劉程煜，趙娟娟，王亞玲，李思雨，徐 衎，任栓成，高 東，唐 玲

400050 重慶，重慶醫(yī)科大學附屬康復醫(yī)院1；401331 重慶，重慶醫(yī)科大學附屬大學城醫(yī)院神經科2；400038 重慶，陸軍軍醫(yī)大學(第三軍醫(yī)大學)基礎醫(yī)學院生理學教研室3；400042 重慶，陸軍特色醫(yī)學中心醫(yī)學心理科4

應激是機體處于各種不利情況下所表現(xiàn)出的一種狀態(tài)，這種狀態(tài)有助于機體在短時間內處理各種突發(fā)事件。應激涉及自主行為變化和神經內分泌(即下丘腦-垂體-腎上腺軸)系統(tǒng)的激活。在急性暴露于應激事件中，個體除了表現(xiàn)出焦慮、恐懼等特定的行為變化外，其正常的睡眠覺醒行為受到明顯影響,包括入睡困難、早醒、睡眠片段化等睡眠障礙，從而增加失眠的風險。覺醒系統(tǒng)過度激活與應激所致的睡眠障礙疾病密切相關。既往研究表明，下丘腦室旁核促腎上腺皮質激素釋放激素神經元、外側下丘腦神經降壓素神經元促食欲素神經元等覺醒系統(tǒng)神經元在應激狀態(tài)下被激活，參與應激條件下的覺醒調節(jié)。因此，研究急性應激下涉及的大腦相關覺醒系統(tǒng)活動的改變，有助于更好地闡明應激導致的睡眠覺醒異常的神經機制。

丘腦中線核團是覺醒上行網狀激活系統(tǒng)的重要組成部分，包括丘腦室旁核(paraventricular thalamic nucleus，PVT)、中央內側核(central medial thalamic nucleus，CM)、連接核(reuniens thalamic nucleus，Re)及菱形核(rhomboid thalamic nucleus，Rh)等。其中PVT位于丘腦中線核團的背側，是控制覺醒的關鍵丘腦區(qū)域。激活PVT谷氨酸能神經元可誘導從睡眠到覺醒的快速轉換，而抑制PVT可導致覺醒水平降低。PVT被認為是整合應激相關信號的重要節(jié)點，受各種應激源強烈激活從而引起適應性行為反應。PVT向大腦多個區(qū)域發(fā)出廣泛投射，包括伏隔核、杏仁核、終紋床核和前額葉皮層等。值得注意的是，中央杏仁核(central amygdala，CeA)作為杏仁核信號的輸出核團，在應激、先天性恐懼和焦慮行為中發(fā)揮重要作用。然而，PVT-CeA通路在應激過程中如何變化仍不清楚。

因此，本研究將野生型小鼠暴露于捕食者氣味——2,4,5-三甲基噻唑(2,4,5-trimethylthiazole，TMT)中，建立急性應激模型，以揭示中線丘腦中參與急性應激反應的核團及其與CeA的神經通路。首先，我們在CeA注射逆行示蹤染料揭示中線丘腦對CeA的神經投射特點。隨后通過c-Fos表達作為神經元激活的標志物，對中線丘腦相關核團和杏仁核激活水平進行量化。最后采用染料逆行標記結合c-Fos染色及神經通路特異性的光纖鈣信號記錄研究CeA投射-PVT神經元在TMT刺激下的c-Fos表達模式和鈣活動變化。本研究試圖明確PVT對CeA的投射是否構成應激反應的神經通路，從而有助于理解應激源暴露時PVT涉及的神經通路改變。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級健康雄性C57BL/6J野生型小鼠(8～12周齡，體質量25～30 g)購自陸軍軍醫(yī)大學實驗動物中心。購買后小鼠適應性喂養(yǎng)1周，飼養(yǎng)環(huán)境符合標準實驗室條件，水和食物自由獲得。整個實驗過程保持12 h光/暗循環(huán)。實驗過程符合國家和有關單位實驗動物管理和使用的規(guī)定，盡可能降低小鼠的痛苦和數(shù)量。

