)作為細胞外基質(zhì)重要組成成分透明質(zhì)酸的相關膜受體之一，在膠質(zhì)瘤、乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌等多種人類惡性腫瘤中高表達，提示HMMR可能作為一個重要的腫瘤相關抗原參與并調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。相關研究還發(fā)現(xiàn)HMMR在HCC中的表達水平也顯著增高，并且與HCC患者預后不良密切相關，進一步還發(fā)現(xiàn)HMMR高表達與HCC患者的臨床分期和病理分級呈明顯的正相關關系，這些結(jié)果揭示了HMMR可能在HCC的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著作用。但截至目前，HMMR在HCC侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮的具體作用及其分子機制仍不明了。因此本文旨在探究HMMR對HCC侵襲轉(zhuǎn)移的作用及其可能的生物學機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 肝癌及癌旁組織樣本 12例肝癌及對應癌旁組織的凍存樣本用于檢測HMMR的表達水平。樣本來源于2013年8月至2015年8月于重慶市急救醫(yī)療中心肝膽外科接受肝癌肝切除術(shù)的患者。肝癌組織樣本經(jīng)病理診斷證實為肝細胞癌。癌旁肝組織的獲取參照《原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷指南》(2015年版)，取自距離腫瘤組織1 cm以上的肝臟組織。術(shù)后3年內(nèi)連續(xù)每年對患者進行追蹤隨訪，經(jīng)B超、CT、MRI等影像學檢查發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移者即診斷為肝癌伴轉(zhuǎn)移。

1.1.2 細胞和動物 肝癌細胞株MHCC97H購自復旦IBS細胞資源中心。細胞株L02、SK-Hep-1、Huh7和PLC/PRF/5由本實驗室傳代及保存。12只6周齡健康雄性裸鼠，體質(zhì)量(20.6±1.2)g，購買并代養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.1.3 試劑 高糖DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購自Gibco公司。Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑購自Thermo Fisher公司。Transwell小室購自美國Corning。HMMR抗體、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和GAPDH抗體購自Proteintech公司。MEK、p-MEK、ERK、p-ERK抗體購自Bioworld公司。靶向HMMR的慢病毒購自吉凱基因公司。MEK抑制劑U1026購自MCE公司。靶向HMMR的siRNA由吉瑪基因公司設計并合成；相關引物均由上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉(zhuǎn)染和感染 常規(guī)用高糖DMEM、10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗于37 ℃，5%CO孵箱中培養(yǎng)細胞。參照吉瑪公司提供的說明書溶解siRNA,采用lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將靶向HMMR的siRNA轉(zhuǎn)染至肝癌細胞構(gòu)建沉默HMMR的細胞模型(siHMMR-1組、siHMMR-2組)，同時轉(zhuǎn)染與HMMR的序列無同源性的siRNA作為陰性對照(siNC組)。利用lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將攜帶HMMR的pcDNA3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至肝癌細胞構(gòu)建HMMR過表達細胞模型(HMMR組)，同時轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒作為陰性對照(pcDNA3.1組)。另一方面，穩(wěn)定敲減HMMR細胞株(shHMMR組)的構(gòu)建則根據(jù)吉凱基因提供的慢病毒感染手冊進行操作，病毒感染后72 h在細胞中加入終濃度1.5 μg/mL的嘌呤霉素進行篩選，篩選7 d后將嘌呤霉素濃度減至1/4繼續(xù)維持。同時構(gòu)建空白敲減的細胞株作為陰性對照(shNC組)。

1.2.2 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測 適量TRIzol裂解細胞或組織樣本，利用天根公司RNA提取試劑盒提取總RNA。取1 μg所提RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得相應cDNA。利用TaKaRa公司的SYBR Green試劑盒檢測HMMR的mRNA水平。HMMR上游引物為：5′-AGCAACAGGAGGAAGACT-3′，下游引物為：5′-ATAGAGGAGACGCCACTT-3′。GAPDH上游引物為：5′-TATGACAACAGCCTCAAGAT-3′，下游引物為：5′-AGTCCTTCCACGATACCA-3′。PCR程度為：95 ℃，2 min；95 ℃，15 s，60 ℃，20 s，72 ℃，20 s，40個循環(huán)；72 ℃,5 min。相對定量PCR結(jié)果采用2法分析。關于組織樣本，以癌旁組織為對照，癌組織中HMMR的mRNA水平升高大于1.5倍的定義為HMMR高表達，而降低大于1.5倍的則定義為HMMR低表達。

