文銘森，鐘鎮(zhèn)東，吳育廉，康信煌，鄧春梅，張國光

（廣東海洋大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣東 湛江 524088）

鱟是重點(diǎn)保護(hù)海洋動物，血液因含有銅離子而顯藍(lán)色，含有多種具備藥用價值的物質(zhì)，其蛋白及其多肽具有生物學(xué)活性，但是體外穩(wěn)定性較差，靶向性也較低，不可被人類直接利用。目前，鱟血多被用于提取鱟素來制備廣泛用于注射液、生物制品等方面的鱟試劑[1]。本研究嘗試用白蛋白對鱟血蛋白進(jìn)行包埋，形成載鱟血蛋白的白蛋白納米粒，以期提高鱟血蛋白的穩(wěn)定性、靶向性以及生物學(xué)活性。

1 材料

1.1 儀器

臺式高速冷凍干燥機(jī)（HR/T20M型，上海田楓實(shí)業(yè)有限公司）；掃描電鏡（MIRA3型，TESCAN泰思肯有限公司）；紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；數(shù)顯恒流泵（HL-2B型，上海瀘西分析儀器廠有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠）；超聲波清洗器（WD-9415B型，北京市六一儀器廠）；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S，河南省予華儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

牛血清白蛋白、鱟血漿粗粉、無水乙醇、25.00%戊二醛溶液、十二水合磷酸氫二鈉、葡聚糖凝膠G-100、考馬斯亮藍(lán)G-250、磷酸二氫鉀、二水合磷酸二氫鈉。

2 方法與結(jié)果

2.1 鱟血脫銅蛋白和水解蛋白的制備

2.1.1 鱟血脫銅蛋白的提取

稱取一定量鱟血漿粗粉于干凈、干燥的25.0 mL錐形瓶中，加入10.0 mL蒸餾水、10.0 mL 0.90% NaCl溶液和3.4 mL pH=6的磷酸鹽緩沖溶液攪拌溶解，蓋上蒸發(fā)皿，在65 ℃的水浴鍋中攪拌25 min后，冷卻至10 ℃，離心1.0 h。取上清液于干凈、干燥的25.0 mL錐形瓶中，加入25.0 mL 0.1 mol/L的EDTA二鈉溶液，蓋上蒸發(fā)皿，在30 ℃水浴鍋中攪拌25 min，再加入與EDTA二鈉溶液體積相同的丙酮溶液，攪拌20 min后離心得沉淀。取沉淀于干凈的錐形瓶中，用10.0 mL蒸餾水清洗離心管，倒入錐形瓶中，加入20.0 mL 0.1 mol/L的EDTA二鈉溶液，蓋上蒸發(fā)皿，然后放入30 ℃水浴鍋中水浴攪拌20 min，后加入與EDTA二鈉溶液體積相同的丙酮溶液，繼續(xù)30 ℃水浴攪拌10 min，然后將溶液倒入離心管中，放入離心機(jī)中離心30 min。將離心管中的上清液倒掉，用蒸餾水稍微沖洗離心管內(nèi)壁，向離心管中加入少許蒸餾水，用玻璃棒將沉淀攪拌混勻，然后用蒸餾水沖洗玻璃棒，并加蒸餾水至離心管的約3/4處，將離心管放入離心機(jī)中離心30 min，重復(fù)這一步驟3次。最后取3次離心后的沉淀，用保鮮膜封口冷凍一晚，再冷凍干燥1天，得到鱟血脫銅蛋白粉末。

2.1.2 鱟血水解蛋白的制備

根據(jù)專利“一種鱟血漿蛋白的水解方法”[2]，取一定量上述粉末加入胰蛋白酶，用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH至8.0，50 ℃恒溫水解攪拌3.0 h后，取上清液過濾，冷凍干燥得鱟血水解蛋白粉末。

