弓雪峰，丘曉琳，趙 燁，王 杰

(1. 江南大學(xué) 機(jī)械工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2. 江蘇省食品先進(jìn)制造裝備技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122)

0 引 言

防止氧化酸敗和病原微生物感染造成食品品質(zhì)下降一直是食品工業(yè)界和學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)話題。為了降低被氧化和微生物感染風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)不危害人體健康，人們致力于從各類天然產(chǎn)物中尋找安全有效的抗氧抗菌物質(zhì)用于對食品的保護(hù)。茶多酚是茶葉的天然提取物，由30多種含酚基化合物組成，表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是其中含量最多的單體物質(zhì)和最主要的抗菌活性成分[1]。茶多酚不僅具有多種不同的抗菌機(jī)理[2-3]，同時(shí)其分子結(jié)構(gòu)中的大量酚羥基和獨(dú)特的鄰苯二酚、連苯三酚結(jié)構(gòu)也賦予其優(yōu)異的抗氧化能力[4]，被大量用于油脂、肉類等的保鮮[5-7]。通過一定手段對茶多酚進(jìn)行包覆或固定，可以起到控釋作用，從而控制茶多酚的釋放速度或?qū)崿F(xiàn)特定條件釋放，延長茶多酚的作用時(shí)間，避免不良外部條件對其結(jié)構(gòu)的破壞。研究者們已通過不同手段制備了各種茶多酚的控釋體系。如Chen等[8]制備了一種聚丙烯/聚乙烯醇/聚丙烯(PP/PVA/PP)活性控釋膜，中間PVA層含4%茶多酚，而內(nèi)PP層則具有大量微孔以作為控釋層，通過調(diào)整孔隙大小，可調(diào)節(jié)茶多酚的釋放速率。Liu等[9]用殼聚糖納米粒子對茶多酚進(jìn)行包封，并載入明膠中制備控釋膜，發(fā)現(xiàn)茶多酚在50%乙醇中擴(kuò)散系數(shù)比在95%乙醇(脂肪食品模擬物)中高2個(gè)數(shù)量級(jí)，且釋放速率與包封率成反比。Sanna等[10]采用聚己內(nèi)酯(PCL)-海藻酸鹽納米粒子(NPs)對茶多酚進(jìn)行納米包埋，在保持其抗氧化活性的同時(shí)，降低了在酸性胃液模擬環(huán)境中的釋放率。Hu等[11]通過自組裝兩種多糖索拉膠和N,N,N-三甲基殼聚糖(TMC)開發(fā)了一種聚電解質(zhì)復(fù)合物(PEC)水凝膠，并將茶多酚封裝其中，結(jié)果證明在模擬腸液(pH=6.8)中茶多酚的釋放量顯著高于模擬胃液(pH=1.2)，實(shí)現(xiàn)向腸道靶向輸送茶多酚。

納米氧化鋅具有良好的生物安全性和廣譜抗菌性，已經(jīng)在諸多領(lǐng)域作為抗菌活性成分被廣泛研究和應(yīng)用[12]。同時(shí)納米氧化鋅還可對pH、微波、超聲波等多種外源刺激做出響應(yīng)[13]，因而可被用于智能型藥物控釋載體。不少研究者根據(jù)其對pH值的響應(yīng)特性，制備高比表面積的納米氧化鋅載體，實(shí)現(xiàn)對不同藥物的靶向遞送[14-17]，但用于抗氧抗菌劑茶多酚的搭載研究仍比較少。

本研究以聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物(Poloxamer 188)和蔗糖為模板劑，采用水熱法制備介孔納米氧化鋅載體，搭載天然抗氧抗菌劑茶多酚，制成抗氧抗菌活性納米配合體，克服茶多酚釋放不受控的問題，并對配合體進(jìn)行表征，為其應(yīng)用于活性抗氧抗菌包裝提供理論依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 原 料

六水合硝酸鋅(Zn(NO3)2·6H2O，分析純)、乙酸鋅二水合物((CH2COO)2Zn·2H2O，分析純)、尿素(CO(NH2)2,分析純)、冰乙酸(CH2COOH，分析純)、蔗糖(分析純)，無水乙醇(分析純)均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物(Poloxamer 188，分析純)，南京威爾藥業(yè)集團(tuán)；茶多酚(TP，tea polyphenol，99%)，上海麥克林生化科技有限公司; 2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(DPPH，99%)，羅恩試劑；PBS緩沖液(0.01mol/L)、氯化三苯基四氮唑(TTC)，飛凈(Phygene)生物科技有限公司；LB肉湯培養(yǎng)基，上海博微生物科技有限公司；MH肉湯培養(yǎng)基，杭州微生物試劑有限公司；大腸埃希氏菌(ATCC25922)及金黃色葡萄球菌(CMCC(B)26003)，來自于上海保藏生物技術(shù)中心；超純水，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 制 備