1.1.2 主要試劑 兔多克隆抗c-Fos抗體(ab190289，1∶1 000，美國Abcam)、驢抗兔488熒光二抗(A-21206，1∶800，美國Invitrogen)、免疫染色封閉液(P0102，上海碧云天)、免疫染色一抗稀釋液(P0103，上海碧云天)、免疫染色二抗稀釋液(P0265，上海碧云天)、2,4,5-三甲基噻唑(T1068，上?；晒I(yè))、AAV-EF1α-DIO-GCaMp7b(PT-1423，武漢樞密)、AAV/retro-Syn-Cre(PT-0136，武漢樞密)、CTB555(C34776，1mg/μL，美國Lumaflouor)、RetroBeads(R180-1000，美國Lumaflouor)、核染料4，6-二脒基-2-苯基吲哚(Nuclear dye 4，6-Diamidino-2-phenylindole，DAPI，F(xiàn)6057，美國Sigma-Aldrich)。

1.2 方法

1.2.1 動物手術 野生型小鼠經異氟烷充分麻醉后，將其頭部固定于腦立體定位儀上。剪去小鼠頭頸部毛發(fā)，消毒手術區(qū)，沿中線剪開頭皮，范圍以充分暴露顱骨前囟和后囟為宜。清理顱骨表面結締組織后，在手術顯微鏡下通過調整腦立體定位儀的雙側耳桿和鼻夾，使小鼠顱骨表面處于同一平面。參考第8版小鼠腦圖譜，確定注射坐標PVT腦區(qū)(Bregma，AP=-1.20 mm；ML=0 mm；DV=-2.52 mm)、CeA腦區(qū)(Bregma，AP=-1.20 mm；ML=±2.80 mm；DV=-4.00 mm)。用顱骨鉆在小鼠目標腦區(qū)上方鉆1個直徑約為1 mm的小孔。手術顯微鏡下看到腦組織表面后，清理周圍碎骨，挑開硬腦膜。用開口直徑約為20 μm的玻璃微電極將病毒或染料緩慢推進至目標腦區(qū)。停留5 min后開始注射，注射速度為30 nL/min。為了防止液體回吸，注射完成后將玻璃微電極留置10 min后再緩慢退出。消毒縫合創(chuàng)口，待小鼠復蘇后，單籠飼養(yǎng)。

對于光纖鈣信號記錄，小鼠注射病毒3周后進行PVT光纖埋置，PVT 坐標同病毒注射。當光纖的尖端置于腦組織表面時，開始探測鈣信號。緩慢植入光纖，實時觀察鈣信號變化。下降深度約為2.80～2.90 mm，待鈣信號穩(wěn)定且信噪比大于5%后停止下降光纖。清除顱骨表面血液，用紫外固化牙科水泥在光纖周圍及顱骨表面均勻涂抹。待牙科水泥完全固定后， 消毒縫合創(chuàng)口。注射CTB555或RetroBeads逆行示蹤劑后，需讓其充分逆行標記3～5 d后才進行相應的實驗。對于注射位點不準確的小鼠，不納入統(tǒng)計分析。

1.2.2 行為學實驗 對于免疫熒光染色實驗，將10 μL的TMT滴加到2 cm×2 cm濾紙上，隨后放入到實驗小鼠的家籠里。對照組則是在相同大小的濾紙上將滴入等體積生理鹽水。1.5 h后灌注取腦，進行免疫熒光染色；對于光纖鈣信號記錄，先將小鼠放到曠場里，適應周圍環(huán)境3 min后，將滴有10 μL TMT的棉簽放在小鼠鼻子前面3 s，每只小鼠連續(xù)重復至少3次，記錄期間的鈣信號變化，并由頂端的紅外攝像頭所記錄。

在進行行為學實驗前3 d，每天將小鼠移至行為實驗室，并對小鼠進行10 min適應性撫摸、提尾等操作。為了避免晝夜節(jié)律帶來的影響，所有行為學實驗都在同一時間段進行。

