鮑巖巖 時(shí)宇靜 高英杰 周利潤(rùn) 耿子涵 姚榮妹 郭姍姍 包 蕾 韓 冰 葛一蒙 崔曉蘭

(1 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所,北京,100700; 2 黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司,虎林,158400)

副流感病毒由于其諸多特性與流感病毒不同,故命名為副流感病毒。仙臺(tái)病毒屬于乙型副流感病毒,1959年在日本仙臺(tái)市從死于肺炎患者的肺液中獲得,是呼吸道感染性疾病的常見(jiàn)病原體[1-2]。副流感病毒是常常引起兒童、老人及免疫缺陷人群下呼吸道感染,其致病性僅次于呼吸道合胞病毒。復(fù)方芩蘭口服液由金銀花、黃芩、連翹、板藍(lán)根4味中藥組成,金銀花清熱解毒,疏風(fēng)解表為君藥;黃芩清熱燥濕,瀉火解毒,用于外部熱邪入肺引起肺熱咳嗽,高熱煩渴,可以助君藥清熱解毒為臣藥;板藍(lán)根清熱解毒,涼血消腫;連翹清熱解毒,消腫散結(jié),均可用于外邪入里入血而引起高熱不退以及熱毒蘊(yùn)結(jié)于肺而造成的咳嗽胸痛等肺部感染癥狀。二者均可協(xié)助臣藥清熱解毒,散結(jié)消腫,對(duì)外毒內(nèi)侵造成的肺部病變有較好的消腫抗炎和修復(fù)能力。四藥合用,共奏辛涼解表,清熱解毒之功效。臨床報(bào)道其治療急性上呼吸道感染的整體療效較好,且具有較好的安全性[3-6]。為了進(jìn)一步研究復(fù)方芩蘭口服液防治副流感病毒感染的作用,本課題組采用副流感病毒(仙臺(tái)株)感染美國(guó)癌癥研究所(Institute of Cancer Research,ICR)小鼠模型,評(píng)價(jià)復(fù)方芩蘭口服液對(duì)副流感病毒感染治療作用,研究結(jié)果為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選取3周齡無(wú)特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級(jí)ICR小鼠70只,雌雄各半,體質(zhì)量13～15 g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,許可證號(hào):SCXK(京)2016-0006。飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所ABSL-2生物安全實(shí)驗(yàn)室,溫度18～29 ℃,日溫差≤3 ℃,相對(duì)濕度40%～70%,新鮮空氣換氣次數(shù)10次/h,噪聲≤60 dB,照度150～300 Lux。本研究所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批號(hào):2019D025)。

1.1.2 病毒毒株 副流感病毒(仙臺(tái)株)購(gòu)自美國(guó)典型菌種保藏中心(ATCC),由本ABSL-2生物安全實(shí)驗(yàn)室常規(guī)傳代,在-80 ℃環(huán)境保存。

1.1.3 藥物 復(fù)方芩蘭口服液(黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司,批號(hào):B14190506);利巴韋林顆粒(四川百利藥業(yè)有限責(zé)任公司,批號(hào):190106);疏風(fēng)解毒膠囊(安徽濟(jì)人藥業(yè)有限公司,批號(hào):2190504)。

1.1.4 試劑與儀器 甲醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):F20180825);裂解液(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào):20191211);小鼠趨化因子(9因子混合)多因子檢測(cè)試劑盒(Luminex公司,美國(guó),批號(hào):218355-001)。A2型生物安全柜(Thermo公司,美國(guó),型號(hào):Thermo MSC1.8);電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司,型號(hào):YP1002);電子天平(梅特勒-托利多儀器公司,型號(hào):AL204);IVC小鼠飼養(yǎng)籠(蘇州馮氏股份有限公司,型號(hào):ZJ-4);低溫高速離心機(jī)(Eppendorf公司,德國(guó),型號(hào):5810R)。