1.2.1 介孔納米氧化鋅載體的制備

(1)第一步，前軀體的制備：參考熊光偉等[18]的方法并做改進(jìn)：將1.10 g Zn(NO3)2·6H2O與6.01 g CO(NH2)2溶于100 mL超純水中，攪拌下加入0.36 g Poloxamer 188模板劑和0.36 g蔗糖模板劑溶解，10 min后緩慢滴加CH2COOH直至溶液pH=4～5，繼續(xù)攪拌2 h后將溶液轉(zhuǎn)移到水熱反應(yīng)釜中封閉并于90 ℃恒溫24 h。反應(yīng)完成后自然冷卻至室溫，取出混合液，離心得到白色沉淀，使用50%乙醇水溶液洗滌沉淀4次，60 ℃烘干24 h，隨后使用索氏提取器，以無水乙醇為提取劑，浸提12 h洗去殘余模板劑，80 ℃干燥12 h得到前驅(qū)體堿式碳酸鋅Zn2(OH)2CO3,記為Pre-N。第二步，納米介孔氧化鋅的轉(zhuǎn)化：參照時(shí)文中等[19]，將前驅(qū)體放入坩堝，在馬弗爐中以270 ℃焙燒90 min，得到的介孔納米氧化鋅，產(chǎn)物記為N-ZnO。

(2)僅改變鋅源物質(zhì)，在(1)的步驟中將Zn(NO3)2·6H2O替換(CH2COO)2Zn·2H2O，其余條件和步驟均不變，得到的前驅(qū)體記為Pre-C，介孔納米氧化鋅產(chǎn)物記為C-ZnO。

(3)不使用模板劑，其余步驟與(1)中N-ZnO制備過程一致，得到的產(chǎn)物記為ZnO。

1.2.2 茶多酚-介孔納米氧化鋅控釋抗氧抗菌配合體的制備

選擇N-ZnO作為載體進(jìn)行搭載，將6 g茶多酚(TP)溶于60 mL超純水中得到TP溶液，同時(shí)將1 g N-ZnO投入40 mL超純水中超聲分散1 min得到N-ZnO分散液，在攪拌下將TP溶液勻速倒入N-ZnO分散液中，隨后將混合液抽真空攪拌30 min，離心分離沉淀和上清液，使用超純水洗滌沉淀5次，分別收集沉淀及洗脫液，將固體沉淀在40 ℃下真空干燥24 h得到配合體T-ZnO；抽真空反應(yīng)及干燥全程均處于黑暗無氧環(huán)境下，避免茶多酚及配合體被氧化損失；將完全收集的離心上清液和洗脫液混勻?yàn)榛旌舷疵撘海芊庹诠獗４娲谩?/p>

1.3 結(jié)構(gòu)表征

1.3.1 TEM測試

使用透射電子顯微鏡(賽默飛世爾科技，F(xiàn)EI Talos F200s)觀測，能譜型號(hào)：FEI Super-X EDS Detector，獲取所制備介孔納米載體微觀結(jié)構(gòu)，直觀獲得孔道、孔形信息，樣品以乙醇分散，超聲分散3 min；

1.3.2 SEM測試

使用掃描電子顯微鏡(日本日立公司，S4800)觀測，獲取前驅(qū)體、介孔納米載體和配合體的表面特征，樣品在檢測前進(jìn)行噴金處理。

1.3.3 XRD測試

使用X射線衍射儀(德國布魯克科技有限公司，Bruker D8 Advance)掃描確認(rèn)前驅(qū)體與介孔納米載體的晶型結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)化情況。角度范圍為5°<2θ<90°，掃描速率5°/min，銅靶，波長0.15406 nm，電壓40 kV，電流40 mA;

1.3.4 比表面積和孔徑測試

使用全自動(dòng)比表面及孔隙度分析儀(美國康塔儀器公司，AUTOSORB-IQ2)測量分析介孔納米載體孔結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，包括比表面積、孔徑分布、孔容。分析前，樣品在200 ℃下真空脫氣20 h；樣品比表面積由Brunauer-Emmett-Teller(BET)模型計(jì)算獲得；孔徑分布由Barrett-Joyner-Halenda(BJH)模型計(jì)算獲得；孔容由t-plot方法計(jì)算獲得。