1.2.3 免疫組織化學 c-Fos是一種即時早期基因，其產物c-Fos蛋白在各種因素刺激下常常表達增加，可作為神經元激活的分子標志物。對于c-Fos免疫熒光染色實驗，在行為學實驗結束后，小鼠經異氟烷充分麻醉，用50ml磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution，PBS)和50 mL 4%多聚甲醛溶液(paraformaldehyde，PFA)對小鼠進行心臟灌注。取下大腦，放置于4%PFA中后固定6 h，隨后浸泡在30%蔗糖溶液中直至沉底。用冰凍切片機連續(xù)切片，厚度為30 μm。取每只小鼠相同層面的腦切片，先用PBS漂洗10 min×3次，隨后加入封閉液在室溫下封閉30 min，封閉完成后在一抗稀釋液中，按1∶1 000加入兔多克隆抗c-Fos抗體。4 ℃過夜，第2天用PBS漂洗10 min×3次，隨后加入驢抗兔488熒光二抗，室溫下孵育2 h，孵育結束后，用PBS漂洗10 min×3次，DAPI染色封片。GCaMp7b通過自身熒光識別，無需抗體標記。用蔡司熒光顯微鏡拍攝目標腦區(qū)，高分辨率圖像應用 Zeiss LSM800 共聚焦顯微鏡拍攝。每只小鼠腦區(qū)取6張腦片進行統(tǒng)計。

1.2.4 光纖鈣信號數(shù)據分析 使用Inper Technology提供的腳本以40 Hz記錄光纖鈣信號。光纖鈣信號的變化由ΔF/F=(F-F0)/F0公式計算。對原始數(shù)據采用基線矯正、噪聲扣除和濾波處理。使用最小二乘回歸法從488 nm信號中扣除410 nm信號。使用多項式擬合校正來減小長期記錄造成的漂白效應。

1.3 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據均以表示。使用GraphPad Prism 8.0.1軟件進行統(tǒng)計分析。兩組間比較采用獨立樣本

t

檢驗、配對

t

檢驗。如果數(shù)據未通過Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗，則采用非參數(shù)檢驗。

P

<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 逆行染料示蹤顯示中線丘腦核團中投射到中央杏仁核的神經元

為研究丘腦中線核團與CeA可能存在的神經連接，利用逆行染料示蹤技術，在野生型小鼠CeA中注射CTB555，從而特異性追蹤投射到CeA的丘腦中線核團。經過3～5 d的表達后，對丘腦中線核團的胞體及CeA的注射位點進行檢驗。

結果顯示，CTB555注射在CeA中且丘腦中線核團的神經元被CTB55標記，這些被標記的神經元主要集中在第三腦室下方的PVT腦區(qū)，且沿PVT腦區(qū)前中后軸都有分布。此外，少數(shù)丘腦中線核團投射到CeA的神經元分布在CM、Rh/Re腦區(qū)中部(圖1)。這一結果表明存在丘腦中線核團到CeA的投射，且主要為PVT投射到CeA。

A：CTB555注射示意圖；B：CTB555注射到CeA典型圖；C：小鼠CeA注射CTB555后逆追到丘腦中線核團中神經元(紅色)和DAPI(藍色)的代表性圖像，PVT、CM、Rh/Re區(qū)域，比例尺為100μm；右下：對PVT、CM、Rh/Re區(qū)域標記到的神經元進行放大，比例尺為20μm

2.2 急性應激對小鼠丘腦中線核團及杏仁核的c-Fos表達影響

為研究丘腦中線核團及杏仁核在急性應激下的神經元活動模式，通過免疫熒光染色方法來構建上述核團在急性應激下的c-Fos表達圖譜。急性TMT暴露90 min后，免疫熒光結果顯示：與生理鹽水組相比，小鼠急性暴露于TMT應激下的丘腦中線核團及杏仁核的c-Fos表達明顯增加(表1)。進一步對中線丘腦核團進行分區(qū)發(fā)現(xiàn)，急性暴露于TMT應激下，PVT腦區(qū)的c-Fos表達顯著增加(

P

<0.01)；CM、Rh/Re腦區(qū)的c-Fos表達水平有增加的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(圖2)。對杏仁核亞群進行區(qū)分發(fā)現(xiàn)，急性暴露于TMT應激下，CeA神經元的c-Fos表達顯著增加(