1.2.3 Western blot檢測 取30 μg細胞或組織總蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳，后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%牛奶封閉2 h，TBST洗膜3次后加入一抗(抗HMMR 1∶2 000，抗E-cadherin 1∶1 000, 抗N-cadherin；1∶1 000, 抗Vimentin 1：2 000，抗p-MEK 1∶1 000, 抗MEK 1∶2 000，抗p-ERK 1∶1 000，抗ERK 1∶2 000，GAPDH 1∶5 000),4℃搖床孵育過夜。次日洗膜后室溫孵育抗兔或抗鼠二抗，ECL顯影。

1.2.4 免疫組化實驗 石蠟包埋肝癌及癌旁組織切片，55 ℃烤箱過夜。次日，取出切片，再置于95 ℃烤箱，10 min。然后依次經(jīng)歷脫蠟、抗原修復、透膜，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑室溫封閉10 min。接著山羊工作血清室溫封閉1 h。滴加一抗(1∶100，TBS 稀釋)后于4 ℃暗盒孵育過夜。次日，TBS清洗3次后滴加生物素標記二抗孵育1 h。DAB 顯色后，蘇木精復染，梯度酒精、二甲苯脫水后中性樹脂封片。顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 細胞劃痕實驗 采用1 mg/mL絲裂霉素預處理細胞2 h，去除細胞增殖對遷移侵襲的影響。然后以30×10/孔接種至6孔板，次日細胞鋪滿整孔。10μL槍頭垂直并均勻的橫過細胞，造成“創(chuàng)口”。PBS清洗3次去除劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃，5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按0、24 h取樣，隨機取5個視野拍照。根據(jù)公式計算：細胞遷移率 =(0 h 劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h 劃痕寬度×100%。

1.2.6 Transwell實驗 沉默HMMR的MHCC97H細胞取8×10/小室，過表達HMMR以及10 μmol/L U1026處理48 h后的Huh7細胞分別取20×10/小室進行實驗。接種至小室前細胞經(jīng)絲裂霉素預處理，方法同前。①遷移：細胞用300 μL無血清培養(yǎng)基重懸后加入普通Transwell小室內(nèi)，小室外加入800 μL常規(guī)培養(yǎng)基，置于孵箱中孵育；②侵襲：提前從-20 ℃冰箱取出含基質(zhì)膠的Transwell小室置于24孔板中，小室內(nèi)外加入適量無血清培養(yǎng)基后于孵箱中預熱小室30 min。吸棄孔內(nèi)外培養(yǎng)基，按照細胞遷移實驗的操作步驟加入細胞。24 h后從孵箱中取出小室，PBS清洗2次，輕柔地用棉簽擦凈小室內(nèi)膜的細胞，然后小室置于4%多聚甲醛中固定15 min。雙蒸水清洗2次后，用0.1%結(jié)晶紫溶液染色30 min。雙蒸水沖洗、晾干后，顯微鏡下拍照并隨機選取5個視野計數(shù)穿過小室的細胞數(shù)。