2.2 載鱟血水解蛋白-白蛋白納米粒制備方法

分別取50 mg鱟血水解蛋白與100 mg白蛋白，加入4.0 mL磷酸鹽緩沖液（pH=8）攪拌溶解，在溶液渾濁時加入35 μL 25.00%戊二醛，同時，用恒流泵以4 r/min的速度緩慢逐滴加完25.0 mL無水乙醇，待無水乙醇滴完后使用保鮮膜進(jìn)行包封，持續(xù)攪拌得到納米粒溶液[3]。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以納米粒包封率為指標(biāo)，從攪拌時間、磷酸鹽緩沖液pH、攪拌速度等方面探尋最適條件。每個因素采用3個水平，按照L9（33）正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，因素如表1所示，結(jié)果如表2所示。

表1 正交設(shè)計(jì)因素

由表2可知，最優(yōu)納米粒制備條件為A1B2C3，即以磷酸鹽緩沖液pH為9.0、攪拌時間為10.0 h、攪拌速度為1 400 r/min為最佳條件。

表2 正交設(shè)計(jì)結(jié)果分析

2.4 包封率與載藥量的測定方法

2.4.1 樣品的預(yù)處理

用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將樣品中的無水乙醇全部蒸出后，加入適量蒸餾水和少量聚乙二醇超聲，以轉(zhuǎn)速1 200 r/min高速離心，取出全部上清液定容于25.0 mL容量瓶，保留載鱟血蛋白-白蛋白納米粒固體[4]。取2.0 mL上述溶液于G100葡聚糖凝膠柱中分離，分離出游離的鱟血水解蛋白。將分離出來的載鱟血蛋白-白蛋白納米粒固體和游離的鱟血水解蛋白真空冷凍干燥后，得待測鱟血水解蛋白粉末、納米粒粉末。

2.4.2 樣品包封率與載藥量的測定方法

用2.0 mL水充分溶解鱟血水解蛋白粉末，取1.0 mL溶液加入5.0 mL考馬斯亮藍(lán)溶液中，充分反應(yīng)后，用紫外-可見分光光度計(jì)在λ=595 nm處測量，得游離鱟血蛋白質(zhì)量。用電子分析天平稱量納米粒粉末，得納米粒粉末質(zhì)量。計(jì)算公式：

式中：W總為鱟血水解蛋白總藥量，W游為游離鱟血蛋白質(zhì)量，W納米粒為載鱟血水解蛋白-白蛋白納米粒粉末總質(zhì)量，包封率為72.79%±1.16%，載藥量為38.81%±1.36%。

2.4.3 體外釋放實(shí)驗(yàn)

分別稱取一定量載藥納米粒、游離水解蛋白于截留量為70 kDa的透析袋中，加入3.0 mL PBS溶液（pH=7.4），使質(zhì)量濃度達(dá)到20 mg/mL。用透析夾夾緊密封透析袋，將透析袋懸浮于30.0 mL PBS溶液的培養(yǎng)皿內(nèi)，置于恒溫振蕩儀（37 ℃、100 r/min）中，分別在0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、24.0 h準(zhǔn)確取出1.0 mL緩沖液，并及時添加等量37 ℃新緩沖液。取出的1.0 mL溶液用考馬斯亮藍(lán)法、紫外-可見分光光度計(jì)（波長為595 nm）測定吸光度。根據(jù)計(jì)算公式3算出水解蛋白的累積釋放率，得體外釋放曲線（見圖1）。由圖1可知，鱟血水解蛋白溶液于0.5 h后基本被全部釋放；載藥納米粒于3.0 h后開始大量釋放，到12.0 h時基本釋放完成，說明載藥白蛋白納米粒有較好的緩釋效果。

圖1 體外釋放曲線

2.5 納米粒的表征

將制得的載藥納米顆粒放入燒杯中，用保鮮膜密封，超聲2.0 h后冷凍干燥得到樣品，然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，掃描電鏡如圖2所示。由圖2可知，載鱟血水解蛋白-白蛋白納米粒的粒徑大約為500 nm。

圖2 掃描電鏡圖

3 結(jié)語

用去溶劑化法制備載鱟血蛋白-白蛋白納米粒，用白蛋白包埋的方式提高鱟血蛋白作為蛋白類藥物的穩(wěn)定性、靶向性以及生物學(xué)活性。由各單因素設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)可知，載鱟血蛋白-白蛋白納米粒的包封率為72.79%±1.16%、載藥量為38.81%±1.36%，粒徑大部分為500 nm。通過體外釋放實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，載藥納米粒的緩釋作用較好。