P

<0.05)，而相鄰的基底外側杏仁核(basolateral amygdala，BLA)神經元c-Fos表達無明顯變化(圖1)。

A:急性暴露于捕食者氣味應激示意圖：B：小鼠急性暴露于生理鹽水和捕食者氣味后的c-Fos(綠色)和DAPI(藍色)免疫熒光染色的代表性圖像，標記了PVT、CM、Rh/Re區(qū)域；C：根據第8版小鼠腦圖譜進行c-Fos量化，在急性暴露于生理鹽水(黑色)和捕食者氣味(紅色)后，PVT、CM、Rh/Re中的c-Fos表達數(shù)量 a: P<0.01，與生理鹽水組比較

表1 急性暴露于捕食者氣味后小鼠丘腦中線核團及杏仁核c-Fos表達

中線丘腦杏仁核組別nPVTCMRh/ ReBLACeA生理鹽水組4172.30±31.2329.75±8.85438.75±17.5271.00±33.1922.5±5.172捕食者氣味組4392.50±50.2852.00±15.5048.25±13.1679.25±12.4595.25±23.35統(tǒng)計值t(6)=3.721t(6)=1.247t(6)=0.1242t(6)=0.2328t(3.294)=3.042P值0.0098b0.25900.90520.82370.0494a

a: <0.05，b：<0.01，與生理鹽水組比較

A：小鼠急性暴露于生理鹽水和捕食者氣味后的c-Fos(綠色)和DAPI(藍色)免疫熒光染色的代表性圖像，標記了BLA和CeA區(qū)域；B：根據第8版小鼠腦圖譜進行c-Fos量化，在急性暴露于生理鹽水(黑色)和捕食者氣味(紅色)后，BLA和CeA中的c-Fos表達數(shù)量 a: P<0.05，與生理鹽水組比較

2.3 急性應激對CeA投射-PVT神經元c-Fos表達的影響

鑒于PVT與CeA的解剖連接和功能上的相關性，推測PVT-CeA通路可能在調節(jié)急性應激過程中發(fā)揮重要作用。目前PVT-CeA通路是否參與急性應激過程中尚未明確，因此本研究通過c-Fos免疫熒光染色方法結合逆行示蹤技術檢測PVT-CeA通路在急性應激刺激下的激活程度。

在CeA腦區(qū)注射逆行示蹤劑RetroBeads，3～5 d后，將小鼠暴露于TMT應激模式下，隨后對PVT腦區(qū)進行c-Fos免疫熒光染色。對于注射位置準確的小鼠，分別統(tǒng)計RetroBeads+神經元的數(shù)量和c-Fos+/RetroBeads+神經元的共標百分比(圖4)。結果顯示，PVT-CeA通路中RetroBeads+神經元在暴露于TMT氣味后被激活的比例顯著高于生理鹽水組(

P

<0.05)，表明CeA投射-PVT神經元能被急性暴露于TMT刺激所激活。

2.4 急性應激對CeA投射-PVT神經元鈣活動的影響

光纖鈣信號記錄技術可以瞬時反應自由活動小鼠腦區(qū)群體神經元的鈣信號變化，因此我們通過檢測鈣信號的變化來表征神經元的活動，進而實時研究神經元活動與動物行為的相關性。

進一步采用光纖鈣信號記錄的方法研究在體條件下，CeA投射-PVT神經元集群的鈣信號在急性應激狀態(tài)下的活動模式。利用腦立體定位注射技術在野生型小鼠的PVT注射AAV-EF1α-DIO-GCaMp7b病毒，在雙側CeA注射AAV/retro-Syn-Cre病毒，從而特異性感染CeA投射-PVT神經元。病毒表達3周后，在小鼠PVT上方埋置光纖，手術恢復1周后，進行行為學實驗。結果表明，CeA投射-PVT神經元被病毒感染并在胞體表達。小鼠暴露于生理鹽水前后，GCaMp7b熒光變化差異無統(tǒng)計學意義；而小鼠暴露于TMT前后，GCaMp7b熒光在基礎波動范圍內顯著增加(