1.3.5 TGA測試

使用同步熱分析儀(德國耐馳儀器制造有限公司，STA 449C)測定獲得前驅(qū)體、納米介孔載體和配合體的熱重曲線，分析熱性能。測試范圍為35～800 ℃，升溫速率為10 ℃/min。

1.3.6 紅外光譜測試

使用傅立葉變換紅外光譜儀(德國布魯克科技有限公司，Alpha-T)掃描分析茶多酚及介孔納米氧化鋅載體配合前后的化學(xué)結(jié)構(gòu)變化。

1.4 性能測試

1.4.1 配合體中茶多酚的搭載量測定

搭載量的測定使用兩種方法。

(1)洗脫液吸光度法：精密稱取TP標(biāo)準(zhǔn)對照品100 mg，加超純水定容至1000 mL制備成標(biāo)準(zhǔn)貯備液。使用貯備液和超純水稀釋制成系列濃度梯度的對照品溶液，濃度梯度取TP濃度為0.00，5.00，10.00，20.00，40.00，60.00，80.00，100.00 mg/L，在274 nm處，以超純水為空白對照，使用紫外可見分光光度計(jì)(日本島津株式會(huì)社，UV-1800)測定各濃度溶液的吸光度(A)。以A對茶多酚對照品溶液的質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得線性標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。將1.2.2中的混合洗脫液適當(dāng)稀釋，并在274 nm處測定稀釋后洗脫液的吸光度，并根據(jù)線性標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算洗脫液中茶多酚含量，并計(jì)算得到配合體中TP的搭載量，計(jì)算公式如式(1)：

(1)

(2)配合體ICP-OES測試法：使用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀ICP-OES (安捷倫科技有限公司，Agilent 720ES)對干燥的配合體進(jìn)行Zn元素含量測定，并根據(jù)分子量推算出配合體中TP的搭載量。計(jì)算公式如式(2)：

(2)

1.4.2 配合體中茶多酚的釋放測試

預(yù)先測定并繪制計(jì)算TP在PBS緩沖液(pH值為4.0，5.5，7.4)中的吸光度線性標(biāo)準(zhǔn)曲線和方程，稱取3份20 mg的T-ZnO，分別使用3 mL PBS緩沖液(pH值為4.0，5.5，7.4)充分分散，移入20 kDa的透析膜中，夾緊封口，置入裝有200 mL對應(yīng)PBS緩沖液(pH值為4.0，5.5，7.4)的帶蓋棕瓶中，160 r/min避光懸浮旋轉(zhuǎn)透析100 h，按照一定時(shí)間間隔定期吸取1 mL透析液，并補(bǔ)充1 mL對應(yīng)pH值的PBS緩沖液，使用紫外可見分光光度計(jì)在274 nm處測定樣液吸光度，并計(jì)算的茶多酚含量，繪制釋放曲線。重復(fù)試驗(yàn)3次取平均值。

1.4.3 配合體DPPH自由基清除抗氧化性能

參考都津銘的方法并做改動(dòng)[20]，稱取39.432 mg DPPH，使用95%的乙醇定容至1000 mL，配置成0.1 mmol/L的溶液。分別稱取2，4，6，8和10 mg的TP和T-ZnO，置入盛有10 mL，0.1 mmg/mL的DPPH 95%乙醇溶液的棕色瓶中密封，充分震蕩混合為懸濁液,放入震蕩培養(yǎng)箱23 ℃，150 r/min條件下避光震蕩反應(yīng),0.5和24 h后分別取出對應(yīng)樣品,濾除沉淀物，使用紫外可見分光光度計(jì)測定反應(yīng)后的各樣品濾液在517 nm處吸光度Ai；取相同量的TP或T-ZnO，放入10mL95%乙醇，相同條件震蕩0.5和24 h后，測定517 nm處各樣品背景吸光度Aj；取10 mL DPPH 95%乙醇溶液，相同條件下震蕩0.5和24 h后，測定517 nm處吸光度值A(chǔ)0，重復(fù)試驗(yàn)3次取平均值，DPPH自由基的清除率由式(3)計(jì)算：

(3)