1.2 方法

1.2.1 劑量設(shè)計(jì) 復(fù)方芩蘭口服液成人臨床常規(guī)用量為60 mL/(kg·d),換算為小鼠高、中、低等效劑量為22 mL/(kg·d)、11 mL/(kg·d)、5.5 mL/(kg·d),分別相當(dāng)于人臨床用量的2倍、等倍及1/2倍,小鼠按20 mL/(kg·d)灌胃給藥,1次/d。利巴韋林顆粒成人臨床常規(guī)用量為450 mL/(60 kg·d),換算為小鼠等效劑量為82.5 mL/(kg·d),小鼠按20 mL/(kg·d)灌胃給藥,1次/d。疏風(fēng)解毒膠囊成人臨床常規(guī)用量為6.24 g/(60 kg·d),換算為小鼠等效劑量為1.144 g/(kg·d),小鼠按20 mL/(kg·d)灌胃給藥,1次/d。

1.2.2 復(fù)方芩蘭口服液對(duì)副流感病毒(仙臺(tái)株)感染小鼠模型肺指數(shù)的影響 70只ICR小鼠,按體質(zhì)量隨機(jī)分為7組:正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、利巴韋林組、疏風(fēng)解毒膠囊組、復(fù)方芩蘭口服液高、中、低劑量組,每組10只,雌雄各半。除正常對(duì)照組外,其他各組小鼠乙醚輕度麻醉后,滴鼻感染100TCID50副流感病毒(仙臺(tái)株),45 μL/只。各組小鼠于感染后給予相應(yīng)的藥物,正常對(duì)照組、模型對(duì)照組在同等條件下給予蒸餾水,連續(xù)給藥4 d。第5天,小鼠稱重后眼眶取血并分離血清,分離肺組織后稱量肺重,肺組織分為2部分:一部分提取肺組織蛋白進(jìn)行多因子高通量檢測(cè),另一部分肺組織用10%甲醛溶液固定后進(jìn)行組織病理學(xué)檢測(cè)。計(jì)算肺指數(shù)及抑制率,肺指數(shù)=肺濕重(g)/體質(zhì)量(g)×100,抑制率(%)=(模型組肺指數(shù)-給藥組肺指數(shù))/(模型組肺指數(shù)-正常對(duì)照組肺指數(shù))×100%。

1.2.3 復(fù)方芩蘭口服液對(duì)副流感病毒(仙臺(tái)株)感染小鼠模型病理改變的影響 固定于10%甲醛溶液中的肺組織,48 h后取出流水沖洗,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,浸蠟包埋,切片,蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin，HE)染色,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察、照相。光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)改變。鏡下觀察標(biāo)準(zhǔn)如下，“-”:小鼠肺組織及肺泡、肺組織內(nèi)細(xì)支氣管周圍及腔內(nèi)未見(jiàn)有明顯病變,結(jié)構(gòu)正常。“+”:小鼠肺組織間質(zhì)有輕度少量滲出液,病變較局限,肺內(nèi)細(xì)支氣管周圍、腔內(nèi)未見(jiàn)有炎癥反應(yīng)?！?+”:小鼠肺組織間質(zhì)有明顯炎癥反應(yīng),肺泡間質(zhì)有輕度滲出性水腫,少部分肺間隔有輕度融合,肺內(nèi)細(xì)支氣管周圍有滲出性炎癥反應(yīng),腔內(nèi)未見(jiàn)有炎癥反應(yīng)?！?++”:小鼠肺內(nèi)組織間質(zhì)大面積炎癥滲出,大量炎癥反應(yīng)細(xì)胞滲出,以淋巴為主、少量中性分葉核;肺間隔明顯水腫、淤血,大量血漿滲出,并有淤血;肺內(nèi)先支氣管周圍炎癥反應(yīng)明顯,有部分細(xì)支氣管內(nèi)有脫落炎癥反應(yīng)。