1.2.7 裸鼠尾靜脈肝癌肺轉(zhuǎn)移模型 12只裸鼠隨機分為2組，每組6只。穩(wěn)定敲減HMMR的MHCC97H細胞和空白敲減細胞，分別以滅菌生理鹽水重懸后以2×10/300 μL經(jīng)尾靜脈注射入裸鼠體內(nèi)。每3～5天觀察小鼠存活情況。8周后處死裸鼠，取出肺組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片和HE染色。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 8進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以表示。兩組間比較采用Student-

t

檢驗，兩組以上比較采用單因素方差分析。采用卡方檢驗分析患者臨床病理特征與HMMR表達的相關性。

P

<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌患者不同臨床病理特征中HMMR的表達

采用卡方檢驗分析12例肝癌患者臨床病理特征與HMMR表達水平的關系，發(fā)現(xiàn)HMMR的表達水平與肝癌TNM分期存在顯著的相關性(表1)。雖然5例伴有肺轉(zhuǎn)移患者癌組織中HMMR的表達均增高，但數(shù)據(jù)分析并未檢測到HMMR表達水平與肝癌肺轉(zhuǎn)移之間的相關性，考慮可能與樣本數(shù)偏少有關。

表1 12例肝癌患者不同臨床病理特征中HMMR的表達情況

HMMR的表達基本信息 數(shù)量P值高 (n=9)低 (n=3)性別 男8710.157 女422年齡/歲 ≤502110.371 >501082AFP/μg·mL-1 ≤4006420.505 >400651腫瘤大小/cm ≤55320.311 >5761肺轉(zhuǎn)移 有5500.091 無743TNM分期 Ⅰ+Ⅱ6330.046 Ⅲ+Ⅳ660

2.2 HMMR在肝癌細胞系和肝癌組織中高表達

采用qRT-PCR和Western blot法檢測正常人肝細胞L02和4種肝癌細胞系，以及12對肝癌和癌旁組織中HMMR的mRNA和蛋白表達水平。結(jié)果顯示肝癌細胞中HMMR的表達水平均明顯高于L02細胞(圖1A、B)，并且HMMR的mRNA水平在高侵襲性肝癌細胞系MHCC97H的表達量最高，在低侵襲性肝癌細胞Huh7中的表達最低。此外，臨床樣本檢測結(jié)果也發(fā)現(xiàn)肝癌組織中HMMR的相對表達水平高于癌旁組織(

P

<0.05，圖1C、D)，并且轉(zhuǎn)移組肝癌組織中HMMR的相對表達水平明顯高于非轉(zhuǎn)移組(

P

<0.05，圖1E、F)。以上結(jié)果提示HMMR可能在肝癌中發(fā)揮了促癌轉(zhuǎn)移的作用。

A：qRT-PCR檢測正常肝細胞和肝癌細胞中HMMR mRNA的表達；B：Western blot檢測正常肝細胞和肝癌細胞中HMMR蛋白表達及半定量分析；C：肝癌和癌旁組織中HMMR mRNA的表達；D：免疫組化觀測肝癌和癌旁組織中HMMR的蛋白表達和定位；E：肝癌和癌旁組織中HMMR蛋白的表達 N：癌旁組織；T：癌組織；F：轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組肝癌組織中HMMR mRNA的表達(n=6)

2.3 HMMR的表達對肝癌細胞遷移侵襲能力的影響

利用siRNA沉默MHCC97H細胞中HMMR的表達(圖2A),劃痕實驗結(jié)果表明，siHMMR-1組、siHMMR-2組沉默HMMR表達后，細胞的“愈合”能力明顯低于siNC組(

P

<0.01，圖2B),Transwell實驗也顯示siHMMR-1組和siHMMR-2組細胞在有或無基質(zhì)膠小室底濾膜上的數(shù)量較siNC組減少(

P

<0.01，圖2C)。提示HMMR表達降低后細胞遷移和侵襲能力減弱。另一方面，過表達HMMR后(圖2D)，HMMR組 Huh7細胞的“愈合”率明顯高于pcDNA3.1組(

P

<0.01，圖2E)，Transwell實驗也顯示HMMR組細胞穿透小室底膜的數(shù)量明顯多于pcDNA3.1組(

P

<0.01，圖2F)，提示HMMR過表達后細胞遷移及侵襲能力增強。

A、D: Western blot檢測沉默或過表達HMMR后細胞中HMMR的表達；B：沉默HMMR后劃痕實驗結(jié)果(100×)；C：沉默HMMR后Transwell實驗結(jié)果(200×)；E：HMMR過表達后劃痕實驗結(jié)果(100×)；F：HMMR過表達后Transwell實驗結(jié)果(200×)