1.4.4 配合體的抗菌性能測試

(1)采用改進(jìn)的牛津杯雙層平板法[21]定性測試配合體的抑菌性能：首先分別稱取40 mg的TP、N-ZnO、T-ZnO加入1 mL滅菌超純水中，超聲分散15 min制備為抑菌溶/懸液備用。取少量新鮮的三代大腸埃希氏菌菌種，接種至LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，150 r/min震蕩培養(yǎng)8h進(jìn)行細(xì)菌增殖。采用麥?zhǔn)媳葷岱ǎ瑢⒕簼舛日{(diào)整至約108CFU/mL。按照1/100比例將調(diào)整好的菌液注入已冷卻至45 ℃的MH固體培養(yǎng)基(瓊脂含量1%)中，使培養(yǎng)基內(nèi)菌體濃度約106CFU/mL，混勻備用。使用冷卻至45 ℃的純凈MH固體培養(yǎng)基(瓊脂含量2%)傾注平板，每板5mL，水平靜置凝固作為第一層。將牛津杯放置第一層培養(yǎng)基中央，隨后向平板內(nèi)傾注含有菌體的MH培養(yǎng)基(瓊脂含量1%)約20 mL，水平靜置凝固，拔除牛津杯留下直徑8 mm孔，作為第二層。吸取200 μL已配置好的溶/懸液注入孔內(nèi)，4 ℃下預(yù)擴(kuò)散2 h，隨后放入培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)16 h，測定各樣品抑菌圈直徑，每個(gè)試樣測量3次，取平均值。以相同方法測定各樣品對金黃色葡萄球菌的抑菌圈。

(2)采用微量二倍稀釋法測定配合體的最小抑菌濃度(MIC):參考劉子訓(xùn)[22]的方法并做修改，首先分別稱取2 048 mg的TP、N-ZnO、T-ZnO加入100 mL無菌超純水中，超聲分散15 min制備為抑菌溶/懸液備用，在無菌96孔板每孔內(nèi)先加入滅菌的2倍MH肉湯培養(yǎng)基100 μL,隨后在每排第一孔加入100 μL抑菌溶/懸液。隨后進(jìn)行二倍稀釋，即第一孔中加入溶/懸液后用移液槍吹打數(shù)次使之與肉湯充分混勻，然后吸取100 μL加入第二孔再充分吹打混勻，重復(fù)操作至最后一孔，混勻后吸出100 μL棄去。再向每孔中加入預(yù)先稀釋好的菌液100 μL，使孔內(nèi)菌體濃度約106cfu/mL。最終每排溶/懸液濃度依次為5 120，2 560，1 280，640，320，160，80，40，20，10，5，2.5 μg/mL。每塊板上倒數(shù)第二排作為陰性對照(僅加肉湯培養(yǎng)基不加菌液),倒數(shù)第一排為陽性對照(加菌液不加溶/懸液)。96孔板放入震蕩培養(yǎng)箱，37 ℃，150 r/min培養(yǎng)16 h后取出，向每孔內(nèi)加入10 μL 滅菌的5%氯化三苯基四氮唑(TTC)水溶液，再放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，隨后觀察孔內(nèi)顏色變化，從右至左第一個(gè)沒有變紅的孔所對應(yīng)的濃度即為該樣品的MIC值。

2 結(jié)果與討論

2.1 介孔納米氧化鋅載體微觀結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 前驅(qū)體及介孔納米氧化鋅載體晶型分析

圖1(a)為前驅(qū)體Pre-N和Pre-C的XRD圖譜。前驅(qū)體Pre-N與標(biāo)準(zhǔn)卡片JCPDS 00-19-1458主要峰值吻合，其主要成分為單斜晶系Zn5(CO3)2(OH)6，其余雜峰可能為反應(yīng)過程中殘留的模板劑與Zn2+離子生產(chǎn)的不溶性有機(jī)鋅鹽。前驅(qū)體Pre-C與之類似，但主要峰值強(qiáng)度與JCPDS 00-19-1458有一定差異，說明以硝酸鋅為碳源制備的前驅(qū)體Pre-N純凈度和晶型完整度要優(yōu)于以醋酸鋅為碳源制備的前驅(qū)體Pre-C。