P

<0.01，圖5)。進一步對比兩種刺激的ΔF/F值發(fā)現(xiàn)，急性暴露于TMT刺激的ΔF/F顯著高于暴露于生理鹽水的ΔF/F值(

P

<0.01)，表明急性暴露于TMT下，顯著激活了CeA投射-PVT神經元。

A：RetroBeads注射示意圖; B：RetroBeads注射到CeA典型圖；C：小鼠c-Fos(綠色)和CeA投射-PVT神經元(紅色)的代表性圖像，PVT區(qū)域；右下：對PVT區(qū)域共標的神經元進行放大；D：根據第8版小鼠腦圖譜進行c-Fos量化，在急性暴露于生理鹽水和捕食者氣味后，PVT-CeA神經元(紅色)中的c-Fos表達百分比(黃色)。 a: P<0.05，與生理鹽水組比較

3 討論

應激神經通路的激活有助于動物在不利的環(huán)境條件下啟動生理和防御行為反應。然而參與應激的神經通路長期處于激活狀態(tài)對機體是有害的，能引起一系列神經精神疾病，包括創(chuàng)傷后應激障礙、病理性焦慮、失眠等。因此，理解參與應激的神經網絡，不僅可以促進研究者對應激狀態(tài)下內部神經通路調節(jié)的認識，還有助于開發(fā)神經精神疾病治療的新策略。PVT作為應激反應中覺醒調節(jié)的整合點，接受如下丘腦室旁核、腦干藍斑等在調控覺醒和應激方面都至關重要腦區(qū)的大量投射。PVT的不同下游纖維投射對覺醒調控有著不同的作用，其中PVT-終紋床核通路參與調節(jié)饑餓應激下的覺醒水平。值得注意的是，杏仁核是調控情感行為的重要樞紐，CeA作為杏仁核的主要輸出部位，整合應激相關信息后輸出至下丘腦、腦干等腦區(qū)調控應激反應。PVT向CeA發(fā)出大量投射，目前大部分的PVT-CeA通路的研究集中在焦慮和恐懼行為上，PVT與 CeA的神經結構連接與急性應激的關聯(lián)仍不清楚。因此，對PVT-CeA通路在急性應激下的激活情況研究仍較少。

大多數(shù)嚙齒類動物應激模型都通過暴露于單一的應激源來建立。TMT是一種模擬狐貍尿氣味的化合物，被廣泛用于嚙齒類動物應激模型的建立。嚙齒類動物接觸TMT時，能引起焦慮和恐懼情緒的改變并觸發(fā)防御行為，因此捕食者氣味暴露是誘發(fā)嚙齒類

A：急性暴露于捕食者氣味同步光纖鈣信號記錄工作原理示意圖；B：AAV-EF1α-DIO-jGCaMp7b、AAV/retro-Syn-Cre病毒注射示意圖；C：jGCaMp7b-表達CeA投射-PVT神經元及光纖埋置位置典型圖；D：急性暴露于捕食者氣味前后CeA投射-PVT神經元鈣信號波形示意圖；E.急性暴露于捕食者氣味前后CeA投射-PVT神經元鈣信號熱圖；F：定量分析急性暴露于捕食者氣味前后CeA投射-PVT神經元集群鈣信號幅度變化百分比。a: P<0.01，與生理鹽水組比較；b：P<0.01，與暴露于TMT前比較

動物應激有效的方式之一。本研究將小鼠急性暴露于TMT中作為一種強烈的應激范式。一些研究表明，TMT作為一種厭惡性刺激，而不是恐懼性刺激。事實上，與厭惡性氣味相比，TMT確實會引發(fā)防御行為，比如回避，防御性掩埋等。然而TMT作為單一的氣味分子可能不會引起與自然捕食者氣味相同的行為和神經生物學反應。因此，TMT暴露適合作為一個在嚙齒類動物中誘發(fā)不可控應激的模型。