1.2.4 復(fù)方芩蘭口服液對(duì)副流感病毒(仙臺(tái)株)感染小鼠模型血清免疫因子生長(zhǎng)調(diào)節(jié)癌基因-α(Growth-regulated Oncogene-α,GRO-α)、誘導(dǎo)蛋白-10(Induced Protein-10，IP-10)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(Monocyte Chemotactic Protein-1,MCP-1)、MCP-3、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1α(Macrophage Inflammatory Protein-1α,MIP-1α)、MIP-1β、RANTES的影響全血靜置分層后,3 500×g離心15 min,上層清液采用小鼠趨化因子(9因子混合)多因子檢測(cè)試劑盒檢測(cè)小鼠血清。

1.2.5 復(fù)方芩蘭口服液對(duì)副流感病毒(仙臺(tái)株)感染小鼠模型肺組織免疫因子的影響 稱量30 mg肺組織,剪碎,加入1 mL裂解液,超聲裂解,4 ℃,10 000×g離心30 min,上清液采用Mouse Chemokine Panel 1(9 plex)多因子檢測(cè)試劑盒檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方芩蘭口服液對(duì)副流感病毒(仙臺(tái)株)感染小鼠模型肺指數(shù)的影響 與正常對(duì)照組比較,模型對(duì)照組肺指數(shù)顯著增加(P<0.01);與模型對(duì)照組比較,復(fù)方芩蘭口服液高劑量組肺指數(shù)顯著降低(P<0.05),高、中、低劑量組肺指數(shù)抑制率分別為49.47%、29.68%、18.46%,且抑制率顯示出了量效關(guān)系。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 復(fù)方芩蘭口服液對(duì)副流感病毒(仙臺(tái)株)感染小鼠模型肺指數(shù)的影響(n=10)

2.2 復(fù)方芩蘭口服液對(duì)副流感病毒(仙臺(tái)株)感染小鼠模型病理改變的影響 正常對(duì)照組肺組織內(nèi)肺泡未見(jiàn)有融合,肺間質(zhì)未見(jiàn)有明顯炎癥反應(yīng)、水腫,血管內(nèi)未見(jiàn)有淤血;肺內(nèi)細(xì)支氣管周圍及腔內(nèi)未見(jiàn)有炎癥反應(yīng)滲出,氣管黏膜未見(jiàn)有脫落,組織結(jié)構(gòu)正常。模型對(duì)照組部分肺組織內(nèi)肺泡有片狀融合,肺組織間質(zhì)有滲出性炎性腫脹,血漿滲出液粉色,滲出細(xì)胞以小淋巴細(xì)胞及B細(xì)胞為主,有少量中性分葉核、大量紅細(xì)胞滲出,有淤血。肺內(nèi)細(xì)支氣管周圍大面積炎癥反應(yīng)浸潤(rùn),部分腔內(nèi)有炎癥脫落;與正常對(duì)照組比較,模型對(duì)照組肺部及支氣管病變顯著(P<0.01)。復(fù)方芩蘭口服液高、中、低劑量組肺組織炎癥反應(yīng)滲出、水腫,病變,與模型對(duì)照組比較有改善;與模型對(duì)照組比較,復(fù)方芩蘭口服液高、中劑量組支氣管病變顯著改善(P<0.05)。見(jiàn)表2,圖1。

表2 復(fù)方芩蘭口服液對(duì)副流感病毒(仙臺(tái)株)感染小鼠模型病理改變的影響(n=10)

圖1 復(fù)方芩蘭口服液對(duì)副流感病毒(仙臺(tái)株)感染小鼠模型病理改變的影響(HE染色)