圖1(b)為經(jīng)熱轉(zhuǎn)化后的介孔納米氧化鋅N-ZnO和C-ZnO的XRD圖譜。N-ZnO曲線上在36.62°、34.34°、36.48°、47.38°、56.56°、62.84°、66.30°、67.84°、69.02°、72.42°、76.95°、81.44°、89.58°觀察到(100)、(002)、(101)、(102)、(110)、(103)、(200)、(112)、(201)、(204)、(202)、(104)、(203)晶體面，無多余雜峰，曲線與JCPDS 00-36-1451 ZnO一致，說明N-ZnO具有六方晶系纖鋅礦結(jié)構(gòu)，且基本無雜質(zhì)。C-ZnO具有相同晶面特征峰，說明C-ZnO主要成分也是六方晶系纖鋅礦，但仍保留少量雜峰，說明產(chǎn)物N-ZnO純凈度更高。

圖1 前驅(qū)體(a)及介孔納米氧化鋅載體(b)的XRD衍射圖

2.1.2 介孔納米氧化鋅載體形貌及結(jié)構(gòu)分析

圖2為制備的介孔納米氧化鋅載體N-ZnO及C-ZnO的TEM圖，二者具有相似特征，整體均呈現(xiàn)帶孔厚片狀，且觀察到大量介孔結(jié)構(gòu)。圖2(a)和(b)顯示介孔多數(shù)為類圓形，且孔徑較為近似，圖2(c)和(d)孔型及孔徑較不規(guī)則，部分呈狹型孔，N-ZnO孔道規(guī)則度優(yōu)于C-ZnO。

圖2 介孔納米氧化鋅載體N-ZnO(a)、(b)及C-ZnO(c)、(d)的TEM圖

圖3(a)為N-ZnO、C-ZnO及ZnO的氮?dú)馕?脫附曲線。根據(jù)國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPAC)的分類，N-ZnO具有Langmuir Ⅳ型曲線特點(diǎn)，并存在H3型回滯環(huán)，表明N-ZnO具有介孔結(jié)構(gòu)，且有較大孔容積[23-24]。0

圖3(b)為N-ZnO、C-ZnO及ZnO的孔徑分布曲線?？梢钥闯?，使用模板劑后產(chǎn)物N-ZnO得到的介孔孔徑分布區(qū)間較為集中，C-ZnO孔徑分布集中程度略低于N-ZnO，但具有更大的平均孔徑。而未使用模板劑的產(chǎn)物ZnO，孔徑分布較分散，孔容和比表面積也相對較小。分別使用BET模型、BJH模型和t-plot方法計(jì)算，得到N-ZnO的比表面積80.614 m2/g,平均孔徑為7.426 nm，孔容為0.424 cm3/g，C-ZnO的比表面積為68.854 m2/g,平均孔徑為8.155 nm，孔容為0.416 cm3/g，不使用模板劑的ZnO比表面積為49.056 m2/g，平均孔徑為13.151 nm，孔容為0.255 cm3/g，較大的比表面積與孔容，可以提供更多的表面結(jié)合位點(diǎn)，有利于提高后續(xù)活性成分的搭載量。

圖3 N-ZnO、C-ZnO及ZnO的氮?dú)馕?脫附曲線(a)及孔徑分布曲線(b)

2.2 配合體的結(jié)構(gòu)及基本性能分析

2.2.1 形貌及結(jié)構(gòu)分析

選擇比表面積較高的介孔納米氧化鋅載體N-ZnO進(jìn)行搭載實(shí)驗(yàn)，圖4為前驅(qū)體Pre-N、介孔納米氧化鋅載體N-ZnO及茶多酚-介孔納米氧化鋅配合體T-ZnO的SEM圖。由圖4(a)看出，前驅(qū)體Pre-N由大量二維厚片狀分散體堆疊形成三維花瓣?duì)顜缀误w。圖4(b)為經(jīng)熱處理后的產(chǎn)物N-ZnO，前驅(qū)體原先的花瓣?duì)罴蠣顟B(tài)被破壞，但基本保留了二維厚片形狀，且經(jīng)由燒蝕后可觀察到明顯的介孔結(jié)構(gòu)。圖4(c)和(d)為茶多酚-介孔納米氧化鋅配合體T-ZnO，經(jīng)過負(fù)載茶多酚后，單片的二維介孔載體被茶多酚完全包裹，形成較為規(guī)整的球體形狀。使用ImageJ軟件對圖4(d)視野內(nèi)可見的球體進(jìn)行粒徑測量統(tǒng)計(jì)。最大粒徑為0.59 μm，最小粒徑為0.19 μm，平均粒徑為0.42 μm。