本研究發(fā)現(xiàn)小鼠急性暴露于TMT應激下，丘腦中線核團中PVT腦區(qū)的c-Fos表達顯著增加；而在杏仁核中，CeA神經元的c-Fos表達顯著增加，而BLA神經元c-Fos表達無明顯變化。PVT作為丘腦中線核團的一部分，在調節(jié)覺醒功能和應激行為反應方面發(fā)揮著重要作用。既往研究證明，嚙齒動物PVT在不同類型的應激條件下都能顯著激活。杏仁核作為邊緣系統(tǒng)一部分，與機體面對應激反應時產生的恐懼、焦慮情緒和防御反應相關行為有關。研究表明，應激情況下會引起特定杏仁核亞群長期形態(tài)和功能的改變。然而，在SOTNIKOV等研究中發(fā)現(xiàn)小鼠暴露于TMT中主要在BLA中c-Fos表達增加，而對CeA中的c-Fos表達無明顯影響。本研究結果與上述研究之間的差異可能是由于小鼠品系不同，應激源暴露和組織取材的時間不同造成的差異。首先，不同品系的小鼠對同一應激源可導致不同的內分泌和行為反應；此外，本研究將小鼠急性暴露于TMT中60 min后立刻取材，盡管c-Fos蛋白染色常用于作為一種標記神經元激活的方法，但該技術存在一定的時間局限性。c-Fos蛋白從開始表達到表達高峰需要一定的時間。一方面，盡管c-Fos水平越高表明激活程度越高，但某些神經元中c-Fos的表達缺失并不一定意味著激活的缺失。另一方面，無法確定在c-Fos誘導之前及誘導期間，一些其他行為或內在狀態(tài)對c-Fos表達帶來的偏倚。這些實驗方法的不同可以解釋本研究結果與其他研究結果之間的差異。值得注意的是，本研究結果與其他一些研究一致，JANITZKY等研究發(fā)現(xiàn)，野生性C57小鼠急性暴露于TMT應激下，CeA腦區(qū)c-Fos表達顯著增加。而在YANG等研究中發(fā)現(xiàn)TMT暴露可特異性誘導小鼠PVT、CeA腦區(qū)大量c-Fos表達，而對BLA無明顯影響。此外，本研究采用時間分辨率更高的光纖鈣信號記錄技術來研究CeA投射-PVT神經元對急性暴露于TMT的激活情況，且研究結果與上述等人c-Fos實驗結果一致，進一步表明丘腦室旁核、中央杏仁核過度活躍與急性暴露于TMT應激有關。

本研究表明，丘腦中線核團中大量PVT神經元投射到CeA。一些研究發(fā)現(xiàn)，與BLA相比，PVT神經元主要投射到CeA，且PVT可調節(jié)CeA神經元的興奮性從而影響恐懼抑郁樣行為。本研究中，急性暴露于TMT下引起PVT、CeA明顯的c-Fos激活，提示該應激下可能通過激活PVT神經元及其投射到CeA的神經末梢，從而直接激活CeA的神經元起作用。鑒于PVT-CeA通路的解剖基礎，且CeA和PVT在功能上的相關性，PVT與CeA的神經通路活動變化在急性TMT應激狀態(tài)下仍不清楚。本研究利用免疫熒光染色和光纖鈣信號記錄實驗，研究PVT-CeA通路在急性TMT應激狀態(tài)下的激活程度。結果表明，CeA投射-PVT神經元能被急性暴露于TMT刺激激活，鈣信號記錄實驗也證實了這一點，提示該通路密切參與急性TMT應激過程。

值得注意的是，本研究工作仍存在一定的局限性。CeA中主要由γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)能神經元組成，這些GABA能神經元表達多種肽類物質。如促腎上腺皮質激素釋放激素(corticotropin-releasing factor，CRF)、蛋白激酶C-δ、生長抑素(somatostatin，SOM)或神經降壓素等。已知PVT與CeA-SOM和CeA-CRF神經元形成突觸聯(lián)系，但在急性暴露于TMT應激研究中本研究未對PVT-CeA通路中具體的分子標志物進行驗證，這需要我們進一步的研究。其次，本研究主要在雄性小鼠上進行研究，沒有驗證雌性小鼠急性暴露于TMT應激時對PVT-CeA通路的影響。應激反應具有性別二態(tài)性，提示雌性小鼠在未來相關工作中的重要性。此外，本研究未使用光遺傳學、化學遺傳學等技術手段來驗證PVT-CeA通路的功能充分性和必要性。

綜上所述，本研究結果表明PVT-CeA通路在急性暴露于TMT應激反應中被激活，PVT到CeA神經通路的詳細解析將為壓力應激相關疾病的發(fā)生發(fā)展提供理論依據和新的治療策略。