劉惠芬，劉文光，王安皆，王照紅，李云芝

(山東省蠶業(yè)研究所，山東 煙臺(tái) 264002)

我國(guó)是世界上最大的蠶繭、蠶絲生產(chǎn)及出口國(guó)，繭絲產(chǎn)量和出口量分別占世界總額的70%和80%[1-2]。2019年我國(guó)生產(chǎn)的蠶繭量為72.08萬(wàn)t，農(nóng)民收入292.35億元，真絲綢商品出口22.31億美元[3]。以家蠶為基礎(chǔ)的蠶絲業(yè)是我國(guó)許多地區(qū)農(nóng)民增收的支柱型產(chǎn)業(yè)，然而致病病毒、真菌和細(xì)菌等微生物的危害直接導(dǎo)致10%左右的蠶業(yè)生產(chǎn)損失[4-5]。目前針對(duì)家蠶病原菌，生產(chǎn)上消毒多用氯制劑和醛制劑，2種藥物對(duì)環(huán)境影響較大，對(duì)人體也存在各種危害[6-7]。篩選消毒效果好、用量少、對(duì)環(huán)境和人體安全的新型蠶用消毒藥劑，是建立規(guī)?；B(yǎng)蠶安全模式的關(guān)鍵技術(shù)措施之一[8]。

聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽(polyhexamethylene biguanide hydrochloride，PHMB)是一種環(huán)保型高分子聚合物殺菌消毒劑，為無(wú)色、無(wú)嗅、不燃、不爆的液體，具有殺菌譜廣、有效濃度低、作用速度快、性質(zhì)穩(wěn)定、易溶于水等優(yōu)良性能，可在常溫下使用，長(zhǎng)期抑菌，無(wú)腐蝕性[9-11]，殺菌過(guò)程中不發(fā)生強(qiáng)氧化反應(yīng)，通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生沉淀作用及細(xì)胞內(nèi)磷的數(shù)量上升，阻礙細(xì)胞壁與核酸的合成[12-13]，其對(duì)蝙蝠蛾幼蟲(chóng)的經(jīng)口急性毒性，半數(shù)致死量大于10 g·L-1，在正常消毒范圍內(nèi)基本沒(méi)有影響，屬于實(shí)際無(wú)毒級(jí)消毒液[14]。聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽是一種環(huán)保型殺菌消毒劑，具有高效的殺菌效果[15-17]，目前未見(jiàn)其用于家蠶病原體消毒，因此，本研究將探討聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復(fù)配藥液對(duì)家蠶主要病原體(病毒、細(xì)菌、真菌)的消毒效果及其對(duì)蠶繭質(zhì)量的影響，為開(kāi)發(fā)新型綠色高效蠶用消毒劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽為山東優(yōu)索化工科技有限公司分裝的佳和晟世樣品，檔案編號(hào)：079410002090；碳酸鈉(Na2CO3)購(gòu)自天津市標(biāo)準(zhǔn)科技有限公司。

供試家蠶品種為菁松×皓月，由山東廣通蠶種集團(tuán)有限公司提供。蠶卵正常環(huán)境下催青孵化，幼蟲(chóng)在24～28 ℃、相對(duì)濕度70%左右的條件下桑葉飼育。

供試病原由本所家蠶病理實(shí)驗(yàn)室保存。家蠶核型多角體病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovirus，BmNPV)、質(zhì)型多角體病毒(Bombyxmoricytoplasmic polyhedrosis viruses，BmCPV)以家蠶繼代制取，精制后配成濃度為5.0×107mL-1的懸液，放置4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩＜倚Q病原白僵菌(Beauveriabassiana)自5齡幼蟲(chóng)接種白僵菌發(fā)病死亡的蠶體中分離獲??；黃曲霉(Aspergillusflavus)自5齡幼蟲(chóng)接種黃曲霉菌發(fā)病死亡的蠶體中分離獲取，對(duì)以上2種病原真菌取分生孢子加適量吐溫-80使其懸浮于滅菌蒸餾水中，經(jīng)2層紗布過(guò)濾，分別稀釋至1.0×108mL-1、5.0×107mL-1于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。取蘇蕓金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)、沙雷鐵氏菌(又稱靈菌，Serratiamarcescens)的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，用少量滅菌水及少量吐溫-80洗下，分別稀釋至1×108mL-1置于冰箱中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

試驗(yàn)于2020、2021年在山東省蠶業(yè)研究所家蠶病理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 對(duì)家蠶多角體病毒的消毒試驗(yàn)

將聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽配制成質(zhì)量濃度為400、200、100、50 mg·L-1的復(fù)配藥液，各取200 μL分別與5.0×107mL-1的BmNPV、BmCPV多角體病毒懸液200 μL混合，混合后聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽濃度分別為200、100、50、25 mg·L-1，碳酸鈉濃度為5.0 g·L-1，病毒濃度為2.5×107mL-1，30 min后將混合液涂于2 cm×2 cm桑葉正反面，給蟻蠶添食24 h，BmNPV處理組飼養(yǎng)2個(gè)齡期、BmCPV處理組飼養(yǎng)3個(gè)齡期，調(diào)查死亡率。以自來(lái)水替代藥液處理為毒對(duì)照，并設(shè)空白對(duì)照。

1.3 對(duì)家蠶病原白僵菌、黃曲霉菌的消毒試驗(yàn)

將聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽配制成質(zhì)量濃度為800、400、200、100、50 mg·L-1的復(fù)配藥液，各取200 μL，分別與1.0×108、5.0×107mL-1的白僵菌、黃曲霉菌孢子懸液200 μL混合，混合后聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽濃度分別為400、200、100、50、25 mg·L-1，碳酸鈉濃度為5.0 g·L-1，白僵菌、黃曲霉孢子懸液濃度分別為5.0×107、2.5×107mL-1，30 min后將混合液涂于蠶體(白僵菌涂于2齡起蠶蠶體、黃曲霉菌涂于蟻蠶蠶體)，保濕飼育24 h后改正常飼育，飼養(yǎng)2個(gè)齡期調(diào)查死亡率。以自來(lái)水替代藥液處理為毒對(duì)照，并設(shè)空白對(duì)照。

1.4 對(duì)家蠶病原細(xì)菌的消毒試驗(yàn)

將配制的1.0×108mL-1蘇蕓金芽孢桿菌懸液與質(zhì)量濃度為4 000 mg·L-1的聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復(fù)配藥液等量混合，混合后藥物濃度為聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽2 000 mg·L-1、碳酸鈉5.0 g·L-1；沙雷鐵氏菌懸液分別與質(zhì)量濃度為800、400、200、100、50 mg·L-1的聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復(fù)配溶液等量混合，混合后藥物濃度分別為聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽400、200、100、50、25 mg·L-1，碳酸鈉5.0 g·L-1，混合30 min后，用處理的病原菌菌懸液對(duì)5齡起蠶進(jìn)行皮下穿刺接種，飼養(yǎng)24 h，調(diào)查發(fā)病率。另設(shè)皮下穿刺未處理菌懸液作毒對(duì)照和不接菌穿刺作空白對(duì)照。

1.5 藥液的穩(wěn)定性試驗(yàn)

不同時(shí)間(2、1、0 d)配制含聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽400、200、100、50 mg·L-1的復(fù)配藥液(均含碳酸鈉10.0 g·L-1)，將此藥液敞口放置于室內(nèi)，同一時(shí)間與5.0×107mL-1的BmNPV、BmCPV等量混合進(jìn)行消毒，30 min后將混合液涂于2 cm×2 cm桑葉正反面，給蟻蠶添食24 h，BmNPV處理組飼養(yǎng)2個(gè)齡期、BmCPV處理組飼養(yǎng)3個(gè)齡期調(diào)查死亡率。以自來(lái)水替代藥液處理為毒對(duì)照，并設(shè)空白對(duì)照。

1.6 對(duì)繭質(zhì)影響試驗(yàn)

配制質(zhì)量濃度為200.0、100.0 mg·L-1的聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽消毒液(均含5.0 g·L-1碳酸鈉)，4齡1、3 d，5齡1、3、5、7 d添食24 h藥液，其余時(shí)間飼喂普通桑葉，空白對(duì)照組用自來(lái)水代替消毒液，上蔟后10 d采繭。每區(qū)60頭家蠶，每個(gè)處理重復(fù)3區(qū)，在24～25 ℃條件下飼養(yǎng)。調(diào)查各區(qū)全繭量、繭層量及繭層率等。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復(fù)配藥液對(duì)家蠶病毒的消毒效果

不同濃度聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復(fù)配藥液對(duì)家蠶病毒的消毒效果表明，50 mg·L-1的聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽藥液對(duì)BmNPV、BmCPV處理組家蠶死亡率分別為12%和4%，100 mg·L-1及以上質(zhì)量濃度的聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽藥液對(duì)BmNPV、BmCPV處理組家蠶死亡率均為0(表1)，說(shuō)明含有100 mg·L-1及以上質(zhì)量濃度的聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復(fù)配藥液對(duì)家蠶BmNPV、BmCPV 2種病毒具有好的消毒效果。