2.3 復(fù)方芩蘭口服液對(duì)副流感病毒(仙臺(tái)株)感染小鼠模型血清免疫因子的影響 與正常對(duì)照組比較,模型對(duì)照組血清免疫因子GRO-α、IP-10、MCP-1、MCP-3、MIP-1α、MIP-1β、RANTES含量顯著增加(P<0.01);與模型對(duì)照組比較,復(fù)方芩蘭口服液高劑量組血清免疫因子IP-10、MCP-3、MIP-1α、RANTES、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子含量顯著降低(P<0.05),復(fù)方芩蘭口服液中劑量組血清免疫因子MCP-3含量顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.4 復(fù)方芩蘭口服液對(duì)副流感病毒(仙臺(tái)株)感染小鼠模型肺組織免疫因子的影響 與正常對(duì)照組比較,模型對(duì)照組肺組織免疫因子GRO-α、IP-10、MCP-1、MCP-3、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2、RANTES含量顯著增加(P<0.01);與模型對(duì)照組比較,復(fù)方芩蘭口服液高劑量組肺組織免疫因子GRO-α、MCP-1、MCP-3、MIP-2、IP-10、MIP-1α、MIP-1β、RANTES含量顯著降低(P<0.05,P<0.01),中劑量組肺組織免疫因子GRO-α、MCP-1、MCP-3、MIP-2含量顯著降低(P<0.05,P<0.01),低劑量組肺組織免疫因子GRO-α含量顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表4。

3 討論

副流感病毒是單股負(fù)鏈的RNA病毒,屬副粘病毒科。副流感病毒感染屬于直接細(xì)胞毒性引起的呼吸道炎癥反應(yīng),病毒在呼吸道上皮細(xì)胞引起宿主反應(yīng),被感染的細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)調(diào)集炎癥細(xì)胞至感染細(xì)胞處,從而導(dǎo)致疾病[7]。

表4 復(fù)方芩蘭口服液對(duì)副流感病毒(仙臺(tái)株)感染小鼠模型肺組織免疫因子的影響

續(xù)表4 復(fù)方芩蘭口服液對(duì)副流感病毒(仙臺(tái)株)感染小鼠模型肺組織免疫因子的影響

中藥治療副流感病毒感染方面有良好的作用[8-14]。為了評(píng)價(jià)復(fù)方芩蘭口服液在防治副流感病毒感染中的藥效作用,本課題組設(shè)計(jì)了相關(guān)藥效試驗(yàn)。我們利用副流感病毒(仙臺(tái)株)感染ICR小鼠制備小鼠肺炎模型,采用此模型評(píng)價(jià)復(fù)方芩蘭口服液在防治副流感病毒感染中的作用。本研究中,模型組小鼠肺指數(shù)與正常對(duì)照組比較顯著升高,模型對(duì)照組小鼠肺組織及肺部支氣管與正常對(duì)照組比較病變顯著,模型對(duì)照組小鼠肺組織病毒核酸表達(dá)與正常對(duì)照組比較顯著增加;實(shí)驗(yàn)中復(fù)方芩蘭口服液高劑量組肺指數(shù)與模型對(duì)照組比較顯著降低,高、中劑量組肺部支氣管病變與模型對(duì)照組比較顯著改善。病毒感染會(huì)使免疫因子表達(dá)發(fā)生變化,甚至引起免疫因子風(fēng)暴,中醫(yī)藥通過(guò)調(diào)節(jié)免疫因子表達(dá)防治病毒感染性疾病方面有其特有的優(yōu)勢(shì)[15-20]。本研究中,我們采用多因子檢測(cè)試劑盒高通量檢測(cè)小鼠血清及肺組織勻漿中的免疫因子含量,評(píng)價(jià)復(fù)方芩蘭口服液對(duì)免疫因子的影響。

綜上所述,本研究采用副流感病毒(仙臺(tái)株)感染ICR小鼠模型,評(píng)價(jià)了復(fù)方芩蘭口服液防治副流感病毒的作用,并且考察了其對(duì)肺組織及肺支氣管病理改變、血清及肺組織勻漿中免疫因子含量的影響。本研究結(jié)果提示,復(fù)方芩蘭口服液對(duì)副流感病毒感染有一定的治療作用,可以改善肺支氣管病變、降低血清及肺組織免疫因子含量。本研究結(jié)果為臨床用藥提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。