圖4 前驅(qū)體Pre-N (a)、介孔納米氧化鋅載體N-ZnO (b)及茶多酚-介孔納米氧化鋅配合體T-ZnO (c)、(d) 的SEM圖

2.2.2 介孔納米氧化鋅載體及配合體的紅外光譜分析

圖5為N-ZnO、TP和T-ZnO傅立葉紅外光譜圖。N-ZnO曲線中3 422 cm-1處為表面羥基伸縮峰，1 619 cm-1峰可能是結(jié)合水中的H—O—H的彎曲振動(dòng)，415 cm-1之后出現(xiàn)一個(gè)較大峰，是Zn—O鍵伸縮振動(dòng)峰，證明產(chǎn)物N-ZnO是纖鋅礦氧化鋅[26]。

圖5 介孔納米氧化鋅載體N-ZnO、茶多酚TP及茶多酚-介孔納米氧化鋅配合體T-ZnO的紅外光譜圖

TP的曲線中，3 413 cm-1為—OH伸縮振動(dòng)峰，1 690 cm-1處為酯羰基—CO伸縮振動(dòng)峰，1 614，1 518，1 535，1 451 和1 342 cm-1處是苯環(huán)骨架振動(dòng)吸收峰，1 236和1 032 cm-1處分別為芳醚C—O—C的對稱和反稱伸縮振動(dòng)峰，1 142 cm-1處為苯環(huán)C—H的面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰，821，765，735 cm-1處分別為苯環(huán)—CH官能團(tuán)的三取代、間雙取代、鄰雙取代面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰。

配合體T-ZnO中的羥基吸收峰輕微藍(lán)移至3 414，1 365 cm-1處可能是Zn2+及亞甲基的倍頻吸收峰[27]。EGCG等連苯三酚類衍生物和過渡金屬離子發(fā)生配位反應(yīng)時(shí)，配位主要發(fā)生在連苯三酚類衍生物分子兩個(gè)相鄰的酚羥基上，其中連苯三酚類衍生物的第三個(gè)酚羥基不參與配位，但可促進(jìn)另外兩個(gè)酚羥基的離解從而使配位更穩(wěn)定[28]，故TP的735 cm-1吸收峰在T-ZnO中消失，可能是Zn—O配位鍵的形成或振動(dòng)導(dǎo)致苯環(huán)的鄰雙取代位的面內(nèi)彎曲振動(dòng)受限，同時(shí)821 cm-1峰藍(lán)移至827 cm-1，說明三取代位也受到Zn2+的配合影響導(dǎo)致彎曲受限。1 690 cm-1峰減弱，這可能茶多酚中的酯羰基C=O與Zn2+配合所致[27]，這與zhang等[29]的研究現(xiàn)象一致。由此可以推測，N-ZnO載體表面Zn2+與茶多酚發(fā)生了配位反應(yīng)，且可能存在與羰基和羥基兩種基團(tuán)的配合方式。

2.2.3 前驅(qū)體、介孔納米氧化鋅載體和配合體的熱性能分析

對Pre-N、N-ZnO、TP和T-ZnO分別進(jìn)行熱重分析，由圖6(a)、(b)可以發(fā)現(xiàn)，Pre-N在250 ℃開始快速分解，在262 ℃達(dá)到最大分解速率拐點(diǎn)，在272 ℃達(dá)到終止點(diǎn)，前驅(qū)體Pre-N完全轉(zhuǎn)變?yōu)榧{米介孔氧化鋅載體N-ZnO。證明熱處理溫度270 ℃可以保證前驅(qū)體的完全轉(zhuǎn)化，同時(shí)介孔結(jié)構(gòu)不被過分破壞。N-ZnO升溫全程均較為穩(wěn)定，僅在30～100 ℃之間有少量失重，這可能是因?yàn)槠鋬?nèi)部吸附了少量水分。TP和T-ZnO的失重分為兩個(gè)階段，第一階段在30 ℃開始即有緩慢的失重，這可能是茶多酚內(nèi)部游離水和結(jié)合水的蒸發(fā)脫除所致[30]，隨溫度提升至210 ℃，TP出現(xiàn)一個(gè)較快的分解失重過程，并在235 ℃時(shí)達(dá)到最大分解速率，隨后分解速率減緩并持續(xù)至800 ℃。T-ZnO與TP具有相似的失水過程，但第一階段失重率明顯大于TP，可能是因?yàn)榕浜象w制備過程中吸收了更多的水分。210～800 ℃的失重可能為TP及T-ZnO中TP成分解為H2O、CO2、CO的過程[27]，二者在到達(dá)800 ℃時(shí)，TP失重87.4%，T-ZnO失重55.6%，均未完全分解，但配合體T-ZnO第二階段的總失重率明顯低于TP，說明茶多酚TP和載體N-ZnO形成了穩(wěn)定的配合體T-ZnO,提高了TP的熱穩(wěn)定性。