表1 聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復(fù)配藥液對(duì)家蠶病毒的消毒效果

2.2 聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復(fù)配藥液對(duì)家蠶病原真菌的消毒效果

200 mg·L-1及以上質(zhì)量濃度的聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽藥液對(duì)家蠶白僵菌、黃曲霉菌處理后家蠶死亡率為0(表2)，結(jié)果表明聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽藥液對(duì)家蠶白僵菌、曲霉菌2種真菌均具有良好的消毒效果。

表2 聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復(fù)配藥液對(duì)家蠶病原真菌的消毒效果

2.3 聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復(fù)配藥液對(duì)家蠶病原細(xì)菌的消毒效果

從表3中可以看出，2 000 mg·L-1聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復(fù)配藥液處理蘇蕓金芽孢桿菌30 min無(wú)消毒效果。用400、200 mg·L-1的聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復(fù)配藥液處理沙雷鐵氏菌30 min，皮下穿刺的家蠶死亡率為0，消毒效果較好。

2.4 聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復(fù)配藥液的穩(wěn)定性

將配制2、1、0 d的聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復(fù)配藥液同一時(shí)間分別與BmNPV、BmCPV等量混合進(jìn)行消毒，30 min后將混合液涂于桑葉飼蠶，結(jié)果表明,復(fù)配藥液的穩(wěn)定性較好(表4)，生產(chǎn)上配制100 mg·L-1及以上質(zhì)量濃度的聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復(fù)配藥液可以2 d使用。

2.5 聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復(fù)配藥液對(duì)繭質(zhì)的影響

處理家蠶后調(diào)查單粒重、繭層量、繭層率等指標(biāo)。結(jié)果顯示，4～5齡飼喂200.0、100.0 mg·L-1的聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復(fù)配藥液對(duì)家蠶全繭量、繭層量、繭層率等指標(biāo)未見(jiàn)顯著影響(表5)。

表3 聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽溶液對(duì)家蠶病原細(xì)菌的消毒效果

表4 聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復(fù)配藥液的穩(wěn)定性消毒試驗(yàn)

表5 聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復(fù)配藥液對(duì)繭質(zhì)的影響

3 小結(jié)與討論

家蠶核型多角體病毒(BmNPV)和質(zhì)型多角體病毒(BmCPV)2種病毒多角體外殼均為一層堿溶性蛋白，需堿性環(huán)境才能破壞多角體外殼并釋放出病毒粒子[18-19]。前期我們研究發(fā)現(xiàn)含有碳酸鈉的復(fù)配藥液對(duì)家蠶病毒病消毒效果較好[8,20]，因此，本研究配制的聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復(fù)配藥液在與病原混合后均含5.0 g·L-1碳酸鈉。聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復(fù)配藥液100 mg·L-1對(duì)家蠶BmNPV、BmCPV的消毒效果達(dá)到100%，200 mg·L-1對(duì)家蠶白僵菌、黃曲霉菌的消毒效果為100%，200 mg·L-1對(duì)沙雷鐵氏菌消毒效果較好。4～5齡隔天添食24 h聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復(fù)配藥液對(duì)家蠶全繭量、繭層量、繭層率未見(jiàn)不良影響，因此，該復(fù)配藥液不僅可用于蠶室蠶具消毒，還可用于桑葉葉面消毒。由于外界環(huán)境影響因素較多，用于蠶室蠶具消毒時(shí)，濃度可適當(dāng)提高，僅用于桑葉葉面消毒時(shí)，200 mg·L-1的濃度即可。聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽復(fù)配藥液敞口存放2 d對(duì)家蠶多角體病毒仍具有較好的消毒效果，在蠶桑生產(chǎn)中可以放到第二天繼續(xù)使用，減少浪費(fèi)。

聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽屬于環(huán)保型高分子聚合物殺菌消毒劑[6]，配合碳酸鈉使用，對(duì)家蠶繭質(zhì)無(wú)不良影響，且對(duì)家蠶主要病原菌的有效消毒濃度可低至200 mg·L-1，用量很少，具有顯著的環(huán)保優(yōu)勢(shì)，對(duì)于蠶桑生產(chǎn)中的消毒環(huán)節(jié)具有重要的意義。