2.4 HMMR的表達對肝癌細胞EMT的影響

采用Western blot檢測沉默/過表達HMMR之后細胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialm-esencFhymal transition，EMT)相關蛋白E-cadherin、Vimentin和N-cadherin的表達變化。結(jié)果顯示，與對照組比較，沉默HMMR后N-cadherin和Vimentin的表達下調(diào)，E-cadherin表達上調(diào)；而過表達HMMR后N-cadherin和Vimentin的表達上調(diào)，E-cadherin表達下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05，圖3)。

A: Western blot檢測沉默/過表達HMMR后細胞中EMT相關蛋白的表達；B：沉默HMMR后細胞中EMT相關蛋白表達的灰度值；C：過表達HMMR后細胞中EMT相關蛋白表達的灰度值

2.5 HMMR表達變化對肝癌肺轉(zhuǎn)移的影響

通過尾靜脈注射HMMR穩(wěn)定沉默的MHCC97H細胞和對照組細胞(圖4A)，結(jié)果顯示，穩(wěn)定沉默HMMR的肝癌細胞引起的小鼠肺轉(zhuǎn)移病灶的數(shù)量明顯低于shNC對照組(

P

<0.05，圖4B、C)。

A: Western blot檢測穩(wěn)定沉默HMMR的細胞株中HMMR的表達；B：HE染色觀察裸鼠肝癌細胞肺轉(zhuǎn)移(200×)；C：肺轉(zhuǎn)移計數(shù)

2.6 HMMR表達變化對MEK/ERK信號通路的影響

通過Western blot檢測HMMR對細胞中MEK、ERK、p-MEK以及p-ERK的蛋白水平的影響，結(jié)果見圖5A，過表達HMMR后，細胞中p-MEK和p-ERK的表達水平顯著上調(diào)(

P

<0.01)，但MEK和ERK的蛋白表達水平無明顯變化(

P

>0.05)。采用MEK抑制劑U1026處理細胞48 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理后的細胞中上調(diào)的p-MEK和p-ERK的蛋白表達水平明顯下調(diào)(

P

<0.01)，但MEK和ERK的蛋白表達水平無明顯變化(

P

>0.05)。并且抑制劑處理后的細胞其遷移侵襲能力也顯著降低(

P

<0.01，圖5B)，證實MEK/ERK信號通路介導了HMMR對肝癌細胞遷移侵襲的促進作用。

A: Western blot檢測MEK、p-MEK、ERK、p-ERK蛋白的表達及半定量分析；B：Transwell實驗檢測細胞遷移侵襲能力的變化(×200)

3 討論

肝細胞癌是我國人民因癌癥死亡的主要病因之一，而導致HCC高致死率的最主要原因就是轉(zhuǎn)移和術(shù)后復發(fā)?，F(xiàn)有的分子靶向藥物索拉菲尼等雖可一定程度延長晚期肝癌患者的生命，但仍無法防治肝癌復發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，深入研究HCC侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生機制，探索能夠預測、監(jiān)測HCC轉(zhuǎn)移的潛在標記物，甚至找到能夠有效延緩或終止肝癌轉(zhuǎn)移的方法，是解決目前肝癌治療難題的關鍵措施，對實現(xiàn)個體化治療，延長患者生存時間具有重要意義。