圖6 Pre-N、N-ZnO、TP、T-ZnO的TGA(a)和DTG(b)曲線

2.2.4 配合體中茶多酚的搭載量分析

洗脫液吸光度法：圖7為茶多酚在去離子水中溶解后的線性標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0.02621X-0.00177(R2=0.99998)，分別測量3個(gè)不同稀釋梯度的溶液吸光度，并計(jì)算溶液中總的游離TP質(zhì)量，最終結(jié)果取平均值?；旌舷疵撘褐杏坞xTP為1.18 g，故配合體中TP的搭載量為4.82 g，最終計(jì)算搭載量約為76.28%.

圖7 茶多酚-去離子水溶液的吸光度/濃度線性標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

配合體ICP-OES測試法：使用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES)測定配合體中Zn元素的占比，可知Zn元素占配合體中的比率約為20.52%，換算可得到ZnO約占配合體總質(zhì)量的25.54%，即TP搭載量約74.46%，與洗脫液吸光度法測試結(jié)果接近。

2.3 配合體對茶多酚的控釋性能分析

圖8為T-ZnO在不同pH值的PBS緩沖液中對茶多酚的釋放特性擬合曲線。T-ZnO中茶多酚總含量按照2.2.4中ICP-OES測試法得到的TP搭載量74.46%進(jìn)行計(jì)算，釋放率的計(jì)算依據(jù)式(4)：

圖8 不同pH條件下配合體T-ZnO對茶多酚的釋放曲線

(4)

可知，pH值為4.0和5.5條件下，茶多酚的初期釋放速度明顯快于pH=7.4條件，釋放4 h時(shí)，pH=4.0條件下茶多酚釋放率達(dá)到50.72%，pH=5.5條件下釋放率已達(dá)到57.33%，而pH=7.4條件下僅釋放38.33%，釋放24h時(shí)，pH=4.0條件下已釋放79.13%，pH=5.5條件下已經(jīng)釋放90.74%，均接近最大釋放率，而pH=7.4僅釋放72.89%，隨后仍有一定的釋放量?？梢姴煌琾H條件可以有效調(diào)控配合體中茶多酚的釋放速率。pH=5.5和7.4條件二者最終釋放率均為90%左右，而pH=4.0條件下最終釋放率僅80%，可能是因?yàn)槎喾宇惢衔锖写罅糠恿u基，可游離出H+使溶液顯示酸性[28]，因而過低的pH值使得緩沖液體系中H+較多，抑制了配合體體系中茶多酚的向外游離。

2.4 配合體DPPH自由基清除性能分析

DPPH自由基是一種人工合成的穩(wěn)定有機(jī)自由基，常用于評(píng)價(jià)化合物的抗氧化活性[31]。表1為TP、T-ZnO在0.5和24 h時(shí)對DPPH自由基清除率表。不同濃度條件下，TP對DPPH自由基均有較好的清除效果，清除率在91%～96%之間，證明茶多酚具有很強(qiáng)的抗氧化能力。T-ZnO在較低濃度時(shí)對DPPH自由基的初期清除率較低，隨反應(yīng)時(shí)間推移，清除率有較大提升。0.5 h時(shí) 2和4 mg/10mL濃度的清除率僅為63.41%和88.45%，而24h之后分別提升至94.79%和93.83%，較高濃度情況下，無論初期還是長期的清除率均較高，且高于TP組，10 mg/10mL條件下，0.5和24 h清除率最大可以達(dá)到96.16%和98.53%。說明T-Zno在較低濃度時(shí)具有延遲清除DPPH自由基的效果，可能與T-ZnO的控釋效應(yīng)有關(guān)，而在較高濃度下T-ZnO對DPPH自由基清除效果優(yōu)于TP。

表1 茶多酚TP及配合體T-ZnO的DPPH自由基清除率

2.5 配合體的抑菌性能分析

圖9是TP、N-ZnO及T-ZnO分別對大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈實(shí)圖。表2是對應(yīng)的抑菌圈直徑數(shù)據(jù)?？芍猅P、N-ZnO及T-ZnO對大腸埃希氏菌和金黃葡萄球菌均有一定的抑菌性能，N-ZnO及T-ZnO針對兩種菌都出現(xiàn)了內(nèi)外雙層抑菌圈，且內(nèi)圈透明度較高，外圈透明度相對較低，可能是因?yàn)镹-ZnO和T-ZnO抑菌成分從孔內(nèi)向外擴(kuò)散過程中，內(nèi)側(cè)濃度較高，細(xì)菌生長受抑制程度高，外緣濃度較低，細(xì)菌生長受到部分抑制，TP則沒有出現(xiàn)雙層抑菌圈。TP和N-ZnO對大腸埃希氏菌(屬革蘭氏陰性菌)的抑菌圈明顯小于對金黃葡萄球菌(屬革蘭氏陽性菌)，原因是這兩種細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)差異造成對抗菌劑的敏感性不同[32-33]。配合體T-ZnO結(jié)合了兩者特點(diǎn)，也具有相似特征，但整體抑菌能力仍弱于N-ZnO，可能是因?yàn)門-ZnO因吸附搭載大量茶多酚導(dǎo)致自身粒徑增大，與細(xì)菌的接觸面積減小，同時(shí)因未調(diào)整至適宜pH值導(dǎo)致配合體中TP不易釋放。

表2 TP、N-ZnO及T-ZnO對大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑

圖9 TP、N-ZnO及T-ZnO分別對大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈圖

表3為3種抗菌材料對大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(MIC)，氯化三苯四氮唑(TTC)作為細(xì)菌呼吸的氫受體加入培養(yǎng)基，被活菌攝取后，在脫氫酶作用下，無色的TTC會(huì)轉(zhuǎn)化為紅色的三苯甲腙(TF)，使活菌被染色。因此觀察混合培養(yǎng)基中顏色變化和TTC被還原程度即可間接衡量菌體活性[22, 34]。大腸埃希氏菌組，N-ZnO的MIC值為320 μg/mL，TP和T-ZnO均為1 280 μg/mL，金黃色葡萄球菌組，TP、N-ZnO和T-ZnO的MIC值分別為320，80和160 μg/mL。三者對于大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌均有明顯的抑菌效果，但對后者的抑菌能力優(yōu)于前者，這與抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。N-ZnO本身對大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌都具有優(yōu)異的抗菌性能，T-ZnO對大腸埃希氏菌的抑制能力與TP一致，對金黃色葡萄球菌的抑制能力則優(yōu)于TP。

表3 TP、N-ZnO及T-ZnO的最小抑菌濃度(MIC)

3 結(jié) 論

(1)采用兩種鋅源物分別制備了的介孔納米氧化鋅，通過XRD、TEM、氮?dú)馕矫摳綔y試等手段進(jìn)行表征，兩種產(chǎn)物均具有六方晶系纖鋅礦結(jié)構(gòu)。以硝酸鋅為鋅源的制備產(chǎn)物N-ZnO在結(jié)構(gòu)上優(yōu)于醋酸鋅為鋅源的制備產(chǎn)物C-ZnO，N-ZnO的比表面積80.614 m2/g,平均孔徑為7.426 nm，孔容為0.424 cm3/g，C-ZnO的比表面積68.854 m2/g,平均孔徑為8.155 nm，孔容為0.416 cm3/g。

(2)以N-ZnO為載體，成功制備了搭載茶多酚的控釋活性配合體T-ZnO，搭載量高達(dá)74.46%～76.28%，且具有明顯pH響應(yīng)控釋效果，弱酸性條件可以促進(jìn)配合體中茶多酚的釋放，pH=5.5條件下釋放最快，但強(qiáng)酸性會(huì)抑制茶多酚的釋放，pH=5.5和7.4條件下最大平衡釋放量達(dá)到90%，pH=4.0條件下最大平衡釋放量僅80%

(3)T-ZnO具有顯著的DPPH自由基清除效果，在較低濃度下，0.5 h清除率相對低于茶多酚，但24 h后清除率優(yōu)于茶多酚，具延遲清除效果。

(4)制備的介孔納米氧化鋅載體N-ZnO和配合體T-ZnO對大腸埃希氏菌和金黃葡萄球菌均具有明顯抑菌效果，但在未控制pH值的條件下N-ZnO的抗菌性能更優(yōu)異。如對T-ZnO進(jìn)行pH調(diào)控，則有望進(jìn)一步提高其抗菌效果。