研究報道HMMR通過參與細胞運動從而在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關鍵作用。在HCC中，王敏等和黃晨陽等均報道HMMR在肝癌組織的表達水平顯著高于癌旁正常組織，并且高表達HMMR的肝癌患者預后較差。同時，細胞水平的研究還發(fā)現(xiàn)HMMR可以促進肝癌細胞的增殖。然而，HMMR在HCC轉(zhuǎn)移中的作用尚不清楚。本研究首先在細胞層面證實HMMR在肝癌細胞系中高表達，并且發(fā)現(xiàn)高侵襲性肝癌細胞中HMMR的表達量顯著高于低侵襲性肝癌細胞。接著，在臨床樣本中檢測發(fā)現(xiàn)HMMR與轉(zhuǎn)移性HCC之間的潛在關系，提示HMMR可能在HCC的侵襲轉(zhuǎn)移中具有重要作用。鑒于肝癌的侵襲深度和遠處轉(zhuǎn)移是導致患者預后差的關鍵因素，為了明確HMMR在HCC侵襲轉(zhuǎn)移中的作用，本研究分別以MHCC97H和Hun7細胞為研究對象進行一系列體內(nèi)外實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默HMMR可以抑制肝癌細胞的遷移侵襲和肺轉(zhuǎn)移，而過表達HMMR可以增強肝癌細胞的遷移侵襲能力。另有研究發(fā)現(xiàn)HMMR在傷口愈合過程中增加并促進細胞遷移，這一過程可能與EMT密切相關。ZHANG等研究發(fā)現(xiàn)HMMR通過激活TGF-β/Smad2信號通路誘導EMT并增強胃癌細胞的干細胞特性。LU等報道在頭頸癌中高表達HMMR后下游富集最顯著的通路依次是KRAS信號路徑、EMT相關通路等。然而，在肝細胞癌中HMMR與EMT的關系尚不明確。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默HMMR可以上調(diào)E-cadherin的表達，同時下調(diào)N-cadherin和Vimentin的表達；而過表達HMMR后E-cadherin的表達卻下降，N-cadherin和Vimentin表達增高，提示HMMR表達變化可以調(diào)控EMT，HMMR可能通過EMT進程參與調(diào)控HCC的侵襲轉(zhuǎn)移。

透明質(zhì)酸與其受體相互作用引發(fā)的細胞內(nèi)一系列復雜的信號通路是透明質(zhì)酸參與細胞運動調(diào)節(jié)的主要機制。CD44和HMMR是細胞表面兩種主要的透明質(zhì)酸受體。既往研究圍繞CD44開展的比較多，已有報道透明質(zhì)酸結(jié)合CD44可以通過激活SRC/MEK/ERK，PI3K/AKT/mTOR，以及PI3K-4EBP1-SOX2等信號通路調(diào)控腫瘤細胞的干性、增殖、遷移和侵襲。而作為透明質(zhì)酸的主要受體之一的HMMR，現(xiàn)有研究對于其發(fā)揮生物學功能的分子機制卻報道極少。ASSMANN等發(fā)現(xiàn)HMMR可以與細胞內(nèi)的激酶、鈣調(diào)蛋白和細胞骨架微管蛋白結(jié)合，提示HMMR可能參與細胞骨架重組。MISSINATO等研究發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸與HMMR結(jié)合后可通過激活SRC/FAK信號通路最終引起心外膜細胞EMT和遷移。以上這些研究提示HMMR被激活后可能也是通過細胞內(nèi)信號的級聯(lián)放大反應來發(fā)揮生物學功能的。在前人研究的基礎上，本研究還發(fā)現(xiàn)在肝癌細胞內(nèi)HMMR的表達變化可以引起MEK/ERK信號通路活性的改變；且MEK抑制劑可以明顯減弱高表達HMMR所引起的細胞遷移侵襲能力的增加，以及MEK和ERK磷酸化水平的升高，證實HMMR可通過調(diào)控MEK/ERK信號通路參與調(diào)控肝癌細胞的遷移侵襲。MEK/ERK信號通路是絲裂原活化蛋白激酶級聯(lián)反應的經(jīng)典通路，也是研究最多的激酶通路，其在腫瘤細胞的遷移和轉(zhuǎn)移過程中有著不可或缺的作用。本研究結(jié)果證實HMMR在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中的關鍵作用，同時也揭示HMMR促進肝癌細胞轉(zhuǎn)移的潛在分子機制，為探索肝癌新型分子標記物以及預防肝癌侵襲轉(zhuǎn)移新方法提供一定的理論依據(jù)。